减肥作用实验方法

减肥作用的检验方法 　　1　动物移植性肿瘤试验 　　1.1　原理 　　使一批动物同时接种同样量的瘤细胞，并使其在体内生长，给予受试物一段时间后，观察瘤重或动物平均存活天数。 　　1.2　仪器和试剂 　　洁净工作台，无菌解剖器械，生理盐水等。 　　1.3　实验方法 　　1.3.1　实验动物 　　健康动物，雌雄均可，但同一批试验中受试物组与对照组性别必须相同，小鼠体重18－22g，大鼠体重50－70g，每组动物小鼠至少10只，大鼠至少8只，裸鼠可用5－10只。 　　1.3.2　肿瘤模型 　　1.3.2.1　小鼠肿瘤 　　肉瘤180(S－180)，肉瘤37(S－37)，艾氏癌腹水型(EAC)，艾氏癌实体型(EC)，肝癌实体型(Heps)，Harding－Passey黑色素瘤，未分化型胶质瘤G422等，可用昆明种小鼠。小鼠网织细胞白血病(L615)应用纯种615小鼠。小鼠淋巴细胞白血病L1210和P388应用纯种DBA/2或CDF小鼠或BDF小鼠。Lewis肺癌，黑色素瘤B16，小鼠乳腺癌(M5076)，应用C57BL/6纯种小鼠或BDF或CDF小鼠。 　　1.3.2.2　大鼠肿瘤 　　瓦克癌肉瘤(W256)，软骨肉瘤，吉田肉瘤腹水型，用Wistar，Sprague－Dawley或Fisher大白鼠。 　　1.3.2.3　人肿瘤细胞株 　　国际上常用的细胞株如人口腔癌细胞株KB细胞，宫颈癌细胞株HeLa细胞，卵巢癌细胞株A2780及国内建立的食管癌，肺癌及肝癌细胞株等皆可使用。 　　以上肿瘤模型任造一种。 　　1.3.3　剂量分组 　　受试物经口给予，连续30d，可在接种前开始给受试物，接种肿瘤后停用或继续给受试物，接种前给受试物天数由肿瘤接种成活率决定(观察是否比肿瘤模型对照组低) 　　设肿瘤模型对照组及3个受试物组，受试物剂量根据推荐的人体每公斤体重日摄入量，小鼠扩大10倍作为其中一个剂量，大鼠扩大5倍作为其中一个剂量。应设已知受试物的抑制肿瘤阳性对照组。 　　1.3.4　实验步骤　肿瘤的移植及结果观察 　　1.3.4.1　一般要求 　　需在无菌条件下进行。可在接种罩、超净工作台或无菌室内操作。动物处死后，用新吉尔灭(1∶1000)或碘酊、酒精消毒，对每个实体瘤应分别用灭菌的外科器械切取，对腹水瘤则应分别用灭菌的空针抽吸。瘤块污染常是接种失败的主要原因，应予注意在高温季节操作时，应注意降温，可在盛有瘤源的器皿周围放置冰块。 　　常用腋下部位皮下作为实体瘤接种部位；肌肉接种则用大腿肌肉；腹水型接种于腹腔。 　　1.3.4.2　瘤块的制备 　　接种用的瘤块应选择接种后7－10d、肿瘤生长旺盛且无溃破而动物健康较好的瘤源动物，颈椎脱臼，固定于蜡板上，用碘酊及酒精消毒操作部位皮肤(消毒面应尽可能大一些)。切开皮肤、选择生长良好无坏死或液化的瘤组织。在无菌平皿内，剪成2－3mm3的小块。平皿内放置少许消毒的生理盐水缓冲液或其它营养液，以保存瘤块。平皿应放置在冰块上。用无菌套管针抽吸或向套管针内塞进一小瘤块，接种于同种受体动物右前肢腋窝皮下(接种部位皮肤应先用碘酊、酒精消毒)。接种操作时间应尽可能的缩短，从一个瘤块所取的材料一般应在30min内接种完。 　　1.3.4.3　瘤细胞悬液的制备 　　如每次需要接种的动物数量较多时，可用瘤细胞悬液接种。具体方法为，在无菌操作下取瘤块，除去坏死组织，将数个瘤块混合，剪成小块，用玻璃组织匀浆器研磨，磨匀后放入无菌容器内，加生理盐水适量稀释成1∶3－1∶4的瘤细胞悬液。容器置冰块上，用空针抽吸，每次抽吸前应将细胞混匀。每个动物接种0.2mL。整个操作应在30min内完成。 　　停止给予受试物之次日(或停止给予受试物后1－5d)处死动物，先称体重，后解剖皮下瘤块，称重。如对照组小白鼠肿瘤平均重量小于1g或20%鼠的瘤重小于400mg，大白鼠肿瘤平均重量小于2g，表示肿瘤生长不良。在试验期间给受试物组鼠死亡超过20%，或平均体重(去瘤后)下降(自身对照)超过15%者，表示受试物的毒性反应。应当减少剂量重新试验。 　　1.3.4.4　腹水型肿瘤悬液的制备 　　1.3.4.4.1　抽取腹水 　　选择接种后7－10d健康较好的动物，颈椎脱臼，固定于蜡板上，腹部皮肤消毒后，剪开并剥去腹部皮肤，用空针穿过腹部肌肉，抽吸腹水，放入无菌容器内，置冰块保存。若用几只动物供瘤时，应将腹水混合。另取小量腹水，置于加有肝素的干试管内，作为观察细胞形态及细胞计数用。将空针中剩余的腹水，滴一滴于载玻片上，推片，瑞氏染色，镜下进行细胞分类计数，其中瘤细胞数应≥95%。 　　抽出之腹水应为乳白色之浓稠液体，若为黄色或有大量红细胞数应弃去。 　　1.3.4.4.2　细胞计数 　　取置于肝素管内的细胞。用生理盐水稀释10倍及100倍；取稀释液0.9mL，加台盼蓝(0.2%台盼蓝生理盐水液)0.1mL，混匀。用白细胞计数法计瘤细胞总数。同时计算受感染的死细胞数。因瘤细胞死后，细胞膜的通透性改变，细胞可被台盼蓝染成蓝色。 　　1.3.4.4.3　接种 　　腹水用无菌含葡萄糖的平衡盐水(如Hanks氏液、Gey氏液、洛氏液、Earle氏液等)稀释至适当的浓度，作腹腔注射，每鼠注入0.1－0.2mL。整个操作应在60min内完成。 　　一般在试验结束后次日称体重，逐日记录。对照组动物通常在2－3周内全部死光，个别存活时间太长者需剔除，但各组亦应相应地剔除一只。如试验期间对照组动物于7d内死亡≥20%，表示试验失败。如对照组内20%动物存活4周以上，实验亦应作废，受试物组观察时间一般为60d(生存超过此时限者，仍按60d计算)。分别记录对照组和受试物组的平均生存时间。 　　1.3.4.5　白血病株的接种腹水型白血病如L1210及P388的接种同腹水型肿瘤接种法。L615小白鼠白血病的接种则按下述方法进行。取L615白血病小白鼠(约接种后第6d)，颈椎脱臼，在无菌条件下，剪取脾脏一小块(约米粒大小)，放置玻璃组织匀浆器内，加少量无菌生理盐水，制成细胞悬液，并稀释至8－9mL，取一定量加0.2%台盼蓝缓冲液，计每毫升悬液的活细胞数(台盼蓝终浓度为0.02%)。根据活细胞数值适当稀释悬液将细胞数调整至4×107/mL，接种于小鼠皮下，每鼠接种细胞悬液0.1－0.2mL。 　　1.4　数据处理及结果判定 　　采用方差进行统计，肿瘤模型对照组与受试物组比较，实体瘤瘤重或腹水瘤及白血病生存时间，经统计学处理差异有显著性，并且经两批动物重复试验验证，则可判定该受试物该项试验阳性。 　　2　动物诱发性肿瘤试验 　　2.1　原理 　　动物通过化学诱导可形成与人体癌相类似的肿瘤模型，预先或同时给予受试物，观察其是否影响肿瘤发生率或瘤重或生存时间。 　　2.2　致癌物 　　黄曲霉毒素B1－初生小鼠肝癌 　　甲基胆蒽－小鼠肉瘤及皮肤癌 　　二甲基肼－大鼠结肠癌 　　二甲基苯蒽－大鼠乳腺癌 　　N－亚硝基甲基脲－大鼠乳腺癌 　　N－二甲基亚硝胺－大鼠肝、肺、肾脏肿瘤 　　二乙基亚硝胺－大鼠肝癌 　　甲基亚硝基胍－大鼠胃癌(只能灌胃) 　　亚硝基肌氨酸－大鼠食管/前胃癌 　　亚硝基哌嗪－大鼠鼻咽/鼻腔癌及其癌前期 　　2.3　实验方法 　　2.3.1　实验动物　一般选择大白鼠或小白鼠，雌雄均可，根据致癌物诱癌的发生率决定动物的数量。 　　2.3.2　剂量分组　设致癌物对照组，阴性对照组及3个受试物组。受试物剂量根据推荐的人体每公斤体重日摄入量，小鼠扩大10倍作为其中一个剂量，大鼠扩大5倍作为其中一个剂量。受试物经口给予，给予时间由致癌物对照组肿瘤发生的时间决定。 　　2.3.3　实验步骤 　　致癌物对照组连续给予致癌物，阴性对照组给予溶剂，受试物组除给予致癌物外同时或预先给予受试物，试验结束，观察各组肿瘤发生率或瘤重或生存时间。 　　2.4　数据处理及结果判定 　　采用卡方检验或方差分析进行统计。受试物组与致癌物对照组比较，肿瘤发生率或瘤重或生存时间，经统计学处理差异有显著性，则可判定该受试物该项试验阳性。 　　3　免疫功能试验 　　参见“保健食品的功能学程序和检验方法”中免疫调节作用 　　3.1　NK细胞活性测定 　　3.2　单核－巨噬细胞功能测定 PAGE 3