蛹虫草多糖提取及纯化工艺研究

江西农业学报 　2007, 19 (12) : 80～82 Acta Agriculturae J iangxi 蛹虫草多糖提取及纯化工艺研究 刘红锦 1 ,蒋 宁 1 ,李建军 1 ,连云岚 2 ,张 平 1 　 　收稿日期 : 2007 - 09 - 14 基金项目 :江苏省农业科技攻关项目 (BE2007318)。 作者简介 :刘红锦 (1965 - ) ,男 ,江苏人 ,副研究员 ,主要从事农产品加工技术研究。 (1. 江苏省农科院 农产品加工所 ,江苏 南京 210014; 2. 山西省药品检验所 ,山西 太原 030001) 摘　要 :采用以大米、蚕蛹为主原料的培养基培养蛹虫草子实体。通过正交实验对蛹虫草水溶性多糖的提取工艺进行了 研究 ,利用蒽酮 -硫酸法来测定多糖含量。发现 90 ℃、加水 20倍、分 3次提取、每次 3 h为最佳提取条件。同时考查了不同除 蛋白方法对虫草多糖的蛋白去除效果。 关键词 :蛹虫草 ;多糖提取 ;脱蛋白 中图分类号 : S567. 35　文献标识码 : A　文章编号 : 1001 - 8581 (2007) 12 - 0080 - 03 Study on Extraction and Pur if ica tion of Polysacchar ides from Cordyceps m ilita ris L IU Hong - jing1 , J IANG N ing1 , L I J ian - jun1 , L IAN Yun - lan2 , ZHANG Ping1 (1. Institute of Agricultural Products Processing, J iangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China; 2. Shanxi Provincial Institute for D rug Control, Taiyuan 030001, China) Abstract: The medium mainly containing rice and the pupa of silkworm was used to cultivate the sporocarp of Cordyceps m ilitaris. Extraction p rocessing of water - soluble polysaccharide in Cordyceps m ilitaris was studied through orthogonal experiment, and the an2 throne - sulphuric acid method was used to determ ine polysaccharide content. Three times (3 hours per times) extraction with 20 times water at 90 ℃ was the best extraction conditions. Simultaneously dep roteinization effect was exam ined with different methods. Key words: Cordyceps m ilitaris; Polysaccharide extraction; Dep roteinization 　　蛹虫草 (Cordyceps m ilitaris (L. ) L ink)又名北冬虫夏 草 ,属子囊菌亚门 (A scomycotina)核菌纲 ( Pyrenomycetes) 球壳目 ( Sphaerinles)麦角菌科 ( Claviticp itaceae)虫草属 (Cordyceps)。现代研究表明 ,蛹虫草的主要成分与冬虫 夏草类似 ,具有抗疲劳、抗衰老、增强免疫和性功能等作 用 [ 1 ]。其味甘性平 ,中医多用来治疗肺结核、老人畏寒、 咳嗽、衰弱、产妇及老人贫血虚弱、遗精、阳痿、自汗盗汗、 腰膝酸痛、神经衰弱、病后久虚、咳血吐血、慢性肾 炎等 [ 2 ]。 虫草多糖 (CMPS)是蛹虫草中的重要的活性物质 , 国内外科研人员对蛹虫草多糖的结构研究较多 [ 3 ]。如 盖新杰等报道虫草多糖的单糖组分为半乳糖∶甘露糖 = 6 ∶5,它以β(1→2)连接的甘露糖为主干 ,支链由较大量的 β(1→6)半乳糖和较大量的β(1→2)呋喃半乳糖构成 , 分别连接在主干的 0 - 4和 0 - 6上 ,是含少量蛋白、有高 度分支结构的杂多糖 [ 4 ]。虫草多糖已被证实具有抗肿 瘤、降血糖、抗肝纤维化作用及对单核巨嗜细胞系统的功 能具有增强作用 ,还能提高免疫功能及治疗肝的病毒性 感染等 ,具有广阔的开发前景。 本文进行了蛹虫草多糖的提取、纯化工艺研究 ,以 期为虫草多糖的规模化生产提供理论依据。 1　蛹虫草子实体栽培 1. 1　实验材料和仪器　锥形瓶、玻璃试管、硫酸镁、罐头 瓶、大米、蚕蛹粉 ;蛋白胨、葡萄糖、VB 等 (市售 ,化学 纯 )、高压灭菌锅、恒温摇床、电子天平、量瓶。 1. 2　实验方法 1. 2. 1　菌种制作 1. 2. 1. 1　液体培养基制作　葡萄糖 2%、蛋白胨 1%、磷 酸二氢钾 0. 05%、硫酸镁 0. 15、维生素 VB1适量 ,摇匀 , 装入锥形瓶 ,用棉花塞或牛皮纸密封 ,高压灭菌 30 m in, 冷却备用。 1. 2. 1. 2　接种　在无菌的条件下 ,接入母种 ,摇瓶 ,接种 后放入温度为 22 ℃的环境中 ,培养 7～10 d待用。 1. 2. 2　生产过程 1. 2. 2. 1　装料与封口　以 500 mL罐头瓶为栽培容器 , 冬季每瓶加 20 g大米和 50 mL添加剂。用 12 cm ×12 cm ×0. 04 cm的聚丙烯塑料盖住瓶口 ,然后用硅胶皮筋 扎口。 1. 2. 2. 2　灭菌与接种　在 1. 05 kg/cm2 压力下灭菌 1～ 1. 5 h,冷却到 25 ℃以下接种。液体母种容量一般为 15 mL。 1. 2. 2. 3　菌丝培养　将接完种的瓶子放于 22～25 ℃的 环境中 ,绝对避光培养。接种后 3～4 d,在培养基的表面 及瓶壁周围出现短的绒毛状菌丝 ,在 15 d后瓶壁处的气 生菌丝开始转色 (转为橙黄色 ) , 22～24 d菌丝即可长满 培养基。 1. 2. 2. 4　子座形成　将培养瓶进行出草管理 ,控制温度 为 18～22 ℃、保证散射光充足 (光线最好直射瓶的顶 部 ) , 7～12 d后 ,培养基的表面开始出现细小的子座 ,待 肉眼可以看到子座时 ,加大通气量并维持环境湿度 85% 为宜。 1. 2. 2. 5　采收　从子座的形成到采收大约需要 20～25 d。其成熟的标志是 :子座长到 5 cm左右 ,其顶部出现许 多小刺。 2　蛹虫草多糖提取工艺研究 2. 1　多糖测定方法 2. 1. 1　实验材料及仪器　电热恒温水浴锅 (北京市医疗 设备厂生产 ) ,布氏抽滤漏斗 , 95%乙醇 ,蒽酮、浓硫酸 (均为纯 ) ;岛津 UV - 2501PC 紫外分光光度计 ; 1200SM岛津电子分析天平。 2. 1. 2　测定波长的选择　取含量测定用 D - 无水葡萄 糖 (中国药品生物制品鉴定所 ,批号 110833 - 200302)于 105 ℃下干燥至恒重 ,精密称取干燥后的 D - 无水葡萄 糖适量 ,加水溶解制成每毫升含 0. 2 mg的溶液 ,作为对 照品溶液。在 500～700 nm范围内做光谱扫描 ,确定其 最大吸收峰在 624 nm处 ,结果见图 1。 图 1　D -无水葡萄糖溶液光谱扫描结果 2. 1. 3　标准曲线 　精密称取 105 ℃下干燥至恒重的 D -无水葡萄糖对照品 10 mg,置于 50 mL容量瓶中 ,加蒸 馏水稀释至刻度 ,摇匀 ,制成对照品溶液。分别精密吸取 上述对照品溶液 0. 5、1、1. 5、2、2. 5、3 mL于 10 mL容量 瓶中 ,加水稀释至刻度 ,摇匀。再分别精密吸取 1 mL于 10 mL纳氏比色管中 ,加入蒽酮试液 0. 5 mL和浓硫酸 3 mL,放冷至室温后 ,于 624 nm处测定吸收度值。以水同 法加入试剂显色作为空白对照。分别以浓度为横坐标 , 吸收度值为纵坐标做标准曲线 ,结果如图 2所示。 2. 1. 4　测定方法　精密称取粗多糖 10 mL用水定容于 50 mL容量瓶中 ,加水稀释至刻度 ,再精密吸取 2 mL置 于 10 mL容量瓶中用蒸馏水定容 ,摇匀 ,再精密吸取 1 mL于纳氏比色管中 ,加入蒽酮试液 0. 5 mL和浓硫酸 3 mL,放冷至室温后 ,于 624 nm处测定吸收度值 ,计算即 得多糖含量。 2. 2　蛹虫草多糖水提取工艺研究 2. 2. 1　实验材料　取蛹虫草子实体 (浙江野老生物技术 有限公司提供 ) ,粉碎 ,过 100目筛备用。 2. 2. 2　仪器 　水浴锅、天平、搅拌器、粉碎机、筛网 (100 目 )。 图 2　D -无水葡萄糖溶液的标准曲线 2. 2. 3　提取工艺优化 　用 4因素 3水平 (温度 80、90、 100 ℃;提取时间 3、5、7 h;加水量 10、20、30倍 ;提取次数 1、2、3次 )进行正交实验 ,正交设计及实验结果见表 1。 表 1　蛹虫草多糖水提取工艺正交实验设计及结果 处理 提取温度(℃) 提取时间 ( h) 加水量 (倍 ) 提取次数 实验结果 ( % ) 1 80 3 10 1 26. 1 2 80 5 20 2 38. 2 3 80 7 30 3 24. 2 4 90 3 20 3 52. 8 5 90 5 30 1 46. 6 6 90 7 10 2 35. 9 7 100 3 30 2 37. 2 8 100 5 10 3 41. 0 9 100 7 20 1 50. 8 均值 1 29. 500 38. 700 34. 333 41. 167 均值 2 45. 100 41. 933 47. 267 37. 100 均值 3 43. 000 36. 967 36. 000 39. 333 极差 15. 600 4. 966 12. 934 4. 067 由表 1实验结果可知 ,加水量和提取温度对蛹虫草 多糖提取的影响最大 ,提取时间和次数次之 ,最佳提取条 件为提取温度 90 ℃、加水 20倍、分 3次提取、每次 3 h。 经 2. 2. 4醇沉处理 ,计算粗多糖的得率为 1. 84%。 2. 2. 4　醇沉　取提取滤液 ,冷却后以 1∶3体积加入 95% 乙醇沉淀 24 h,离心 ,过滤 ,沉淀分别用无水乙醇、乙醚和 丙酮洗涤 2次 , 60 ℃下真空干燥得粗多糖。 3　粗多糖脱蛋白方法的比较 据刑小黑等介绍 ,粗多糖脱蛋白纯化以后其生物活 性更高 [ 5 ]。因此 ,为提高多糖的生物活性及应用价值 ,本 试验对粗多糖中蛋白质的几种去除方法进行了比较。 3. 1　实验材料和仪器　粗多糖样品 (自制 ) , THZ - C - 1型定氮仪 ,LXJ - IIB型离心机等。 3. 2　实验方法和结果 18　12期 　　　　　　　　　　　　　刘红锦等 :蛹虫草多糖提取及纯化工艺研究 3. 2. 1　实验方法　采用以下 4种方法分别对粗多糖溶 液进行脱蛋白处理。 3. 2. 1. 1　Sevage法　配制质量浓度为 1% 的粗多糖溶 液 ,按体积比 1 /0. 24,加入样品及氯仿正丁醇混合液 (其 中氯仿和正丁醇体积比为 1∶0. 2) [ 6 ] ,振摇 30 m in,离心 取上清液 ,重复以上操作 5次。 3. 2. 1. 2　三氯乙酸法 ( TCA法 ) 　配制质量浓度为 l% 的粗多糖溶液 ,加入 1% TCA,振摇 20 m in后静置 30 min,然后离心除去沉淀 ,取上清液重复以上操作 2次 [ 7 ]。 3. 2. 1. 3　氯化钙法　配制质量浓度为 1% 的粗多糖溶 液 ,调节 pH值为 8～9,加热至 85 ℃,加氯化钙使其浓度 为 5% (w /v) ,搅拌 ,冷却 ,离心 [ 8 ]。 3. 2. 1. 4　盐酸法　配制质量浓度为 1% 的粗多糖溶液 , 向溶液中逐滴加入 2 mol/L的盐酸溶液 ,调 pH值为 3, 4 ℃下放置 12 h,离心 [ 8 ]。 3. 2. 2　试验结果　采用蒽酮硫酸法测定多糖的含量 (见 2. 1部分 ) ,采用定氮仪测定蛋白质含量 ,考察了 4种方 法的多糖保留率和蛋白去除率 ,结果如图 3所示。由图 3可见 ,蛋白去除率以盐酸法最高 ,而多糖保留率以 Sevage法最高。 图 3　4种不同脱蛋白方法的多糖保留率和蛋白去除率 3　结果与讨论 本研究采用大米、蚕蛹等为原料培养蛹虫草子实 体 ,该技术可规模化生产蛹虫草 ,为虫草多糖的提取提供 了价廉、优质的原料 ,具有较大的推广应用价值。 采用水提醇沉的方法对蛹虫草多糖进行了提取 ,设 计正交实验优化了多糖的提取工艺 ,发现 90 ℃、加水 20 倍、分 3次提取、每次 3 h为最佳提取条件。 在多糖的含量测定中 ,国内多采用显色试剂 - 硫酸 法 ,其原理是单糖、多糖及其衍生物在硫酸作用下水解 , 脱水生成醛类化合物 ,与酚类、芳胺类等缩合成有色化合 物。如苯酚 -硫酸法、蒽酮 - 硫酸法、α - 萘酚硫酸法及 咔唑 -硫酸法 ,其中咔唑硫酸法用于糖醛酸类多糖的测 定。曾比较过苯酚 - 硫酸法 ,α - 萘酚硫酸法和蒽酮 - 硫酸法 ,结果表明蒽酮 - 硫酸法比苯酚 - 硫酸法样品稳 定且重现性好。 通过对 4种脱蛋白方法进行比较 , Sevage法蛋白质 脱除率较高 ,且其多糖保留率最高 ,故确定其为脱蛋白方 法 ;但在实际生产中 ,因氯仿毒性较大 ,对人体危害较大 , 不宜采用。氯化钙法成本低廉、操作简单、脱蛋白效果及 多糖保留率尚可。三氯乙酸法和盐酸法脱蛋白效果虽较 好 ,但多糖保留率低 ,且存在多糖水解的缺点 ,因而不宜 采用。故应继续开展多糖除蛋白工艺的研究 ,开发出安 全、易操作、适宜规模化生产应用的技术。 参考文献 : [ 1 ] 张平 ,朱述钧 ,蒋宁 ,等.北冬虫夏草功能成分及保健作用分析 [ J ]. 江苏农业科学 , 2003, (6) : 105～107. 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