14碱性磷酸酶米氏常数的测定null实验十四 碱性磷酸酶米氏常数的测定
实验十四 碱性磷酸酶米氏常数的测定
一、目的要求一、目的要求1.学习分光光度法测定的原理和方法
2.学习和掌握米氏常数(Km)及最大反应速度(Vm)的测定原理和方法,测出碱性磷酸酶在以对硝基苯酚磷酸为底物时的Km 和Vm值。二、原理二、原理酶促反应v-[S]曲线
v
...
null实验十四 碱性磷酸酶米氏常数的测定
实验十四 碱性磷酸酶米氏常数的测定
一、目的要求一、目的要求1.学习分光光度法测定的原理和方法
2.学习和掌握米氏常数(Km)及最大反应速度(Vm)的测定原理和方法,测出碱性磷酸酶在以对硝基苯酚磷酸为底物时的Km 和Vm值。二、原理二、原理酶促反应v-[S]曲线
v
[S]
推导出米氏方程为:
其中[S]为底物浓度;v为初速度;Vm为最大反应速度;Km 为米氏常数 null 米氏常数Km是酶的一个基本特征常数,它包含着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能够作用于几种不同底物时,米氏常数Km往往可以反映出酶与各种底物的亲和力的强弱。
测定Km和Vm,可通过作图法求得。 最常用的Lineweaver-Burk双倒数作图法。这个方法是将米氏方程转化为倒数形式,即:
以1/v对1/[S]作图,可得一条直线null 1/v
1/Vm
-1/Km 1/[S]
本实验测定碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸钠盐(pNPP)水解的Km和Vm.
反应式:pNPP+H2O pNP+HPO42-
无色 黄色
可通过分光光度法测定产物pNP的含量,求出反应速度v。 null三、试剂与器材
试剂: 0.5mol/mL pNP 、10 mmol/L pNPP、20 mmol/L MgCl2、0.1 mol/L 碳酸钠—碳酸氢钠 pH 10.1缓冲液、0.2 mol/L NaOH、6 mg/mL碱性磷酸酶酶液
器材:恒温水浴锅、722分光光度计
四、操作方法四、操作方法(一)对硝基苯酚标准曲线的制作(不做)
取5支试管编号,0号一支,1-7号各二支,按下表操作:
管 号 0 1 2 3 4 5 6
pNP含量 (mol) 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30
0.5mol/mL pNP (mL) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
H2O (mL) 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2
Na2CO3-NaHCO3 (mL) 各管加入1.0 mL
20 mmol/L MgCl2 (mL) 各管加入0.2 mL
0.2 mol/L NaOH (mL) 各管加入2.0 mL
OD 405 nm
以对硝基苯酚的绝对量(mol数)为横坐标,OD405nm值为纵坐标,绘制标准曲线。求出pNP的克分子消光系数()值。null(二)测定
15支试管,1-5做两组平行测定管,01-05作为空白对照。
No. 1 2 3 4 5
底物终浓度[S] (mM ) 0.5 0.75 1.0 1.5 3
10 mmol/L pNPP(mL ) 0.1 0.15 0.2 0.3 0.6
蒸馏水(mL ) 0.6 0.55 0.5 0.4 0.1
碳酸盐缓冲液(mL ) 各加1.0 mL
20 mmol/L MgCl2 (mL ) 各加0.2 mL
预热 混匀,37℃,5分钟
酶液(mL ) 测定管各加0.1 mL酶液
反应时间 37℃,精确反应10分钟
0.2mol/L NaOH(mL) 各加2 mL
酶液(mL ) 空白管各补加0.1 mL酶液
OD405
分别以01-05调零点,测定对应样品管OD405。
null(三) 数据处理
各管在722分光光度计测定波长405nm的OD值(OD405nm)。从对硝基苯酚标准曲线上查出OD405nm相当于产物对硝基苯酚的含量,计算出各种底物浓度下的初速度vo(单位以molL-1min-1表示),取倒数1/v填入表内。以1/v对1/[S]作图,求出酶催化pNPP水解的米氏常数Km和最大反应速度Vm。
null五、 注意事项
取液量一定要准确(移液管或取液器的使用)。
反应时间一定要精确。
加酶前后一定要将试剂混匀。
空白对照一定要先加NaOH,后加酶。
测定OD405时要以各自的空白调零点。
不要直接把测定完的样品溶液倒掉,而要倒回原试管。
比色杯的使用
底物pNPP要按需取用。
如果测定值太小或者太大超出量程,要适当调整加酶的体积或者酶浓度重新进行实验。null六、思考
(1) 试说明米氏常数Km的物理意义和生物学意义。
(2)为什么说米氏常数Km是酶的一个特征常数而Vm则不是?
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