高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及其分子流行病学分析

© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 第 卷 第 期 年 月 中 国 预 防 兽 医 学 报 , 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的 分离鉴定及其分子流行病学 童光志 , 周艳君 , 都晓芳 , 田 志军 , 仇华吉 , 彭金美 , 安 同庆 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室 猪传染病研究室 , 黑龙江 哈尔滨 摘 要 为 了弄清 年在我国南方一些猪场暴发的一种 以 高热 、 高发病率和 高死亡率为特征的传染病的 病 因 , 我们 从 个省市 个发病猪场采集临床样品进行 了猪繁殖与呼吸综合征病毒 , 双 的分 离鉴定和分子流行病学分析 。 结 果显 示从 个猪场样品 中均检测 出了 , 通过 完整的 和部分 基 因序列比较分析发现来 自 个省市不 同猪场的 高度同源 , 而 且在 基 因上都有两个相同位点的缺失 从分 离的 株 中选择湖南分 离株 人工 感染 头 日 龄的健康猪 , 结 果 头猪分别在 一 内全部死亡 , 感染猪的临床症状和现地所见十分相似 。 本次试验结 果 明新 出现的 以 基 因部分缺失为特征的 对猪是高致病性的 , 可能是 年大部分猪场幕发 “ 高热 综合症 ” 的主要病 因 。 关健词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 高热综合症 分子流行病学 中图分类号 文献标示码 文章编号 一 一 一 一 , 一 , 一 , 认 一 , 一 , 一 , 一 份 , , 叼 , , , , 一 , , 一 , ’ , 一 一 一触 , , , , , , , , , 收稿 日期 一 一 基金项目 国家 “ ” , 十一五国家支撑计划 , 国家自然科学基金 作者简介 童光志 , 男 , 湖北薪春人 , 研究员 , 博士 , 研究方向为动物病毒分子生物学及免疫学 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 中 国 预 防 兽 医 学 报 年 从 年 月开始在我国南方一些省份的猪场 暴发了一种 “ 高热 ” 综合症 , 发病猪的体温高于 ℃ , 病猪食欲不振甚至废绝 , 腹部 、 耳及后驱发 红 , 发病率从 , 死亡率从 一 不等 。 该病传播迅速 , 在短短的半年内几乎传遍了 大半个中国 , 特别是对养猪业比较发达的省份造成 了巨大的经济损失 。 为了弄清这次流行病的病原 , 我们在江西 、 湖南 、 湖北 、 广西 、 安徽 、 河北 、 浙 江 、 河南 、 天津 、 辽宁 、 吉林和黑龙江等 个省市 的 个发病猪场采集了临床样品 , 进行了猪繁殖与 呼吸综合征病毒 , 双 的检测及分离鉴定 , 结果 从 个猪场的样品中检测到 , 并分离出 株 , 对检测到 双 阳性的病料和分离 到的毒株进行了 和 的序列分析 , 并对从湖南分离的一株 州 做了感染 试验 , 现将试验结果如下 。 荧光进行鉴定〔’ , 。 序列分析 扩增检测到 阳性的病料和分 离到的毒株的 扩增区域是 一 和 全基 因 引物序 列 见 表 , 测 序后 与 中的 双 对应序列进行比较并绘制系统 进化树 , 。 表 本试验所使用的引物序列 。 , 傲劝 阮 咖勿 , 材料和方法 样品采集 采集 个省市 个猪场发生高热 病猪的抗凝血 、 肺 、 肾脏和淋巴结 表 。 裹 病毒样品及来诬 咖 招 扛泊 ”, 动物试脸 日龄 , 阴性的健康小猪 头 , 毒株为经过 次蚀斑克隆纯化过 的 株 , 每头猪滴鼻接种 , 病毒含量 、 。 接种后每天测温 , 每 采集抗凝血 和血清 , 分离病毒并检测抗体 。 死亡猪各脏器做 病理切片和冰冻切片‘礴 , 。 病毒的分 离与鉴定 将采集的病料研磨 、 离 心 、 过滤 , 接种于 一 细胞 , 观察 有 无细胞病变产生 。 将有病变的毒株传 代后用 的 、 引 物 进 行 扩 增 采 用 双 一 株的 、 特异单抗通过间接免疫 结 果 病毒分 离 将处理好的病料接种于生长良好的 一 细胞 , 一 左右 , 可见病变细胞发生 聚丛成堆现象 , 并且越来越严重 。 将该毒传 一 代 , © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 第 期 童光志 , 等 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及其分子流行病学分析 经 一 可扩增出 的 、 基 因 用 双 一 株的 、 单抗进行间接免疫荧光 试验 , 可见感染细胞的胞浆有特异性的荧光 图 。 用 或 一 检测细胞分离物的结果表明猪瘟 病毒 、 猪圆环病毒 、 猪伪狂犬病毒均为阴性 。 序列分析 从湖南某发病猪场分离到的一株 命名为 株 , 并对其全基因组进行了序 列测定 。 基因组全长 个碱基 , 基因的第 位和 一 位氨基酸发生缺失 。 对其它省市 发病猪场 双 阳性样品中扩增的 序列分析 发现 , 它们都有和 株 完全一致的缺失特征 图 。 这 个 的 序列相互之间高度 同源 , 同源性为 , 而与 年以前 的 双 的 同源性仅为 一 。 新 分离毒株的 基因相互之间也是高度同源 , 与以前的 毒株相比变异也比较 大 , 尤其是第 位氨基酸的改变被认为是与毒力 增强有关‘, · 图 。 动物感染试脸 头仔猪攻毒后第 体温开 始升高 , 并持续到死亡前 一 体温才下降 , 体 温最高均超过 ℃ , 其中两头超过 ℃ , 攻毒 猪还表现出精神沉郁 、 厌食 、 消瘦 、 眼圈发黑 、 眼 睑水肿 、 体表有大量脂溢性皮炎状红斑 。 从攻毒后 第 开始有猪死亡 , 至攻毒后 全部死亡 , 死 亡猪的体表皮肤由于末梢血管中的血液循环发生障 碍而表现出皮肤变红变紫 , 耳朵发给 图 。 病理剖检显示 , 死亡最主要的原因是由于肺部 感染引发炎症反应 , 肺实变导致呼吸衰竭 。 体表淋 巴结肿大 , 部分猪 胃部有 出血 和 溃疡 , 心 、 肝 、 脑 、 脾脏 、 肾脏眼观病变不明显 。 病理组织变化结 果显示 头死亡猪病理变化有一定的共性和差异 , © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 中 国 预 防 兽 医 学 报 年 共性表现为心 、 肝 、 大脑和小脑正常无明显的病理 变化 而脾脏表现为严重的滤泡崩解 , 生发中心消 失 , 结构不清楚 淋巴结表现为严重的淋巴小结崩 解并和副皮质区连成一片 , 结构不清楚 海马表现 为大量血管的管壁细胞肿大增生 。 差异主要表现在 肺和肾脏 , 随着死亡时间的延长 , 肺脏以淋巴细胞 浸润为主造成肺泡隔增宽而形成的间质性肺炎越来 越严重 而在死亡早期猪肾脏的表现为部分肾小球 富核 、 核浓缩进而形成肾小球坏死 , 随着死亡时间 的延长表现为肾间质有少量淋巴细胞浸润形成较轻 的间质性肾炎 。 攻毒后 , 头攻毒猪均检测到 双 的 和 抗体 , 但至试验结束也没有检测到中 和抗体 。 攻毒后第 , 在剩余的 头攻毒猪的血 液中均分离出 双 病毒 , 分离出的病毒其 和 基因序列与 株完全一致 。 用间接免疫 荧光方法检测病毒在各脏器 中的分布显示肾脏是 双 病毒分布最多的地方 , 其次是脾脏和肺脏 。 讨 论 我们从现地发病猪场分离到的 双 毒株与 年前分离到的毒株具有明显的差异 , 主要有以 下几点 新分离毒株的细胞适应能力与 年前的毒株相比显著提高 , 先前毒株很难直接适应 · 细胞 , 往往需适应原代肺泡巨噬细胞后才 能适应 一 细胞 , 且细胞病变不显著 。 而新分 离的毒株一代即可适应 一 细胞 , 并且产生明 显的细胞病变 , 正是因为这个特点 , 我们短时间内 在 个省份分离到 株病毒 , 这种现象在以前 双 分离中是很罕见的 。 临床症状和病理 变化比以往毒株严重 。 例如我们以 一 毒 株攻击仔猪临床症状只表现为中等程度的发热 , 体 温一般不超过 ℃ , 其他临床症状并不明显 , 同 样的饲养环境也没发生继发细菌感染的症状 , 攻毒 猪几乎没有致死情况的发生 〔 。 而新分离的毒株攻 猪后临床症状明显 , 并具有显著的致死能力 , 病理 变化中的脑部海马区血管细胞肿大增厚明显 , 这是 否与现地许多发病猪出现神经症状有关 , 这也说明 新分离的毒株具有感染脑组织的能力 , 这可能也是 毒力增强的一种表现 。 另外 , 胃部有出血和溃疡这 也是以往 攻毒试验所未见到的 。 新分 离毒株的抗原性要明显强于以往分离毒株 , 我们用 双 一 毒株攻猪后 , 只有部分猪 抗体阳转 , 才检测到 抗体 , 而新分离毒株 攻毒后 均检测到 的 和 抗体 。 初步的试验结果表明新分离的毒株与以往毒株 的交叉保护能力差 , 我们用以往毒株作成灭活苗免 疫仔猪后只能保护部分仔猪抵抗新分离毒株的攻击 未发表资料 。 新分离毒株分子特征高度一致 , 而与先前毒株又有显著差异 , 尤其是 基因的 缺失和结构蛋白基因序列的突变 , 这些变化中哪些 对毒力的改变起决定作用还有待进一步的研究 明 。 综上所述 , 从 年暴发的所谓 “ 高热综合 症 ” 的猪场分离到的 双 分离株有一个显著特征 就是在 基因上有两处缺失 , 分子流行病学分析 发现在不同省市猪场流行的 相互之间高度同 源 , 与以往 双 有很大的区别 ’ , 尤其是致病能 力大大增强 , 因此 , 我们可 以初步认定这种新的 变异株是南方猪 “ 高热综合症 ” 流行的主要 病因 可能有部分猪场发病是由其它原因引起的 。 针对这些新的 双 变异株 , 我们还需要在流行 病学 、 免疫学 、 致病的机制等方面进一步开展深入 的研究以防止其继续对我国养猪业产生重大危害。 参考文献 , 哪 甲 如 ”记 , , 一 , , , 一 押山。 一 丘姆 【 」 , , 一 , 助 , 月 访 卜记 , , 一 , , , 茂 代 ’ 活 , , · , , , 云 云 助 【 , 碑 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 第 卷 第 期 年 月 中 国 预 防 兽 医 学 报 】 , 表达鸡马立克氏病病毒 基因重组鸡痘病毒的 遗传稳定性及生物安全性评价 卢 军 ’ 胡传伟 ’ , 金 乔 ’, 彭大新 ’, 刘文博 ’, 高 拱 ’, 张如宽 扬州大学 农业部畜禽传染病学重点开放实验室 , 江苏 扬州 上海市畜牧兽医站 , 上海 刘 秀梵 ” 摘 要 为 了评价表达鸡马立克氏病病毒 基 因重组鸡痘病毒 一 瓜 的遗传穗定性 , 我们将纯化 后 的重组病毒在 单层上连续传 代 , 引起细胞病 变的速度和形 态均未发 生 明显 变化 及盖含 一 的琼 脂 引起的 空斑均为蓝 色 间接免疫荧光 实验证明 一 瓜 中的 基因始终能稳定表达 序列测 定结果表明 , 重组病毒在细 胞上连 续传 代 、 在 鸡上连续传 代后 , 基 因序列没有发 生任何 变化 以 、 、 、 代重组病毒制成冻干疫苗进行的 实验 室免疫效 力 实验表明 , 细 胞连续传代后 一 爪 仍 然保持 了原有的免 疫原性 。 可 见 重组鸡痘病毒 基 因的结 构和免疫原性都是 高度稳定的 。 为 了评价 一 爪 的 生物 安全性 , 我们将 一 瓜 通过 鸡连续传 代 , 检测 病毒在鸡体 的存在部位及其消长 、 生长繁殖性能和毒力 变化 将 一 瓜 免疫鸡与 未免疫鸡同笼饲养 , 攻击 一 强毒 , 以 检测 一 瓜 感染鸡的接触传 染性 。 结 果显 示 , 一 服 在鸡体的存在时间大约 为 , 在体 内仅存在于接种部位 鸡体传代后 疽病毒毒力有一 定 程度下 降 , 基 因核普酸序列未发 生任何 变化 同居未免疫 鸡在痘病毒强毒攻 击后 全部发疽 , 可 见 重组 病毒免疫鸡没有接触传染性 , 能在鸡体 内稳定地传代 , 一 瓜 具有高度的 生物安全性 。 关健词 鸡马立 克氏病 重组鸡痘病毒 基因 遗传稳定性 生物安全性 中图分类号 文献标识码 文章编号 一 一 一 , 收稿 日期 一 一 基金项目 农业科技成果转化基金项 目 作者简介 卢 军 , 江苏东台人 , 硕士 , 主要从事动物病毒分子生物研究 通讯作者 一 、 。 。 , , , 一 , , , , 一 , , 门 一 , , 一 , , , 一 叩 , , 礴 , , , 哪 叹 一 」 , , · , , , · 巧, 」 , , 责任编辑 付朝阳