基因芯片技术在男性生殖研究中的应用

中国男科学杂志 年第 卷第 期 基因芯片技术在男性生殖研究中的应用 上海交通大学医学院附属仁济医院 上海 朱晓斌 综述 一 李 铮 审校 基因芯片是应用大规模集成电路的微阵列技术 , 在 固相支持物面有规律地将数万个代表不同基因的寡 核普酸探针或液相合成探针 , 由点阵器有规律地点样 于固相支持物表面 。 实验研究时将材料中的 、 或 用同位素或荧光物标记 , 与固相支持物 表面的探针进行杂交 , 通过荧光共聚焦显微镜扫描 , 利 用计算机对每一个探针上的杂交信号作检测 、 分析 , 从而检测 目的材料中大量基因表达图谱 。 该技术可将 大量的探针同时固定于支持物上 , 所以一次可对大量 核酸分子进行高通量检测分析 。 近年应用基因芯片技 术在探讨皋丸 、 附皋和精子相关基因表达 、 男子不 育症诊断和男性生殖生理学的研究等男性生殖医学领 域取得了较大的进展 。 一 、 基因芯片的研制和分类 年美国 等应用光导原位合成 多肤链技术 , 研制了第一块基因芯片川 。 年美国 加州旧金山 公司对芯片技术进行革新 , 采 用照相平板 印刷技术 、 固相合成技术 、 计算机 、 半 导体 、 激光共聚焦荧光扫描 、 寡核普酸 合成技 术 、 荧光标记探针杂交等技术 , 研制成功可进行商 业化生产的基因芯片 。 以芯片片基的不同分为无机 片基和有机合成物片基 按其应用的不同可以分为表 达 谱芯 片 、 诊断芯片 、 检测 芯 片 、 毒理芯片 、 测 序芯片 按其结构的不同可以分为 阵列和寡核 营酸芯片 。 二 、 基因芯片技术在生精相关基因研究中的应用 一 辛丸基 因研究 中的应用 皋丸的正常分化和精子发生的顺利进行是正常男 性具有生育能力的前提 , 精子发生过程中任何环节出 现问都可能造成不育 。 年 , 沙家豪等 首次用 人辜丸长插入片段文库构建了一个含有 个基因的 人辜丸 序列 , 用于鉴别人胚胎皋丸和成人翠丸 的差异表达的基因 。 通过用 ’乍标记的人胚胎辜丸 成 人辜丸探针和 周龄 周龄小鼠攀丸探针与其杂交 , 得到了 个人胚胎翠丸 成人辜丸差异表达的基因和 个 鼠 周龄 周龄辜丸差异表达 倍以上的基因 , 其中有 个 已知基因在人鼠翠丸中都有差异表达 , 与 攀丸发育和精子生成密切相关 。 在这 个已知基因 中 , 已被以前的工作证实为精子发生特异的 , 包括 、 、 、 、 、 、 、 , 结果证实用皋丸芯片可以鉴 别辜丸功能相关基因 。 等 用 高 密度寡核昔酸芯片研究 了翠丸生精细胞的有丝分裂 期 、 减数分裂期和减数分裂后期的基因表达及转录 , 在大鼠的肇丸生精细胞和支持细胞中同时检测到 个转录位点和表达序列标签 。 等 用基因芯 片技术发现了在啮齿动物中主要的肇丸基因转录上调 和峰值的表达发生在精原干细胞的有丝分裂增殖期 , 减数分裂期开始和减数分裂后期的单倍体细胞成熟过 程 中 。 二 在附辛基 因研究 中的应 用 精子在翠丸中发生 , 沿附攀管到达输精管 , 在 通过附翠管过程中精子获得运动 、 成熟和受精能力 。 附翠的三个不同区域 附翠头 、 体 、 尾分别有不同 的功能 , 由多种基因调控 。 等 用寡核昔酸 基因芯片平台在小鼠附翠中同时检测了 个双氢肇 酮表达依赖或表达减少的转录基因 , 证实了小鼠附皋 头 、 体 、 尾各部分的雄激素转录调节 。 在附皋组织 中 , 一 还原酶是个非常重要的酶 , 因为它可以把皋 酮转化为脱氢肇酮 , 而脱氢辜酮是调节附皋功能的主要 激素 。 等 用不同剂量的 。 一 还原酶抑制剂 处理大 鼠 , 发现脱氢翠酮依赖组织包 括附翠 、 生殖管道等重量减少 , 基因表达的影响与 剂 量 和 部 位 高 度 有 关 。 用 低 剂 量 和 中 等 剂 量 处理的大 鼠附翠重量减少了 , 而高剂 量 处理的大鼠减少了 。 辜丸的重量没 有 明显 的变化 。 三 在精子相 关基因中的研究 等 用基因芯片对小鼠翠丸研究发现 在 小鼠翠丸 细胞中雄激素受体的减少可 以导致输 精管道紧密连接蛋白 表达下降 , 从而导致血 翠屏障对生物素的通透性增加 。 通过此研究 , 他认 为雄激素对精子生成的影响可能是通过生精管道上微 环境变化引起的 。 等 在采用人类 芯片在人 类胎盘 、 成人翠丸和人类精子对 基因做了研 究 , 结果表明 基因与成人翠丸 、 人类胎盘 和人类精子探针杂交的密度分别是 , 和 , 基因在成人辜丸中的表达强度几乎是胎 盘中的三倍 。 因为 基因家族可以在精子中表 达 , 所以推测 和 家族在辜丸发育和 , 精子成熟中起着重要的作用 。 等‘’ 应用 基因芯片研究 一 在成人翠丸 、 射出精液和胎 儿辜丸中表达差异 , 确定了 一 是 一 种新的翠 丸特异基因 , 认为 一 可能表达一种酩氨酸酶 的底物 , 影响精子获能 。 三 、 在男性不育症疾病诊断相关基因中的应用 邵晨等 ’】用应用基因芯片技术比较正常翠丸组织 与无精子症病人辜丸组织中差异表达的基因 , 获得 条差异表达的基因 , 其中明显上调的基因 与人类精子调控关系密切 。 是一个小的 酶 , 同许多 家族成员一样 , 在氨基酸序列上有极高的同源性 , 尤 其在与催化其活性的鸟核昔酸交换因子发生反应的结 构区域 , 对内分泌细胞有重要的作用 。 等 对不 育患者进行辜丸活检 , 然后应用基因芯片对活检组织 进行了全基因的分析 。 认为通过基因芯片技术对活检 样本的分析 , 可以评估不育患者的辜丸生精功能和发 现不育患者中新基因的表达 。 认为对需要行辅助生殖 技术的患者 , 在 前更适于基因芯片的检查 可 以对肇丸形态学正常的不育患者进行分子学 分类 可 以通过对不育患者翠丸基因的研究来 进一步评估辅助生育的结果 。 等‘’ 成功的把基因 芯片技术应用在不育患者 微缺失检测中 , 和用 和凝胶电泳对 为 微缺失的检测对照 , 有同样的检出 率 , 没有发现假阳性的例子 。 基因芯片在不育男性 的实验室分子诊断中是一个很有效的检测工具 , 特别 是适合于大样本的检测 , 它不仅能大大增加不育患者 微缺失的检测效率 , 而且对检测的敏感性和特异性 也有了一定的提高 。 ’ 运用基因芯片技术比较了 完全性葡萄胎和部分性葡萄胎的基因表达差别 , 结果 发现 在完全性葡萄胎患者体内 , , 和 下调 , 抑制最为明显 , 在 被证明存在 多态性的 名患者中 , 完全 没有表达 。 相反 , 在 例也被证明存在 多态 性的部分性葡萄胎患者中 , 表达正常 。 这个 发现为完全性葡萄胎的病理诊断提供了依据 。 用基因芯片研究分析了温热处理后活力较好的精子 的 完整性 , 发现温热处理过的精子八倍体明显 增加 , 但 的完整性没有破坏 , 相反 , 活力较 低的精子的 完整性有破坏 。 从而认为 , 温热处 理过的活力较好的精子可以作为 前高质量精子筛 选 的标尺 。 四 、 男性不育治疗靶点基因中的应用 在果蝇中 , 精子和附属性腺蛋白通过交配可由雄 性传给雌性 , 从而在雌性动物中触发许多生理和行为 的改变 。 等 用寡核昔酸基因芯片研究了雌 性果蝇分别与正常成熟雄性果蝇 、 无精子果蝇以及无 精子和附属性腺蛋白的雄性果蝇交配后的基因表达情 况 , 结果表明 交配后 , 有 个基因表达上调 , 大部分上调低于 倍 , 其中有 个基因上调是由于 接受了雄性的精子 , 个基因上调是由于接受了雄 性附属性腺蛋白 , 剩下的表达水平发生改变的基因是 与无精子和附属性腺蛋白的雄性交配后发生的 , 而且 这种交配依赖基因已证实对许多生物过程包括代谢 、 免疫防御和蛋白调节起重要的作用 。 雄激素不敏感综 合征的临床表型多样化 , 可以从不育症到完全的女性 化 , 大多数患者都与雄激素受体基因突变引起的功能 丧失有关 。 等 ’ 在体外对正常男性和雄激 素受体基因突变引起的完全女性化病人的生殖上皮纤 维原细胞作 了对照研究 , 用 芯片技术检测 了 个不同的基因 , 结果发现有 个基因存在明 显的转录差别 。 进一步研究发现 , 无论是在正常男 性还是在雄激素不敏感综合症患者的生殖纤维原细胞 中 , 尽管有雄激素受体的表达存在 , 但在用双氢翠 酮治疗后 , 仍然没有发现基因转录的变化 。 在不育 症患者中 , 由于药物影响造成的辜丸功能下降也是造 成男子不育的重要原因之一 。 等用 芯片 技术研究了丙烯酞胺对大鼠肇丸基因表达的毒性作 用 , 证 明肇丸功能 、 细胞凋亡 、 细胞 的氧化还原 、 细胞生长以及细胞周期的基因表达与丙烯酞胺的毒性 息息相关 , 丙烯酞胺可以增加辜丸间质细胞的死亡 , 干扰翠丸基因的表达 , 造成精子形态学改变 , 形成 辜丸多种组织病理学上的损害 。 等 ’ 也运 用 基因芯片研究了 , 一 己二酮 、 乙二醇单丁醚 、 环磷酞胺 、 柳氮磺毗睫四种药物对生殖的毒理作用 , 予以成年大鼠口服用药一次 , 后 , 用 芯片 对翠丸进行了组织病理学分析 , 结果发现没有明显异 常 , 仅在乙二醇单丁醚一组里发现辜丸精母细胞存在 轻微退变 。 有趣的是 , 三种与生精有关基因 热休 克蛋白 住 、 胰岛素生长因子连接蛋白 和谷肤甘肤 转移酶可以被四种药物的混合物影响 。 忍 等 圳应用基 因芯片技术研究了精子暴露在人乳头状病毒下 , 基 因 和 外显子区域的完整性 。 发现暴露在 型人乳 头状病毒的精子里 基因 外显子区域受到影响 , 暴 露在 型里的 外显子区域受到影响 。 结果说明了不 同亚型的人乳头状病毒作用于精子不同的基因区域 。 受到病毒感染的精子活力明显下降 , 但仍然有受精能 力 , 而且可以整合在精子 里传给下一代 。 在一 个基因中 , 组织明确的 表达模式对于它的生理 功能能够给出重要的线索 。 为了建立广泛的特别组织 中国男科学杂志 年第 卷第 期 基因表达图谱 , 等从小 鼠和人类的基因组中 , 构 建了已知和一些未知的蛋白编码基因常规微阵列 。 用 全部的基因组表达阵列 , 检测 了一个广泛的转录装置 表达 , 完成了在单个技术平台队 个人类组织和 个小鼠基因转录的预测 ’ 。 七 、 结 语 基因芯片技术的出现为现代医学及医学诊断学的 发展提供了强有力的手段 , 促使医学从 “ 系统 、 血 管和细胞层次 ” 向 “ 、 、 蛋 白质及其相 互作用层次 ” 过渡 , 并快速进入实际应用 。 但基因 芯片也有其不足之处 , 首先 , 用基因芯片分析微生 物细胞的转录活性 , 从组织中提取 , 合成 靶基因后在基因芯片上杂交 , 虽然这个方法缩短了样 本的准备时间 , 减少了 降解对数据表达的依赖 性和重复性 的影响 。 但是 , 对于许多位点的转录模 式 特别是一些低水平表达 , 在不 同种类 的肇丸 组织中确定转录细胞类型是困难的甚至是不可能的 。 其次 , 基因芯片的探针设备 昂贵 , 数据处理繁 琐 , 对 来源的标记样品需求量较大 。 当前基 因芯片不能很好地应用于临床诊断其中一个重要的原 因就是其重复性差 , 因为在固体和液体交界面进行反 应 , 多种因素可 以影响反应的结果 。 再次 , 目前还 有许多编码大鼠和小鼠基因组转录不能确定 , 因此 , 确定啮齿动物精子生成基因转录的前提条件还是对操 作生精细胞转录调节的基因芯片的充分了解 , 因为这 不是一个简单的大鼠 、 小鼠基因组的 在芯片上 的反应 , 此过程还涉及到 的长度 、 数量以及 稳定性 , 这些都是影响结果的因素 。 芯片技 术发展到今天不过短短几年时间 , 尽管还存在这样那 样的问题 ,但已在诸多领域呈现出广阔的应用前景 , 随 着研究的不断深入和技术的进一步完善 , 芯片一 定会在生命科学领域发挥出其非凡的作用 。 关键词 寡核昔酸序列分析 生殖生物学 不育 , 男性 中图分类号 参 考 文 献 , , , 刀口 一 , , , 一 , , , 一 , 肥 咖 , 民 “ 洲只 一 , , 一 , 一 , 一 , , , 一 , , , 一 , , , 一 邵晨 , 杨波 , 王禾 , 等 西安交通大学学报医学版 一 , , , 材。 一 , , , 甲 材口 一 , , , 一 , , , 一 , , , 一 , , , 、恤 , , , 一 , 、 , , 一 , , 瓦 , 一 , , , 从 一 , , , 一 助 而 , , , 一 一 一 收稿