不同激活方法对猪体外成熟卵母细胞孤雌发育的影响

畜牧兽医学报，2004，35(6)，615—620 Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica 不同激活方法对猪体外成熟卵母细胞 孤雌发育的影响 刘国世 ，曾申明H，吴中红 ，邢凤英 ，田见晖 ，林 平 ，姜午旗 ，刘敬浩 ，朱士恩 ，张忠诚 (1．中国农业大学动物科技学院，北京 100094；2．上海第二医科大学发育生物学重点，上海 200025) 摘 要：研究了猪体外成熟卵母细胞的电激活、离子霉素激活和乙醇激活的方法。3种不同激活方法筛选试验表 明，猪卵母细胞电激活最佳参数为电场强度130 V／min，脉冲时程8O s的1次脉冲激活，即130 V／ram一8O s一1次，其 囊胚(发育)率为18．92 士8．48 (P>O．05)；离子霉素激活的最佳条件为15~mol／L、激活时间40 rain，其囊胚率 为21．27 士8．54 (P>O．05)；乙醇激活最佳参数以9 乙醇激活处理3 rain，囊胚率为13．33 土7．64 。进一步 对比试验表明，电激活和离子霉素激活处理的囊胚率和囊胚细胞数无显著差异(P>0．05)，电激活的卵裂率明显高 于乙醇激活(P0．05)。 关键词：猪；卵母细胞；体外成熟；电激活；离子霉素激活；乙醇激活 中图分类号：$828．3；Q492．2 文献标识码：A 文章编号：0366—6964(2004)06—0615一O6 哺乳动物卵母细胞的孤雌激活及发育研究始于 19世纪3O年代。近十几年来随着核移植技术研究的 发展，孤雌激活研究也不断深入。受体卵母细胞的有 效激活，是核移植重构胚发育的关键。受体卵母细胞 激活及其发育能力研究，对提高核移植效率及进行 胚胎孤雌发育的研究有重要意义。卵母细胞激活方 法很多，可分为物理激活和化学激活，物理激活有电 脉冲、机械刺激、改变温度等；化学激活有钙离子载 体(A23187和离子霉素)、乙醇、乙基汞硫代水杨酸 钠、酶处理、改变渗透压、麻醉剂、蛋白合成抑制剂 (6-二甲氨基嘌呤6-DMAP、亚胺环己酮CHx、丁酸 内酯一1 BL一1、星形孢菌素)等。应用电激活[1 ]和化 学激活(离子霉素一6一DMAP)[4]已经获得了体细胞 核移植的活仔猪，但效率较低，仅为1 9／5～2 9／5。本研 究对猪的卵母细胞电激活、离子霉素和乙醇激活条 件进行了的筛选，以获得较佳的孤雌激活方法，为卵 母细胞成熟体系、胚胎发育体系的建立，以及体细胞 核移植试验提供有效激活参数。 1

材料

关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料

和方法 1．1 猪卵母细胞的采集与体外成熟培养 从屠宰场收集刚屠宰的猪卵巢，用16号针头的 收稿 日期：2003—1O-28 基金项目：中国博士后科学基金(2001年)资助 作者简介：刘国世(1972一)，男，山东即墨市人，博士，副教授，主要从 事动物配子和胚胎生物

工程

路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理

的教学与科研工作 *通讯作者：曾申明，E—mailtzengsm@cau．edu．ca 1O mL一次性注射器抽取卵巢表面直径 2～8 mm 的卵泡。成熟培养液为 NCSU23(或 TCM199)+ 1O 卵 泡 液 (PFF)+ 0．1 mg／mL 半 胱 氨 酸 + 10 ng／mL EGF+ 10 IU／mL PMSG+ 10 IU／mL hCG。成熟培养在 5 9／5 CO。的空气、38．5℃、饱和湿 度的二氧化碳培养箱(Forma，USA)条件下进行。 1．2 卵母细胞的孤雌激活 将培养44 h的卵丘一卵母细胞复合体(CoCs)移 入0．1 透明质酸酶中消化，震荡1 min，除去颗粒细 胞。电激活用电融合仪(Embryo cell fusion system， Fujira Industry Co．Ltd，Japan)进行。电激活：电激 活液为 0．3 mol／L甘露醇(D—mannitol，Sigma)， 0．05 mmol／L CaC12，0．1 mmol／L MgC12。激活后立 即 将 卵 子 移 入 NCSU23+ 4 mg／mL BSA + 7．5#g／mL细胞松弛素B+10 p．g／mL放线菌酮中 清洗并培养，4 h后移入NCSU23+4 mg／mL BSA 中培养6～7 d。离子霉素激活：卵子先移入15 L离 子霉素洗2遍，然后分别处理1O～70 min，或15～ 25 L离子霉素处理1O～40 min，再移入2 mmol／L 的DMAP清洗并培养 3．5 h，最后移入NCSU23+ 4 mg／mL BSA的发育液中培养6～7 d。乙醇激活： 将卵子分别移入不同浓度乙醇(含3 mg／mL BSA的 TL-HEPES配制)激活液中 5 min，再分别移入 2 mmol／L DMAP(NCSU23+4 mg／mL BSA配制) 培养 3．5 h，最后分别移入 NCSU 23+4 mg／mL BSA 培养 6～7 d。移入 9 乙醇中洗 2遍并处理 5 min，后分3种处理方法，前2种处理是将卵子分别 维普资讯 http://www.cqvip.com 616 畜 牧 兽 医 学 报 移入2 mmol／L DMAP培养3．5 h和7．5~g／mL细 胞松弛素B(CB，NCSU23+4 mg／mL BSA+7．5 ~g／mL细胞松弛素B+10~g／mL放线菌酮)中培养 4 h，然后分别移人NCSU23+4 mg／mL BSA培养 6～7 d；第3种处理是激活后的卵子直接移入NC— SU23+4 mg／mL BSA培养6～7 d。将卵子移入9％ 乙醇 中，分别处理不 同时间；然后，分别移入 7．5~g／mL CB培养3．5 h；最后分别移入NCSU 23 +4 mg／mL BSA培养 6～7 d。 在其它条件相同的情况下，用本试验筛选的 130 v／mm一80Vs一1次最 佳 电激 活条 件分 别与 15／~mol／L、40 min最佳离子霉素激活条件，以及 9％乙醇、3 min、CB—NCSU23最佳乙醇激活培养 条件对同一批卵进行激活和培养，44～48 h观察卵 裂情况，记录卵数和卵裂数；6～7 d观察囊胚情况， 记录囊胚数。最终比较它们之间卵裂率、囊胚率和囊 胚细胞数。 1．3 卵子激活后的发育培养 发育培养液为NCSU23+4 mg／mL BSA，每滴 5O L，可放 1O～15枚胚胎，上盖石蜡油，在 5％ Co 、38．5℃、饱和湿度的二氧化碳培养箱 中培养。 44～48 h观察卵裂情况，记录卵数和卵裂数；第6～ 7天观察囊胚情况，记录囊胚数。囊胚用10~g／mL Hoechst33342染色，压片，在荧光显微镜下，观察囊 胚 的内细胞团(ICM)和滋养层细胞(TE)的细胞核 数，统计囊胚的细胞数。 1．4 数据处理 试验数据用SAS软件 DUNCAN的AVONA 和GLM 的方差

分析

定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析

进行统计。试验每一次重复均 为同一批次试验，相同的卵巢来源和试验条件。 2 结果与分析 2．1 电激活参数的确定 不同脉冲次数对猪体外成熟卵母细胞激活后的 卵裂率和囊胚率差异不显著(P>0．05)，但2次和3 次脉冲处理的囊胚率低于1次脉冲处理；囊胚细胞 数之间无显著差异(P>0．05)，但1次比3次脉冲的 囊胚细胞数明显高(P0．05)，明显低于其它9种组合 (P 0．05)，即单次脉冲，场强在9O～150 V／mm之间、脉 冲时程在4O～16O s之间，卵母细胞激活后的囊胚 率差异不显著(P>0．05)。场强130 V／mm、脉冲时 程 4O～8O s处理的囊胚率较高，130 V／mm一80 s 处理的囊胚率最高。各处理的囊胚细胞数无显著差 异(P>0．05)。由此表明，130 V／mm一8O s一1次脉冲 是本试验的最佳电激活参数。 2．2 离子霉素(Ionomycin)激活条件的确定 15、2O和25 pmol／L的离子霉素对猪体外成熟 卵母细胞激活后的卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数无 显著差异(P>0．05)(见表3)。

说明

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在处理时间相同 的情况下，15～25／~mol／L离子霉素激活效果相似。 15／~mol／L离子霉素 7个时间处理组的卵裂 率、囊胚率和囊胚细胞数无显著差异(P>0．05)(见 表4)，囊胚率从 10 min处理的16．03 士7．78％升 高到40 rain处理的 21．27 9／5±8．54 ，再降低到 70 min处 理 的 14．18％土 7．12％。由 此 表 明， 15／~mol／L离子霉素40 min是本试验离子霉素激活 的最佳 方 法。130 V／mm一8O s一1次 电激 活 与 15／~mol／L、40 min离子霉素激活处理的卵裂率、囊 裹1 不同电脉冲次数对猪体外成熟卵母细胞孤雌激活效果的影响 Table 1 Effect of different times of pulse on parthenogenetic activation of in vitro matured porcine oocytes 。场强87 V／mm，脉冲时程40 s。Field strength 87 V／mm，pulse duration 40 s “此列括号是统计囊胚细胞数的囊胚数量。The numbers in the brackets are numbers of the blastocysts observed ⋯ 表内同列上标有不相同字母者差异差异显著(P0．05)，电激活 处理的卵裂率和囊胚率略高于离子霉素激活(见表 5)。由此说明，电激活效果要略优于离子霉素激活。 2．3 乙醇激活条件的确定 不 同浓度乙醇对猪卵子激活 5 rain处理后， 1％、3 、11 和13 9／i乙醇处理组没有发育到囊胚， 而 9 乙醇处理的囊胚率明显高于 5 乙醇(P< 0．05)，也略高于7 乙醇处理的囊胚率，但没有显著 差异(P>O．05)；5 、7 9／6和9 乙醇处理的囊胚细胞 数没有显著差异(P>0．05)，其中7 和9 的略高一 些(见表6)。因此，在激活时间相同的情况下，本试验 9 9／6乙醇处理的囊胚率最高，效果最好。 表5 电激活和离子霉素对猪体外成熟卵母细胞孤雌激活效果的影响 Table 5 Effect of electrical and ionomycin activations on parthenOgenetic activation of in vitro matured porcine oocytes 表6 不同乙醇浓度对猪体外成熟卵母细胞孤雌激活效果的影响 Table 6 Effect of different concentration of ethanol on parthenOgenetic activation of in vitro matured porcine oocytes 1 3 5 7 9 11 13 93 90 88 92 96 69 35 7．7l± 1．77 14．O3土 2．02 12．60土 2．84 30．43土4．8j 38．28土 9．39 43．47土 8．09 42．22土24．1l O O 1．96±3．39 3．23±3．23 6．26土3．O5 0 O 在相同乙醇浓度和处理时间，即 9 乙醇 5 min 处理的情况下，乙醇处理后的种培养条件的卵裂率、 囊胚率和囊胚细胞数均无显著差异(P>0．05)，但 CB—NCSU23处理组的囊胚率高一些(见表7)。因 此，本试验猪卵母细胞 乙醇处理后先移入CB(NC— SU23+CB+放线菌酮)，4 h后再移入 NCSU23+ 4 mg／mL BSA培养的效果最好。 9 乙醇3、5和11 rain对猪卵母细胞处理后的卵 裂率明显高于13 rain处理的卵裂率(PO．05)(见表8)。因此，在浓度相同的乙醇 激活下，3 min处理的效果最好。通过表6、表7和表8 结果统计分析说明，在乙醇激活中9％乙醇对猪体外 成熟卵母细胞处理3 min，之后移入CB液(细胞松弛 素B，NCSU 23+4 rng／mL BSA+7．5／zg／mL细胞 松弛素B+10／zg／mL放线菌酮)，4 h后再移入NCSU 23十4 mg／mL培养的囊胚发育率最高，效果最好，为 最佳乙醇激活条件。 在其它条件相同的情况下，电激活(130 V／ram一 8O／zs一1)的卵裂率明显高于乙醇激活(9 、3min)(P O．05)(见表9)。因此， 表7 不同培养条件对猪体外成熟卵母细胞乙醇激活效果的影响 Table 7 Effect of different culture conditions on ethanol activation in vitro matured porcine oocytes 培养条件 Cuhure condition 卵数 卵裂率／ 囊胚率／ 囊胚细胞数 N 0．of oocytes Rate of cleavage Rate of blastocyst No ． of cells in blastocysts DM AP— NCSU23 CB— NCSU23 NCSU23 89 80 85 2．52土 2．18 5．00土 1．80 1．59土2．75 23．5_--4-4．95 (2) 13．75±2．99 (4) 21．00 (1) i 2 3 6 ； r 4 O 1 1 8 _ 土 ± ± O 7 O O 6 O 00 0．05)，只是前者的囊胚 率略高(高出6．02 9／6)。因此，认为电激活的效果略好。 而Tao等口 和Koo等口 的试验发现，猪卵母细胞电 激活的囊胚率显著高于A23187／6一DMAP激活的囊 胚率。 本试验猪卵母细胞电激活的卵裂率显著高于乙 醇激活(乙醇／CB4-放线菌酮)卵裂率(P<0．05)，而 两者囊胚率和细胞数虽然统计学上无显著差异，但电 激活较高(分别高出8．21 和4．42 )。因此认为电 激活的效果好于乙醇激活。这与Jiang等I1 对大鼠的 研究结果一致。 参考文献： [-13 Polejaeva I A，Chen S H，Vanght T D，et a1．Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cellsE3]．Nature，2000，407：86～90． 维普资讯 http://www.cqvip.com 620 畜 牧 兽 医 学 报 35卷 E21 Onishi A，1wamoto M，Akita T，et a1．Pig cloning by ml’cro’lnj’ect’lon of fetal fibroblast nuclei[J]．Science， 2000，289：1188～ 1190． E31 [-43 1-51 [61 E71 Bondioli K R，Ramsoondar J J，Mamsoondar J J，et a1．Production of cloned pigs by somatic cell nuclear transferEJ]．Theriogenology，2002，57(1)：398(Ab— stract)． Betthauser J，Forsberg E，Augenstein M ，et a1．Pro— duction of cloned pigs from in vitro systems[J]．Na— ture Biotechnology，2000，18：1055~1059． Kure-bayashi S，Miyake M，0kada K，et a1．Success— ful implantation of in vitro．．matured electro．．activated oocytes in the pig[J]． Theriogenology， 2000， 53： 1105～ 1119． Lee S J,Pursel V G，Chung K S．Effects of fusion me— dia，voltage and micromanipulation on the activation of pig oocytes and blastomere development[J]．Theri— ogenology，1993，39：257． 李光鹏，孟庆刚，魏 鹏，等．蛋白质合成抑制剂亚胺环 [8] [9] [,lOI 己酮(CHX)对猪卵母细胞体外成熟的影响．动物学报， 2001，47(6)：684～690． Prochazka R，Kanka J，Sutovsky P，et a1．Develop— ment of pronuclei in pig oocytes activated by a single electric pulseI-J]．J Reprod Fertil 1992，96：725～734． Hyun S H，Lee G S，Kin D Y，et a1．Electrical activa— tion with or without chemical activation as an efficient method for parthenogenetic activation of pig oocytes [J]．Theriogenology，2001，55(1)：453． Tao T，Machaty Z，Boquest A C，et a1．Optimisation of porcine oocytes activation following nuclear transfer [J]．Zygote，2000，8(1)：69～77． [11]Koo D B，Kang Y K，Choi Y H，et a1．Developmental potential and transgenic expression of porcine nuclear transfer embryos using somatic cells[,J]．Mole Reprod De ve，2001，58：15～ 21． [121 Jiang J Y，Mizuno S，Mizutani E，et a1．Partheno— genetic activation and subsequent development of rat oocytes in vitroI-J]．Mol Reprod Dev，2002，61(1)： 】2O～ 】25． Effect of Different Activation Methods on the Development of Porcine Oocytes Matured in vitro LIU Guo—shi ，ZENG Shen—ming ，WU Zhong—hong ，XING Feng—ying。，TIAN Jian—hui 。 LIN Ping。，JIANG Wu—qi ，LIU Jing—hao ，ZHU Shi—en ，ZHANG Zhong—cheng。 (1．College of Animal Science and Technology，China Agricultural University，Beijing 100094，Chi，ln； 2．Shanghai Laboratory of Development Biology，Shanghai Second Medicine University，Shanghai 200025，China) Abstract：Electrical，ionomycin and ethanol activation of porcine oocytes matured itro were performed in this study to establish an effective activation protocol for parthenogenetic porcine oocytes ． Oocytes were parthenogenetically activated by one of three stimuli：(1)optimal electric(electrical field strength and the pulse duration 130 V／mm一80 s with blastocyst development rate of 18．92 -4-8．48 )，(2)optimal iono— mycin(15~mol／L ionomycin for 40 min with blastocyst rate of 21．27 -4-8．54 )，(3)optimal ethanol (9 ethanol for 3 min followed，resulting in blastocyst rate of 13．33％-4-7．64 )．It was proved that in the same circumstance no obvious difference existed in the blastocyst rate (32 ． 70 -4-13．55 9／6 vs． 26·58 -4-13．83 )and cell number of blastocyst between electrical activation(130 V／mm一80~s-1)and in— omycin activation(15~mol／L，40 min)．Moreover，electrical activation achieved higher(P<0．05)rate of post—actlvatlon cleavage than ethanol activation；the blastocyst rate(13．21 -4-6 ． 05 vs． 5．00 -4- 1．80％)and cell number of blastocyst showed no difference(P>O．05)．Therefore，among the three kinds of activation methods，electrical activation was the best ． Key words：porcine；oocyte；in vitro maturation；electrical activation；ionomycin activation；ethanol acti — vation 维普资讯 http://www.cqvip.com