HPLC法测定不同产地鬼臼类药材中鬼臼毒素的含量

China Pharmacy 2010 Vol. 21 No. 19 中国药房 2010年第21卷第19期 在我国，鬼臼类药材包括小檗科鬼臼亚科Dysosma versi- pellis（Hance.）M.Cheng Podophylloideae桃儿七属 Sinopodop- hyllum、山荷叶属Diphylleia、八角莲属Dysosma等3个属，各属 代药用植物分别有桃儿七 S. hexandrum（S. emodi（Wall. ex Royle）Ying）、南方山荷叶D. sinensis H. L. Li以及八角莲D. versipellis（Hance）M.Cheng。鬼臼类药材主要以干燥根茎入 药 [1]。主要成分鬼臼毒素为芳基四氢萘类木质素，具有抗肿 瘤、抗病毒等活性[2]，以及祛风除湿、活血止痛、镇咳平喘等功 能[3]。鬼臼类药材因其多种植物来源而导致异名繁多、品种混 用现象比较严重，屡有因用法用量问题而引发中毒事件[4]。鬼 臼毒素为其主要毒性成分，不同产地药材中鬼臼毒素含量差 异较大，鬼臼类药材饮片中毒剂量从几克到几十克不等[5]。为 了比较不同产地鬼臼类药材的毒性大小，本试验用高效液相 色谱（HPLC）法测定不同产地鬼臼类药材中鬼臼毒素的含量， 以为临床安全合理用药提供依据。 1 仪器与试药 Ultimate 3000型HPLC仪，包括四元梯度泵、自动进样器、 紫外检测器（美国戴安公司）；Chromeleon软件数据处理系统。 甲醇为色谱纯，水为纯化水，氯仿、磷酸二氢钾为 纯；鬼臼毒素对照品（中国药品生物制品检定所，批号： 111645- 200301）；鬼臼类药材分别采于湖北、重庆、云南等 地，由郧阳医学院药学系生药教研室陈吉炎教授提供并鉴定 为真品。 2 方法与结果 2.1 供试品溶液的制备 精密称取各样品粉末（过2号筛）1 g，置于250 mL锥形瓶 中，加氯仿 50 mL，回流提取 1 h，过滤，滤液挥干，残渣用甲醇 溶解，定容于50 mL容量瓶中，备用。 2.2 对照品溶液的制备 精密称取在五氧化二磷干燥器中减压干燥12 h的鬼臼毒 素对照品 10 mg，置于 10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至 刻度，摇匀，备用。 2.3 色谱条件 色谱柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），前加预柱 （10 mm×4.6 mm）；检测波长：290 nm；柱温：30℃；流动相：甲 醇- 0.1 mol·L- 1磷酸二氢钾（45 ∶55）；流速：1.0 mL·min- 1。色谱 图见图1。 HPLC法测定不同产地鬼臼类药材中鬼臼毒素的含量 赵祖兴 1，2＊，杨光义 2 #，陈吉炎 2，叶 方 2，郝新才 2（1.湖北中医学院药学院，武汉市 430061；2.郧阳医学院附属 太和医院，十堰市 442000） 中图分类号 R284.1；R927.2 文献标识码 A 文章编号 1001- 0408（2010）19- 1784- 02 摘 要 目的：建立以高效液相色谱法测定不同产地鬼臼类药材中鬼臼毒素含量的方法。方法：色谱柱为Diamonsil C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇- 0.1 mol·L- 1磷酸二氢钾（45 ∶ 55），检测波长为290 nm，柱温为30℃，流速为1.0 mL·min- 1。结果：不 同产地鬼臼类药材所含鬼臼毒素的量差异较大，其中以产自湖北竹溪的山荷叶含量最高，产自湖北房县的六角莲含量最低（二者 含量相差近4倍）。结论：不同产地、不同品种的鬼臼类药材中鬼臼毒素含量不同，故各地的中毒剂量不同。 关键词 鬼臼毒素；高效液相色谱法；鬼臼亚科；含量测定 Content Determination of Podophyllotoxin in Podophylloideae from Different Habitats by HPLC ZHAO Zu-xing（School of Pharmacy，Hubei College of Traditional Chinese Medicine，Wuhai 430061，China） ZHAO Zu-xing，YANG Guang-yi，CHEN Ji-yan，YE Fang，HAO Xin-cai（Taihe Hospital of Yunyang Medical College，Shiyan 442000，China） ABSTRACT OBJECTIVE：To establish HPLC method for the content determination of podophyllotoxin in podophylloideae col- lected from different habitats. METHODS：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）was used with methanol- 0.1 mol·L- 1 KH2PO4 （45 ∶ 55）as mobile phase at a flow rate of 1.0 mL·min- 1. The detection wavelength was set at 290 nm and column temperature was 30℃ . RESULTS：The contents of podophyllotoxin in podophylloideae form different habitats were different from one another， among which the content of podophyllotoxin in Diphylleia sinensis from Zhuxi in Hubei province was the highest while that in Dys- osma pleiantha from Fangxian in Hubei province was the lowest（difference between two kinds of plants of nearly 4 times）. CON- CLUSION：The contents of podophyllotoxin are different because of the different species and regions. The dose of podophyllotoxin which induce toxicosis is different. KEY WORDS Podophyllotoxin；HPLC；Podophylloideae；Content determination ＊硕士研究生。研究方向：中药鉴定与新制剂开发。E- mail：sa- wyer988@126.com #通讯作者：讲师，主管药师，博士。研究方向：中药资源开发和新 药开发。E- mail：ygy996@163.com ··1784 中国药房 2010年第21卷第19期 China Pharmacy 2010 Vol. 21 No. 19 2.4 方法学考察 2.4.1 线性关系考察：精密量取鬼臼毒素对照品溶液1.0、2.0、 3.0、4.0、5.0 mL，分别置于 10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻 度，摇匀，按“2.3”项下色谱条件测定峰面积。以峰面积积分值 （Y）为纵坐标，鬼臼毒素含量（X）为横坐标，制备曲线，得 回归方程为Y＝85.285 9X+1.688 1（r＝0.999 8）。结果表明，鬼 臼毒素的进样量在 0.156～1.3 mg·mL- 1的范围内与峰面积积 分值呈良好的线性关系。 2.4.2 精密度试验：精密吸取鬼臼毒素对照品溶液 10 μL，重 复进样5次，测定。结果，RSD＝0.002 6％，表明仪器精密度良 好。 2.4.3 稳定性试验：取供试品溶液，分别于配制后0、2、5、8、10 h进样。结果，RSD＝0.011 4％（n＝5），表明供试品溶液在10 h 内检测对结果无影响，稳定性良好。 2.4.4 重复性试验：按“2.5”项下方法操作，对同一样品重复测 定 6次，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 10 μL。结 果，RSD＝0.42％，表明方法重复性良好。 2.4.5 加样回收率试验：精密称取已测含量的样品，分别精密 加入低、中、高浓度的对照品，按“2.1”项下方法制备供试品溶液， 按上述色谱条件测定。结果，其平均回收率为100.06％，RSD＝ 1.99％，说明该测定方法可行。加样回收率试验结果见表1。 表1 加样回收率试验结果（n＝9） Tab 1 Results of recovery test（n＝9） 取样量 /g 0.480 9 0.480 9 0.480 9 0.580 3 0.580 3 0.580 3 0.598 6 0.598 6 0.598 6 样品含量 /mg 14.6 14.6 14.6 17.7 17.7 17.7 18.2 18.2 18.2 加入量 /mg 12.6 12.6 12.6 17.1 17.1 17.1 20.1 20.1 20.1 测得量 /mg 27.1 27.6 27.1 35.3 34.3 34.7 38.6 38.1 38.1 回收率 /％ 99.21 103.17 99.21 102.92 97.08 99.42 101.49 99.00 99.00 x /％ 100．06 RSD /％ 1．99 2.5 样品含量测定 精密量取对照品溶液及供试品溶液各10 μL进样，以外标 一点法计算鬼臼毒素含量。药材样品来源、编号及鬼臼毒素 含量测定结果见表2。 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 min B 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 min A 图1 高效液相色谱图 A.鬼臼毒素对照品；B.供试品 Fig 1 HPLC chromatograms A. podophyllotoxin control；B. test sample 表2 药材样品来源、编号及鬼臼毒素含量测定结果 Tab 2 Source and number of podophylloideae and content determination of it 编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 样品来源 购自湖北十堰，产地重庆 购自湖北郧县白桑，产地湖北竹溪 购自湖北十堰，产地云南 购自湖北十堰，产地重庆 购自湖北房县，产地湖北房县 采自湖北房县桥上乡三座淹村大峡沟 购自湖北十堰，产地重庆 清大药业代购，产地湖北竹溪 清大药业代购，产地湖北竹溪 购自湖北十堰，产地重庆 鉴定结果 八角莲D. versipellis M. Cheng 南方山荷叶D. sinensis H. L. Li. 南方山荷叶D. sinensis H. L. Li. 八角莲D. versipellis M. Cheng 八角莲D. versipellis M. Cheng 六角莲D. pleiantha Woods. 南方山荷叶D. sinensis H. L. Li. 南方山荷叶D. sinensis H. L. Li. 南方山荷叶D. sinensis H. L. Li. 南方山荷叶D. sinensis H. L. Li. 含量/g·g- 1 0.141 8 0.537 1 0.398 2 0.160 3 0.153 6 0.139 6 0.338 0 0.314 4 0.294 4 0.470 9 保留时间/min 33.443 33.396 33.040 33.574 33.296 33.120 33.353 33.116 32.790 33.296 3 讨论 10批样品的测定结果表明，鬼臼毒素含量最多的依次是 产地湖北竹溪的南方山荷叶、产地重庆的南方山荷叶、产地云 南的南方山荷叶，含量最少的是产地湖北房县的六角莲。 不同产地、不同品种的鬼臼类药材所含鬼臼毒素差异较 大，故用生药材入药时，各种药材的中毒剂量也有差异。 参考文献 [ 1 ] 马绍宾，胡志浩.小檗科鬼臼亚科的地理分布与系统发育 [J].云南植物研究，1997，19（1）：48. [ 2 ] 尚明英，徐珞珊，李 萍，等.鬼臼类中药及其木脂素类成 分的药效学研究[J].中草药，2002，33（8）：722. [ 3 ] 肖培根编.新编中药志（第1卷）[M].北京：化学工业出版 社，2002：1. [ 4 ] 张三全，曾 抗，李国峰，等.动物实验对脂质体鬼臼毒素 外用的安全性观察[J].临床皮肤科杂志，2003，32（4）： 188. [ 5 ] 杨光义，杜士明，黄良永，等.鬼臼类中药毒理学研究进展 [J].中国药房，2008，19（36）：2 872. （收稿日期：2009- 06- 02 修回日期：2009- 07- 11） 《中国药房》杂志——《文摘杂志》（AJ）收录期刊，欢迎投稿、订阅 ··1785