氧化应激在肝纤维化发展过程中的作用_李丰衣

收稿日期:2011 － 11 － 24 基金项目:国家“十一五”重大科技专项资助项目(2008ZX10005 － 008) ;山东省自然科学基金青年基金资助项目 (Q2005C04) 作者简介:李丰衣(1974 －) ，吉林长春人，博士，研究方向:中西医 结合治疗感染性疾病临床科研。 通讯作者:聂为民(1970 －) ，天津人，副主任医师，硕士，研究方向: 感染性疾病临床及科研。 时，结晶产物较多，但也出现一定程度的乳化现象，故综合 考虑，以反应温度在 50℃左右为宜。 酶解法反应时间与产物的量呈正相关，时间越长，栀子 苷元的产量也越大，但是反应时间过长，从 2． 5h后，萃取就 比较难以实现，3h、4h乳化现象非常严重，难以达到油水分 离，较难实现栀子苷元的制备。为了提高栀子苷元得率和 操作的可行性，反应时间选择 1． 5 ～ 2h为宜。 在考察 pH值的影响作用过程中，当 pH值为 8 的缓冲 溶液，乳化非常严重，不易分离，未得到结晶;pH 值为 3． 8 的缓冲溶液，无结晶析出。故以 pH 值为 5． 7 ～ 4． 3 范围内 进行实验考察。 参考文献 ［1］ 国家中医药管理局《中华本草》编委会．中华本草［M］．上海: 科学技术出版社，1998:15 － 29． ［2］ 朱振家，钱之玉，陆莉华，等．栀子提取京尼平苷和西红花苷 利胆作用的研究［J］．中草药，1999，30(11) :8 － 41． ［3］ 彭婕，钱之玉，刘同征．京尼平苷和西红花酸保肝利胆作用的 比较［J］．中国新药杂志，2003，12(2) :105 － 108． ［4］ Yim JS，Kim YS，Moon SK，et a1． Metabolic activities of ginsen- oside Rbl，baicalin，glyeyrrhizin and geniposide to their bioactive compounds by human intestinal microflora ［J］． Biol Pharm Bull，2004，27 (10) :l580 － l583． ［5］ 国家药典委员会．中华人民共和国药典:1 部［S］．北京:化学 工业出版社，2005:173． 第 30 卷 第 4 期 2 0 1 2 年 4 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 30 No． 4 Apr． 2 0 1 2 中 华 中 医 药 720 学 刊 氧化应激在肝纤维化发展过程中的作用 李丰衣1，张琳2，3，聂为民1 (1．解放军第三〇二医院感染性疾病诊疗与研究中心，北京 100039; 2．解放军第三〇二医院全军中药研究所，北京 100039;3．成都中医药大学，四川 成都 610075) 摘 要:肝纤维化是各种原因所致的肝损伤在组织修复过程中的一种代偿反应，以细胞外基质过量沉积为病 理特征。诸多肝损伤因素在其致病过程中均不同程度地伴有氧化应激，这些病因不祛除、长期作用于肝脏即可导 致肝纤维化乃至肝硬化。近年来，氧化应激与肝纤维化，特别是肝星状细胞活化的关系日益受到关注。就氧化应 激在肝纤维化发生、发展中的作用机制作一综述。 关键词:氧化应激;肝纤维化;肝星状细胞;活性氧 中图分类号:R657． 31 文献标识码:A 文章编号:1673 － 7717(2012)04 － 0720 － 03 Effect of Oxidative stress on liver fibrosis LI Feng-yi1，ZHANG Lin2，3，NIE Wei-min1 (1． Clinical ＆ Research Center for Infectious Diseases，302 Hospital of PLA ，Beijing 100039，China; 2． PLA Institute of Chinese Materia Medica，302 Hospital of PLA，Beijing 100039，China; 3． Chengdu University of TCM，Chengdu 610075，China) Abstract:Liver fibrosis was a compensation reaction，characterized by mass ECM deposition，coming from the repa- rative process of live tissue when the live was injured by various reasons． In the pathogenic course，oxidative stress was involved in a different degree which would lead to hepatic fibrosis，even cirrhosis，if long affected the liver and could not been eliminated． In recent years，the relationship between the oxidative stress and hepatic fibrosis，especially and the ac- tivated HSC，has been paid much more attention． The article summarized the mechanism how oxidative stress affected the occurrence and development of liver fibrosis． Key words:oxidative stress;liver fibrosis;hepatic stellate cells;reactive oxygen species 氧化应激(oxidative stress，OS)是指机体或细胞内活 性氧(reactive oxygen species，ROS)过度产生和 /或抗氧化 防御功能减弱，引起两者之间平衡严重破坏，造成组织、细 胞损伤的一种状态。肝纤维化是肝脏对各种慢性损伤的一 种修复性应答，肝纤维化的主要病理改变是细胞外基质 (ECM)成分的过度合成与异常沉积，肝星状细胞(HSC)活 化、增殖是肝纤维化形成的中心环节［1］。近年来，氧化应 激与肝纤维化，特别是 HSC 活化的关系日益受到关 注［2 － 3］。几乎所有临床和实验性肝纤维化都被证实与氧化 应激有关［4 － 6］，而且抗氧化剂可以减慢或阻止肝纤维化的 发展［7］。Zhong等［8］应用腺病毒转染 SOD 基因大鼠制造 胆道结扎肝损害模型发现，转基因组血清丙氨酸氨基转移 027 第 30 卷 第 4 期 2 0 1 2 年 4 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 30 No． 4 Apr． 2 0 1 2 中 华 中 医 药 721 学 刊 酶(ALT)较野生型降低 70%，肝组织灶性坏死、凋亡和肝 纤维化程度均明显减轻，脂质过氧化产物壬烯(HNE)、NF － КB 活性、TNFα和 TGFβ1 水平均明显降低，一方面表明 氧化应激参与肝脏损伤的多个环节，另一方面表明增加抗 氧化剂可明显减轻肝损害以及肝纤维化。本文就氧化应激 在肝纤维化发生、发展中的作用机制作一综述。 1 氧化应激与脂质过氧化 肝细胞损伤的具体机制仍未完全阐明。一个潜在的 生物化学机制是促氧化物增多、抗氧化物减少的氧应激对 细胞生物大分子产生脂质过氧化性损伤［9］。脂质过氧化 系指氧应激增强使 ROS 产生增多，导致 ROS 氧化生物 膜，即 ROS 与膜磷脂的多不饱和脂肪酸发生氧化反应形 成脂质过氧化物(lipoperoxides，LPO)。脂质过氧化的增 加来自持久、大量 ROS 的产生。LPO 不仅使 ROS 增加， 毒性增强，而且可抑制抗氧化系统，削弱细胞防御机制， 增加其对外源性过氧化物毒害的敏感性［10］。脂质过氧化 可直接损害细胞膜并导致细胞死亡。LPO 可激活肝星状 细胞(hepatic stellate cells，HSC)和 Kupffer 细胞，促进肝 纤维化［11］。 NO是氧化应激损伤的主要自由基之一，肝脏的各种 细胞都具有生成 NO 的功能，包括肝细胞、肝巨噬细胞、肝 窦内皮细胞、肝星状细胞等。Hassan等［12］研究埃及人丙型 肝炎病毒(HCV)所致肝硬化病人血清 NO水平，NO水平随 肝硬化程度加重(Child’s 分级)而逐渐增加，并且 HCV RNA和病毒负荷均与 NO 水平成正相关，提示 NO 水平和 肝硬化发生发展的不同阶段有关。 氧应激通过脂质过氧化对细胞膜和主要细胞器，如线 粒体和微粒体进行持续性打击。氧应激可引发炎症反应， 包括分泌炎性细胞因子，如 TNF － α、白细胞介素(IL)－ 8 和细胞间黏附分子(ICAM) － 1 等。脂质过氧化的终产物 也是炎性细胞的有效化学诱导剂［10］。 2 氧化应激引起线粒体和微粒体损伤 ROS 使肝实质细胞和 Kupffer 细胞释放 TNF － α，TNF － α可直接损伤线粒体呼吸链，从而导致线粒体细胞色素 氧化酶的损伤，阻断呼吸链传递电子。而呼吸链的任何部 位被阻断均可增加 ROS 的产出，增加的 ROS 进一步增加 氧化性脂质沉积，引起更多的脂质过氧化，抑制呼吸链的 电子传递，形成一个恶性循环［13］。另一个恶性循环是抗 氧化物质的消耗。脂肪变性导致的脂质过氧化和 ROS 能 消耗抗氧化酶、谷胱甘肽(GSH)和维生素 E，这些保护性 物质的消耗增强了 ROS 对线粒体的效应［13 － 14］。 细胞色素 P4502E1(cytochrome P4502E1，CYP2E1)导 致的氧化应激、GSH 稳态与线粒体损伤导致的细胞死亡之 间存在潜在联系［15］。CYP2E1 是脂肪酸氧化的微粒体氧化 酶，能降低分子氧含量，产生促氧化物，此作用如果不被 有效的抗氧化剂阻断，就可产生氧化应激。Brunt等［16］使 用抗 CYP2E1 血清或抑制 CYP2E1 活性的化学抑制物可阻 断氧应激，对细胞起保护作用，补充抗氧化剂亦可提供保 护作用。而且在人肝脏实验性 NASH 模型中，CYP2E1 分 布在小静脉周边区域，与肝细胞损伤最严重的部位相一 致。证明微粒体中的氧化应激可引起细胞损伤。 3 氧化应激与细胞因子 脂质过氧化物可以活化 Kupffer细胞，分泌多种细胞因 子，继而激活 HSC。慢性病毒性肝炎患者氧化应激损伤常 伴有致纤维化因子—肿瘤坏死因子 α(TNF － α)和转化生 长因子 β(TGF － β)升高，TGF － β在肝组织有轻度炎症时 即升高，并与组织损伤及纤维化程度直接相关［17］。细胞因 子影响肝脏的炎症、纤维化和细胞死亡，调节 ASH/NASH 的发生和发展，并且介导和 ASH/NASH 有关的许多代谢改 变，如胰岛素抵抗、脂代谢改变、食欲紊乱、发热和中性粒细 胞增多等［18］。NF － κB 是一种重要的转录调节因子，可在 免疫刺激和促炎症反应中上调基因表达。如在氧应激过程 中，NF － κB 可上调 TNF － α和 CINC 的转录，从而激活炎 性细胞。而 TNF － α 和 CINC 有激活 Kupffer 细胞的作用。 TNF － α首先激活 Kupffer 细胞，CINC 促进中性粒细胞的 转移，也可提高 ROS 的产出。TNF － α 和 CINC 的来源包 括肝实质细胞和非实质细胞。与巨噬细胞和内皮细胞相 比，肝实质细胞产生和分泌 TNF － α和 CINC 的量较低，但 暴露于过氧化氢(H2O2)条件下时，肝实质细胞分泌 TNF － α 和 CINC 增多，尽管机制尚不明确，但与氧应激有 关［19］。除了细胞因子和化学因子，LPO 亦被证明可激活 Kupffer 细胞。 4 氧化应激与 HSC 活性氧、超氧阴离子等在体内产生的自由基通过脂质 过氧化作用而损伤、破坏肝细胞，产生脂质过氧化物 MDA 和 4 －壬烯(HNE)等，可直接激活 HSC，介导 HSC的分化、 增殖和胶原的合成［20 － 21］。Baroni等［22］将大鼠的 HSC暴露 于从遭氧化打击的肝细胞中提取的介质，I 型胶原合成增 加，而抗氧化剂可以阻断这一过程。由此说明脂质过氧化 物在 HSC激活中有重要性。Lee 等［23］已证明氧应激导致 HSC 增殖，胶原合成增加与转录因子核因子(NF)－ κB 和 c － myb(可调节哺乳动物的基因表达)的诱导作用有关。 氧应激可启动 HSC 的活化，并可刺激 NF － κB 活动和 c － myb 表达，此作用可被抗氧化剂所阻断。NF － κB 转录因 子为氧化还原敏感因子，其激活可以增加 NO，使 ROS产生 增加，ROS 又参与 OxLDL 的形成，后者可激活 NF － κB， 形成恶性循环，介导氧化应激［24］。Parola 等［25］报道 HNE 与人 HSC c － jun氨基末端激酶的同分异构体 P46 和 P54 形成加合物，导致细胞核转位和信号分子的激活，反过来 又诱导信号分子 c － jun 和激活蛋白(AP) － 1 的活化。 Svegliati － Baroni 等［26］的实验证明 HSC 的 Na + /H +交换对 氧应激诱导的 HSC 增殖和胶原合成具有调节作用。 5 氧化应激激活 Kupffer 细胞 ROS可直接或间接作用于肝细胞，导致基因转录和转 位，改变其细胞膜和亚细胞器的结构使其变性、坏死造成肝 细胞损伤、坏死、凋亡及肝组织炎症反应，产生大量的炎症 介质及细胞因子，进一步激活 Kupffer 细胞。Kupffer 细胞 分泌的细胞因子、炎症介质再作用于肝细胞，进一步加重其 损伤［17，27］。Kupffer 细胞激活后产生大量 ROS，引发细胞 外氧应激，这种 Kupffer 细胞来源的细胞外氧应激可直接引 起肝细胞坏死。Kupffer 细胞的其他产物，如 H2O2、一氧 化氮(NO)以及各种细胞因子可对肝细胞产生很大的毒性 127 第 30 卷 第 4 期 2 0 1 2 年 4 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 30 No． 4 Apr． 2 0 1 2 中 华 中 医 药 722 学 刊 作用。Diehl［28］观察到 TNF － α 及其受体 P55 在非酒精性 脂肪肝中的表达与疾病严重程度呈正相关，而且 TNF － α 可诱导肝细胞线粒体解偶联蛋白(UCP － 2)基因的表达， 而 UCP － 2 可抑制线粒体内三磷酸腺苷(ATP)的产生，导 致细胞坏死。此外，Kupffer 细胞可产生一系列可溶性细胞 因子，参与 HSC 的激活和增殖。 脂质过氧化产生的醛类不仅参与 Kupffer 细胞激活，还 可活化信号转导通路． 巨噬细胞坏死后产生的碎屑、摄入的 铁、ROS的刺激和弥散的醛均为 Kupffer 细胞激活以及巨噬 细胞再募集的始动因子。这些巨噬细胞是炎症反应的关键 调节因素，长时间大量存在时，可通过产生各种细胞因子，生 长因子及前列腺素等多种活性分子，促进肝纤维化形成。 氧化应激是肝纤维化发生、发展的重要因素之一，其机 制尚未完全明确，深入研究 ROS在肝纤维化形成过程中的 作用机制，有助于临床上对肝纤维化的治疗。 参考文献 ［1］ Friedman SL，Maher JJ，BissellDM． Mechanisms and therapy of hepatic fibrosis:report of the AASLD single topic basic research conference［J］． Hepatology，2000，32 (6) :1403 － 1408． ［2］ Yesilova Z，Yaman H，Oktenli C，et al． Systemic markers of lipid peroxidation and antioxidants in patients with nonalcoholic Fatty liver disease［J］． Am J Gastroenterol，2005，100 (4) :850 － 855． ［3］ Svegliati － Baroni 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