脑组织

脑组织 1 动物处死2min内取脑组织，选取视交叉后Imm至乳头体之间的脑组织，首先冠状位向后取2mm的厚度，4%多聚甲醛溶液固定，按照常规脱水、透明、石蜡包埋，切片后进行HE染色 2 暴露出大鼠脑组织，用眼科剪轻轻剪断脑底各相连神经，取出完整组织，放入4%多聚甲醛中固定48一72小时。 腓肠肌 1 取腓肠肌，用4℃预冷的生理盐水清洗，去除血污，滤纸吸干水分，锡箔纸包裹做好标签，浸入液氮3Omin后放入一80℃超低温冰箱冷冻。 2 左后肢腓肠肌内侧头中下部1/3处快速取约0.5g组织，用冰生理盐水洗去浮血，剔除脂肪及结缔组织，液氮速冻后置于一80℃低温冰箱保存以备提取RNA。 3 在左后肢胖肠肌内侧头中下部1/3处快速取下约0.5x0.5xlm3肌组织，入4%中性多聚甲醛固定液中固定，以备光镜组织切片的制备。在每组12只动物中随机取3只动物左后肢腓肠肌内侧头中下1/3处约0.5x0.5x0.1cm，组织块，立即入3%戊二醛固定液中固定，以备透射电镜切片的制备。余下的肌肉经液氮冷冻后，置于一80℃低温冰箱保存待测。 4 取双下肢排肠肌，深层腓肠肌放入高压灭菌的冻存管中，于液氮中暂存，编号后置于一80℃冰箱中保存备用于mRNA及蛋白测定。取一小部分组织置于20%中性福尔马林中充分浸泡24小时后，常规石蜡包埋，切5um厚的切片，留测病理及免疫组化指标。取lm³的组织置于电镜液电留测电镜，其余大部分排肠肌组织置于4℃线粒体提取介质中，以备提取骨骼肌线粒体。 股四头肌 1 取出下肢股四头肌，生理盐水漂净血渍后滤纸蘸干，迅速放入-70℃液氮中保存 2 取大鼠左侧股四头肌股直肌深层肌肉约200mg，放入无菌EP管，液氮冻干，-70℃冰箱保存，待测骨骼肌分子生物学指标。 3 取右侧部分股四头肌股直肌，先经异戊烷处理，再用液氮冻干，-70℃冰箱保存，待做骨骼肌冰冻切片 4 完整剥离双侧腓肠肌，冰盐水冲洗，滤纸吸干，电子天平称重。取少许左侧腓肠肌组织约300mg，按照1：9（W/V）的比例加入4℃生理盐水，然后在冰浴中电动匀浆、超声粉碎(4次，10s／次，间隔10s)，4℃离心（12000 rpm）15min，取上清，-30℃保存待肌肉组织生化指标。 5 取出股四头肌，于冰生理盐水中洗净血液，装入样品管中，并迅速将之放入一84度超低温冰箱中。 6 开胸心脏放血，提取股四头肌组织，PBS溶液冲洗。切取适量股四头肌组织置4%多聚甲醛中固定备作石腊切片。剩余的股四头肌组织迅速放入-70℃冰箱保存。 7 大鼠股四头肌置15%中性福尔马林固定24h以上，脱水包埋:器官经改刀后置于15%甲醛中24h以上，70%乙醇30h，80%乙醇24h，95%乙醇5h，100%乙醇1h，苯15min，软蜡30min、硬蜡90min、石蜡包埋 8 取小鼠右腿的股四头肌后，用滤纸吸去残留血液，称重，记录股四头肌重量，用EP管封闭后直接投入液氮，再转移至一80℃超低温冰箱保存.以备用于RT一PCR测MHC四种亚型的基因表达。 9 迅速取部分股四头肌以10%多聚甲醛固定，待光镜观察、免疫组织化学；部分以4%戊二醛固定，待电镜观察。 血管 1 在无菌条件下取出主动脉弓至肾动脉一段，放入PBS液中。然后再移入超净台，放入培养皿，剥离血管，沿纵轴切开，摊平，充分暴露内膜，刮取内膜，将内膜组织移入EP管，加入0.smlRNA裂解液(6mol八)，放入冰箱4℃保存 2 在无菌条件下取出主动脉弓至肾动脉一段，放入10%福尔马林中固定，梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，浸腊、包埋，待切片。 3 打开胸腔分离并剪下主动脉，去除周围过多的结缔组织，切取胸主动脉上段10%PBS甲醛固定用于组织学检测；中段，取6mm宽血管条，观察其收缩舒张反应性;下段，液氮贮存，用于测定AGEs、MDA含量，SOD、NOS活性，eNOS、VCAM一1蛋白表达等。 4 取主动脉弓-70℃保存，同时部分主动脉弓置入4%多聚甲醛固定液中固定，待光镜、免疫组化检测 5 分离背部大血管，固定于10%甲醛，经石蜡包埋后切片备用，行HE染色 6 快速分离胸主动脉，冰生理盐水洗净后，一部分置入液氮中保存，用作AGEs、原位杂交、荧光定量PCR等检测；剩下部分主动脉置入福尔马林中固定用作免疫组化及病理检测。 7 找到并分离胸主动脉剪断，可见大鼠心脏仍呈窦性搏动，自主动脉根部游离整个心脏，迅速移入预冷的生理盐水漂洗血液，取出吸干后迅速在分析天平上称重，精确至0.00019。取胸主动脉长约3一4cm，心肌大小约Icm3迅速放入甲醛留作HE染色用，取胸主动脉长约Icm，lmm3大小左心室置入戊二醛溶液的小瓶中，送电镜检查。 心 1 切取大鼠心脏，去除结缔组织和心房部位，心室称重，用10%甲醛溶液固定用于组织学检测。 2 大鼠心尖部称重后立即加入固定液(4%多聚甲醛/0.IMPBS)中，已固定好的组织经梯度酒精脱水(70%一80%一90%一100%)、二甲苯透明、石蜡包埋，切片厚度5um，裱于用防脱片剂处理过的干净载玻片上，置于60℃恒温箱内烤片12小时，以备用于HE染色；于左心室取1xlx1mm，的心肌组织放入2.5%的戊二醛中固定，4℃保存，送电镜观察。 3 取心脏、肾脏、脾脏组织，用PBS冲去残留血液,用10%甲醛固定,石蜡包埋后，切成5μm厚的小块，制成石蜡切片,进行苏木精Hematoxylin&伊红Eosin(HE)染色,在光学显微镜下观察并照相。 4 取心肌组织0.2g，加入1ml预冷的裂解液，冰水浴中匀浆，4℃静置1hr，然后4℃离心13000rpm，30min，取上清于-20℃保存。应用Pierce公司的蛋白定量测定试剂盒测定蛋白浓度。 5 立即取胰岛、心脏、肾脏组织,用4%的多聚甲醛及2%、5%的戊二醛固定后,组织块再经锇酸缓冲液、醋酸双氧铀固定,丙酮梯度脱水,Epon812环氧树脂包埋,ULTRACUT E/S型超薄切片机切片,醋酸双氧铀-柠檬酸铅染色,Philips EM400T型透射电镜观察。 6 取左室中段横截面心肌组织，宽度约2mm，10%甲醛溶液固定，余下的心肌组织放入无菌冻存管中，保存于一80℃冰箱 7 将处死的大鼠置于冰上，迅速剪开胸腔，用生理盐水冲洗心内血液，迅速取左J自室心肌，将其切成1mm*1mm*1mm左右的组织块，放入3%的戊二醛固定液(用于电镜检测)。再分别切取3块3mmx3mm只3mm大小的心肌组织，分别浸入10%甲醛溶液(HE染色用)，BOUIN固定液(Masson3色染色用)，Carnoy氏液固定(PAS染色用)，其余心肌组织去除心耳及多余组织放入I0mlEP管中，一80℃冰箱中保存备用。 肝 1 将修整好的小块肝脏组织用生理盐水清洗后，立即投入4%甲醛中固定24h 2 用1%戊巴比妥钠麻醉处死大鼠，迅速摘取肝组织数块，剪成1mm×1mm×1mm大小，置2.5%戊二醛磷酸盐缓冲液中固定2小时，0.1mmol/L磷酸缓冲液漂洗2次各20分钟，1%锇酸后固定2小时，0.1mmol/L磷酸缓冲液漂洗后置梯度序列的乙醇中梯度脱水，纯环氧树脂包埋后，置80℃恒温箱内聚合10小时，修整包埋块，应用德国产Leica Ultracutuct切片机超薄切片，醋酸双氧铀-枸橼酸铅双染色各10分钟，置FEITecnai G212型透射电镜下观察照相。 3 称取100mg肝脏组织剪碎，置于含新鲜配制的1ml冰Western细胞裂解液的匀浆器中，冰浴匀浆至组织完全裂解；组织匀浆于预冷的离心机中在4℃下12,000 g离心20分钟，弃沉渣后留取上清，上清液立刻转移入新的Ep管中保存待用 4 取肝脏组织的小叶部分，固定于4%的多聚甲醛中，用于病理学检测；其余部分在液氮中速冻后保存于一 70℃待用。 5 称取肝湿重，迅速摘取肝右叶组织0.5g，放入预冷的生理盐水溶液中，在4℃下制成10%肝匀浆，3000r/min，离心10min，取上清液。另取肝左叶，浸泡于10%中性甲醛缓冲掖中固定，石蜡包埋，常规制片，HE染色，光镜下观察肝组织形态变化。 6 在肝脏最大叶边缘0.5cm处取小块肝组织冰生理盐水冲洗，滤纸吸干，称取0.5g置于预冷的5ml生理盐水，迅速用内切式匀浆机10000r/min匀浆10秒/次，间隙30秒，连续3次，碎冰块中制成10%的肝匀浆，再用高速冷冻离心机4℃，3000r/min离心10分钟，取上清3ml密封，一20℃冷存待检。另在肝脏不同部位分别取1xlx0.5cm大小肝组织3块，浸泡于10%甲醛固定液固定，送病理科检查。 7 肝脏组织，4℃环境中操作，分成3份，分别置入： ⒈浸泡于10%中性磷酸缓冲福尔马林溶液，常规制成石蜡切片，HE染色， 光镜观察肝脏组织形态学指标。并用于免疫组化检测NF-κB p65的表达。 ⒉冻存管，保存于液氮罐中，待测肝脏组织MPO、iNOS和NO活性。 ⒊去酶处理冻存管，保存于液氮罐中，待用RT-PCR法检测肝脏组织中 PPARγmRNA、iNOS mRNA的表达。 8 取肝脏组织，用PBS冲去残留血液,用10%福尔马林固定,制成石蜡切片,进行Hematoxylin&Eosin(HE)染色,在光镜下观察 9 打开腹腔取出肝脏用生理盐水漂洗后，滤纸洗干，切下部分并称重，投入液氮中。 10 肝组织匀浆制备：迅速剖取动物肝脏，取部分肝组织用冰生理盐水冲洗，滤纸吸湿后，称取湿重0.3g左右，加入预冷的生理盐水，用电动匀浆器研磨，镜检未见完整细胞，制成10%的肝组织匀浆，4℃4000r/min离心10min，提取上清液，-20℃冷存待检。 脾 1 无菌摘取大鼠脾脏，置于小皿中，用无菌剪刀将脾脏分为两份，一份装入冻存管中，并进行编号标记，立即置于液氮中进行保存;另一份放入无菌玻璃匀浆器中，并加入 1m1RPMl1640培养液(武汉博士德公司)碾碎脾脏，经200目不锈钢筛网过滤入15ml离心管，离心10min(1000r/min)，加入2ml0.83%NH4CI溶液(l单位的Tris溶液与9单位的NH4Cl溶液充分混 2 取出脾脏，用生理盐水漂洗滤纸吸干水份后称重。脾脏标本分两份，一份用10%福尔马林溶液固定，用于石蜡切片的制作;另一份放入冻存管，一20℃冰箱存放一小时后置于一80℃冰箱保存，用于冰冻切片的制作。 肾 1 切取肾脏，称重，取左侧肾脏10%甲醛固定用于组织学检测。 2 迅速摘取双侧肾脏，用4℃PBS冲洗残留血液，吸干，称重，而后将一侧肾脏放入一80℃冰箱保存，制备组织匀浆。另一侧肾脏放入4%多聚甲醛中固定，以备常规石蜡包埋、切片 3 HE染色：冰冷的生理盐水灌注肾脏，取双侧肾脏，右肾称重，切取肾皮质后一部分浸入福尔马林中备用。部分浸入2.5%戊二醛固定(固定液每隔3小时更换一次，共三次) 4 肾脏电镜标本制备：取肾脏皮质部分，切取1.5mm×l.5 mm小块，以2.5%戊二醛固定2h，以磷酸缓冲液冲洗30min，1%饿酸固定lh，逐级酒精脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，常规醋酸双氧铀与构椽酸铅双重染色。 5 取大鼠肾组织（n=6/时间点），标本分别做：(1)取材后放入无菌冻存管中速冻存于-70℃，以备提取总RNA及蛋白质，分别进行real-time PCR和Western blot检查。(2)石蜡切片：取材后置4%多聚甲醛中固定，制作4μm厚的石蜡切片；(3)电镜切片：标本固定于2.5%戊二醛中，制成超薄切片。 6 处死后迅速取出双肾滤纸吸干称重一侧肾脏放入10福尔马林固定液中以备用免疫组织化学检查另一侧肾脏取一部分皮质放入2.5戊二醛固定液用作电子显微镜检查，剩余部分肾脏置于-180液氮中以备提取RNA 胰腺 1 将胰腺组织标本迅速取出置于3%多聚甲醛和1%戊二醛0.01mmol/l磷酸缓冲液PBS 4℃，PH7.4中浸泡固定备用 2 胰腺组织，4℃环境中操作，分成4份，分别置入： ⒈浸泡于10%中性磷酸缓冲福尔马林溶液，常规制成石蜡切片，HE染色，光镜观察胰腺组织形态学指标。 ⒉冻存管，置入-20℃冰箱中，待测胰腺组织含水量。 ⒊冻存管，保存于液氮罐中，待测胰腺组织中MPO、iNOS和NO活性。 ⒋去酶处理冻存管，保存于液氮罐中，待用RT-PCR法检测胰腺组织中 PPARγmRNA、iNOS mRNA的表达。 3 将修好的胰尾小块立即投入4℃预冷含2％戊二醛的电镜专用固定液中，4℃固定60 min，预冷的PBS漂洗，10 min×3次。 脂肪 1 立即剪取大鼠腹部脂肪组织，迅速称重约500mg，加lml生理盐水，在冰浴下匀浆，低温离心，取上清，一20℃冻存; 2 完整取出腹腔内脂肪即白色脂肪(white fat，WF)，及颈项部脂肪垫即褐色脂肪(brown fat) 3 取大鼠腹部肾周脂肪组织及附睾脂肪垫，生理盐水洗净，取约10*10*10m³组织，浸入4%多聚甲醛溶液中固定，48小时内石蜡包埋;其余组织剪成150mg大小组织块，包入锡箔纸中，放入一80°C冰箱中冻存。 4 剖腹快速取其腹部脂肪组织和下肢骨骼肌间的脂肪组织，生理盐水漂洗，迅速置于液氮中，一70℃冰箱中保存。 PAGE 2