6谷氨酸提取

null第六章 谷氨酸提取第六章 谷氨酸提取【教学目的与要求】了解谷氨酸提取的方法，掌握等电点提取、离子交换法提取法。 【教学重点与难点】等电点提取、离子交换法提取 【教学内容】null6.1 概述 6.2 谷氨酸发酵液的性质和发酵废液的综合利用 6.3 等电点法提取谷氨酸 6.4 离子交换法提取谷氨酸 6.5 等电点-离子交换法提取谷氨酸 6.6 浓缩连续等电点法提取谷氨酸6.1 概述6.1 概述一、提取谷氨酸的方法： ⑴等电点法：利用谷氨酸是两性电解质，在等电点时其溶解度最小的性质，将发酵液加硫酸或盐酸调pH至谷氨酸的等电点，使谷氨酸沉淀析出的方法。 ⑵离子交换法：先将谷氨酸稀释至一定浓度，用盐酸将发酵液调至一定pH，采用阳离子交换树脂吸附谷氨酸，然后用洗脱剂将谷氨酸从树脂上洗脱下来，达到浓缩和提纯的目的。 null⑶金属盐法：金属盐法包括锌盐法和钙盐法，即利用谷氨酸与Zn2+、Ca2+等金属离子作用，生成难溶于水的谷氨酸金属盐，沉淀析出，在酸性环境中谷氨酸金属盐被分解，重新以谷氨酸形式结晶析出。 ⑷离子交换膜电渗析法：根据渗透膜对各种离子物质的选择透性不同而将谷氨酸分离，如电渗析和反渗透法。 二、选择谷氨酸提取的原则二、选择谷氨酸提取工艺的原则工艺简单，操作方便，分离后能够保持产物原有的性质； 所用原价格低廉，来源丰富； 提取收率高，产品纯度高； 劳动强度小，成本低。 在提取过程中，还要注意尽量减少环境污染，并有利于副产物的综合利用。6.2 谷氨酸发酵液的性质和发酵废液的综合利用6.2 谷氨酸发酵液的性质和发酵废液的综合利用6.2.1 发酵液的特征 6.2.2 发酵液的主要成分 6.2.3 菌体分离的方法 6.2.4 发酵液的综合利用null6.2.1 发酵液的特征 从外观上看，发酵结束时整个发酵液呈浅黄色浆状，表面浮有少许泡沫，温度一般为34~36℃，pH为6.5~7.5，有谷氨酸发酵的特殊气味。6.2.2 发酵液的主要成分6.2.2 发酵液的主要成分⑴ 发酵液大部分是水，含量一般在80%以上； ⑵谷氨酸 含量一般在10% ⑶发酵液中悬浮固体物主要含有菌体和蛋白质胶状物。 ⑷发酵液含有培养基残留的各种成分，包括糖类、无机盐类、有机色素物质以及消泡剂等。 ⑸发酵副产物null6.2.3菌体分离的方法 ⑴高速离心法 ⑵加热沉淀法：将发酵液加热至70~80℃，静置使菌体和蛋白质凝固沉淀而除去 ⑶絮凝沉淀法：在发酵液中加入适量的絮凝剂如聚丙烯酰胺，使菌体凝聚一起，加助滤剂过滤除去。 (4)膜分离法：采用膜孔为 800-1000nm的高分子膜材料截留菌体。6.2.4 发酵液的综合利用6.2.4 发酵液的综合利用⑴从谷氨酸发酵废母液中提取菌体蛋白。 ⑵谷氨酸废母液回收核糖核酸(RNA)。 ⑶菌体中含有丰富的蛋白质和脂肪等物质，是动物良好的饲料 ⑷废母液生产有机复合肥 ⑸废母液还可生产饲料酵母，制取单细胞蛋白，作饲料，又可减少环境污染。6.3 等电点法提取谷氨酸6.3 等电点法提取谷氨酸6.3.1 等电点法提取谷氨酸原理 6.3.2 谷氨酸的溶解度 6.3.3 等电点工艺的类型 6.3.4 谷氨酸的结晶 null6.3.1等电点法提取谷氨酸原理 ⑴谷氨酸的两性解离与等电点 表6-1 溶液pH与谷氨酸电离平衡关系null⑵谷氨酸等电点的性质 谷氨酸的等电点是它呈电中性时所处的环境pH值，即谷氨酸解离成兼性离子时所处环境的pH值，习惯上常以pI代表。 pI=(pK1+pK2)/2=(2.19+4.25)/2=3.22 在等电点时，谷氨酸的溶解度最小。工业生产中等电点法提取谷氨酸就是根据这一特性提取谷氨酸的。6.3.2 谷氨酸的溶解度6.3.2 谷氨酸的溶解度①pH对谷氨酸溶解度的影响②温度对谷氨酸溶解度的影响表6-2 在等电点时，不同温度条件下谷氨酸的溶解度图 6-1谷氨酸在pH1附近或碱性情况下，溶解度很高，但在等电点pH3.22和在30%以上高浓度盐酸下，溶解度便显著减少到最低点。谷氨酸溶解度受温度影响较大，温度越低，溶解度越小。null③杂质对谷氨酸溶解度的影响 发酵液中有其他氨基酸存在时，会导致谷氨酸溶解度的增加，当发酵液在 23.5℃时，纯谷氨酸的溶解度为0.818g/100g，倘若有其它氨基酸存在时(按0.097%计)，则谷氨酸的溶解度增加到1.412g/100g，是纯谷氨酸溶解度的172.6%,严重影响谷氨酸的收率。 6.3.3 等电点工艺的类型 6.3.3 等电点工艺的类型⑴常温等电点法图6-2 常温等电点法提取谷氨酸的工艺特点：设备简单，操作容易，生产周期短，酸、碱用量省等。注意观察晶核形成情况。若发酵不正常⑵ 水解等电点法⑵ 水解等电点法优点：菌体蛋白质中的谷氨酸得到了利用，并且发酵液中的谷氨酰胺和焦谷氨酸都变成了谷氨酸，所以谷氨酸的提取收率比较高。 缺点：整个过程酸性强，腐蚀性大，需要耐酸耐压的水解和浓缩设备，耗用大量蒸汽和盐酸，操作也比较复杂。图6-3 水解等电点法提取谷氨酸工艺流程⑶低温等电点法⑶低温等电点法 通过增加制冷能力，将等电点提取的终点温度，由原来的15~20℃，降至0~5℃，这样可使母液中的谷氨酸含量由1.5~2%降低到1.0~1.3%，从而增加等电点一次收率。图6-4 低温等电点法提取谷氨酸工艺流程特点： 工艺操作简便，设备简单，废水量少，节约酸、碱用量，成本较低，一次提取收率可达78%左右。关掉冷却水投晶种0.2%⑷低温浓缩等电点法⑷低温浓缩等电点法特点：工艺稳定，操作方便，收率高，生产周期短，节约酸、碱，减少环境污染等优点，但浓缩时要求真空度高，内温控制在45℃以下，不使菌体蛋白质凝固。图6-5 低温浓缩等电点法提取谷氨酸工艺流程6.3.4 谷氨酸的结晶6.3.4 谷氨酸的结晶1 谷氨酸的晶型及其性质 表6-3 谷氨酸不同晶型及其性质null2 影响谷氨酸结晶的主要因素 （1）菌体的影响 （2）谷氨酸含量对结晶晶型的影响表6-4 谷氨酸浓度对晶型的影响(在室温自然冷却条件下) 在室温自然冷却条件下，随着发酵液中谷氨酸含量的增加，β-型结晶含量逐渐增多，水分增加，母液分离困难，谷氨酸的纯度下降。null（3）温度对结晶的影响 （4）加酸速率对结晶的影响 随着结晶析出温度的提高，结晶的晶型发生了较明显的变化。当结晶析出温度超过30时，β-型结晶明显增加，因此，在用等电点法提取谷氨酸时，最好在低温下进行。表6-6表6-5 一般在操作时，从开始加酸到发酵液pH5这段时间，加酸速度可以快一些；当pH在5以下时，起晶前后，加酸速度要放慢；一旦发现晶核出现时，应立即停止加酸，育晶2h，使晶核长大；之后，再继续缓慢加酸，将pH调节至3.2，搅拌育晶。null（5）起晶方式对结晶的影响注：上表所示为快速（5min）加酸调节pH3.2时起晶方式对晶型的影响。 一般来说，加晶种（一定要选择质量较好的α-结晶作为晶种）起晶，晶核容易控制，不易出现β-型结晶。投晶种时要掌握好投放时机(控制在亚稳区)，一般以溶液的pH来控制，投放量是发酵液的0.1-0.3%。表6-7null（6）搅拌的影响 （7）残糖对结晶的影响（8）其他氨基酸和谷氨酰胺对结晶的影响 在生产上，谷氨酸与残糖的比值越大越好，这样有利于α-型结晶的形成和提高提取收率。 由上表可知，发酵液中L-谷氨酰胺含量越高，谷氨酸结晶时β-型晶体的出现就越严重，所以应严格控制L-谷氨酰胺的含量。 等电点温度越高，结晶时β-型晶体的出现就越严重。表6-8表6-9null（9）杂菌和噬菌体的影响 （10）水解糖液质量对晶型的影响 （11）发酵液放罐pH对晶型的影响表6-10 T-6菌发酵液放罐pH对晶型的影响6.4 离子交换法提取谷氨酸6.4.1 离子交换树脂的结构与分类 6.4.2 离子交换树脂的主要性能 6.4.3 离子交换法提取谷氨酸的基本原理 6.4.4 离子交换反应过程 6.4.5 离子交换工艺流程 6.4.6 离子交换操作 6.4.7 离子交换设备 6.4.8 结柱的原因及防止办法 6.4.9 离子交换树脂的保养6.4 离子交换法提取谷氨酸null6.4.1 离子交换树脂的结构与分类图6-6(1)离子交换树脂的结构⑵离子交换树脂的分类⑵离子交换树脂的分类表6-11（3）离子交换树脂的特点（3）离子交换树脂的特点溶液中的阳离子可以和树脂上的可交换阳离子发生交换，溶液中的阴离子可以和树脂上的可交换阴离子发生交换 树脂活性基团上可交换离子可以人为地加以改变6.4.2 离子交换树脂的主要性能⑴交联度 ⑵外观和粒度 ⑶含水量 ⑷密度 ⑸膨胀度 ⑹耐热性 ⑺交换容量6.4.2 离子交换树脂的主要性能null⑴交联度 常用符号DVB（%）表示，表示离子交换树脂中交联剂的百分含量，通常以重量比来表示。 交联度的大小决定着树脂机械强度以及网状结构的疏密。null⑵外观和颗粒 离子交换树脂是一种透明或半透明的物质，有白、黄、黑及赤褐色等几种颜色，一般颜色与性能关系不大。 树脂的粒度是指在树脂生产厂标明的活性基团形式下，树脂颗粒在水中充分膨胀后的直径。一般用筛孔目数或颗粒直径（mm）表示。 颗粒形状有球状和无定型粒状之分，以制成球状为宜。 颗粒大小，对树脂的交换能力、树脂层中溶液流动分布均匀程度、溶液通过树脂层的压力以及交换和反冲时树脂的流失等都有很大影响。用于提取谷氨酸的阳离子交换树脂粒度大小一般为16-60目。null⑶含水量 是指在树脂生产厂标明的活性基团形式下，树脂经水充分膨胀后的，树脂内部水分占树脂的百分比。一般树脂含水量在40-60%。null⑷密度 ①干真密度： 即干燥状态下树脂合成材料本身的密度，干真密度一般为1.6g/cm3，但没有实际意义 。 ②湿真密度： 指树脂充分膨胀后树脂颗粒本身的密度。（湿真密度=树脂湿重/树脂颗粒所占体积） 湿真密度对树脂反洗强度大小及混合柱再生前分层 好坏有影响。 一般为1.04-1.3 g/mL。 ③视密度：指树脂充分膨胀后的堆积密度 。（视密度=树脂湿重/树脂层的体积）一般为0.6-0.85 g/mL，根据此值来估计树脂柱所受的压力，从而确定离子交换的最大装填量。null⑸ 膨胀性 表示干树脂吸收水分后体积增大的性能。 与树脂的交联度、交换量、溶液中的离子浓度等因素有关。null⑺交换容量： ①理论交换量：又称全交换量，是指树脂交换基团中所有可交换离子全部被交换时的交换量，也就是树脂全部可被交换离子的物质量，称理论交换量。 通常用mmol/g干树脂或mmol/mL湿树脂表示。 ②工作交换量：指在一定操作条件下，离子交换树脂所能够利用的交换容量，也可以称实际交换容量。它受操作条件，如树脂柱长度、树脂粒度、离子性质及浓度、流速、交换基团等因素影响。 ③有效交换量：将工作交换量减去洗脱时损失的交换量，其差值称为有效交换量。 ④交换效率：有效交换量与全交换量的百分比，称为交换效率。6.4.3 离子交换法提取谷氨酸的基本原理阳离子交换反应可表示为： An++n(R-SO3-)B+ nB++(R-SO3-)nAn+ 阳离子解析反应可表示为： nC++(R-SO3-)nAn+ → An++n(R-SO3-)C+6.4.3 离子交换法提取谷氨酸的基本原理6.4.4 离子交换反应过程1.离子交换反应 上柱交换：RSO3H+NH4Cl → RSO3-NH4++HCl H2NCHR’COONH4 → H3+NCHR’COOH+NH4+ RSO3-H++ H3+NCHR’COOH → RSO3-H3+NCHR’COOH + H+ 洗脱： RSO3-H3+NCHR’COOH + NaOH → RSO3Na + H2NCHR’COOH + H2O RSO3-NH4+ + NaOH → RSO3Na + NH4OH 再生： RSO3Na + HCl → RSO3H + NaCl6.4.4 离子交换反应过程H+2. 离子交换过程大致可分为五个阶段： ①溶液中的谷氨酸离子经溶液扩散到树脂表面； ②穿过树脂表面向树脂内部扩散； ③谷氨酸离子与树脂中H+进行离子交换； ④交换出来的H+从树脂内部向树脂表面扩散； ⑤最后H+扩散到溶液中。2. 离子交换过程图6-7 离子交换过程null影响交换速度的因素有： 树脂颗粒 树脂的交联度 溶液流速 溶液浓度 温度 离子的大小 小离子的交换速度比较快 离子的化合价3 离子交换树脂的选择性⑴吸附顺序 用732#提取谷氨酸时，其吸附顺序如下： Fe3+ ＞Al3+ ＞ Ca2+ ＞ Mg2+ ＞ K+ ＞ NH4+ ＞ Na+ ＞H+ ＞氨基酸＞有机色素 ⑵氨基酸交换顺序 对于强酸性阳离子交换树脂进行交换时，所有氨基酸都能吸附，其吸附顺序如下： 精氨酸＞赖氨酸＞丙氨酸＞亮氨酸＞谷氨酸＞门冬氨酸 ⑶金属阳离子和氨基酸的交换顺序 Ca2+ ＞ Mg2+ ＞ K+ ＞ NH4+ ＞ Na+ ＞腺嘌呤＞丙氨酸＞亮氨酸＞谷氨酸＞天冬氨酸3 离子交换树脂的选择性6.4.5 离子交换工艺流程6.4.5 离子交换工艺流程1.单柱法工艺流程null2.双柱法离子交换工艺流程3. 谷氨酸发酵液交换层次3. 谷氨酸发酵液交换层次 谷氨酸发酵液流经阳离子交换柱时，被交换吸附的物质，其分层的大致情况如下： 第一层： Ca2+、Mg2+、K+、Na+等金属离子 第二层： NH4+ 第三层：中性和碱性氨基酸 第四层：谷氨酸 第五层：其它氨基酸 第六层：有机色素6.4.6 离子交换操作6.4.6 离子交换操作（一）单柱法 1 上柱液的配制 2 上柱交换 3 洗脱和收集 null（二）双柱法 采用由弱酸性阳离子交换树脂和强酸性阳离子交换树脂两个交换柱组成的复床式双柱法来提取谷氨酸，其效果比单柱法好。（三） 离子交换法操作要点（三） 离子交换法操作要点⑴新树脂的预处理： ⑵树脂的填充 通常树脂层高度占圆筒高度的1/2~2/3,树脂层上部应留有一定的空间，柱中加入液体后液面应高于树脂层30cm左右。树脂层从上到下应该粒度均匀、平整疏松、无气泡、无裂缝。 ⑶上柱液pH的控制 发酵液放罐后用硫酸调pH5.0，然后加水稀释至谷氨酸 含量为3%左右，这时pH在5.0~5.5之间，即为待上柱液null⑷上柱量的控制 上柱量是指一次通过离子交换树脂而达到交换处理的溶液量。 上柱量的多少应根据树脂的工作交换量和上柱液中能被交换的离子浓度来决定。 ⑸体积流速（SV）控制 流速是指单位时间通过单位体积湿树脂的上柱液体积，根据实践经验 逆流上柱SV=2~3m3/(m3·h)； 顺流上柱SV=1.5~2m3/(m3·h) 一般洗脱流速慢于上柱流速。null⑹防止漏吸：在发酵液上柱时，特别后阶段，为了 防止漏吸，可用5%茚三酮溶液的显色反应来检测， 当上柱流出液谷氨酸含量大于0.2%时，即为漏吸。 ⑺反洗： 交换吸附结束后，用水反洗，使菌体等杂 质的上层污物冲洗出排污口，中间可开启压缩空气 和抽真空，使树脂疏松，但要防止树脂溢出。null⑻树脂预热和洗脱 洗脱剂为60℃的4~5%氢氧化钠溶液 洗脱剂的选择：一般阳离子交换树脂常用NaOH、NH4OH、NaCl等为洗脱剂，阴离子交换树脂以HCl、NH4OH、NaOH、NaCL等为洗脱剂。 ⑼洗脱液收集 从pH1.8到pH2.5，这一阶段为低流分。 从pH2.5到pH8，这一阶段为高流分，以pH3~3.5为最高，平均谷氨酸含量为6%左右。 pH8~10，这一段收集液为后流分，谷氨酸含量为2%左右。null⑽树脂的保藏 保藏：短时间存放，可用碱液浸泡树脂，定期返洗；长期保存，应将树脂洗涤干净后转为Na+型，然后在湿润状态下密封保存。保存温度不得低于0℃。 ⑾树脂再生 以体积为湿树脂体积1.5倍的5~6%盐酸，顺流通过树脂层再用水洗，当流出液pH1~1.5时，转为H+型树脂，下次上柱前还需疏松树脂层。 再生剂流速宜控制在上柱流速的1/2。 再生剂盐酸用量=树脂体积×1.8×1.2×36.5/(工业盐酸含量×盐酸相对密度)6.4.7 离子交换设备6.4.7 离子交换设备 离子交换柱是离子交换法的主要设备，它是圆形柱，上下封头球形，柱内装有液体分布器，支持树脂用的支座。要能密闭。 ①耐腐性能 防酸碱腐蚀 ②径高比 2-3，最大为5 ③树脂支持层6.4.8 结柱的原因及防止办法6.4.8 结柱的原因及防止办法⑴产生结柱的原因，有如下几个方面： ①上柱液中谷氨酸含量太高； ②树脂严重破碎或菌体的堵塞，影响流速，更易结柱。 ③采用氢氧化钠洗脱剂浓度太高、温度低，特别是洗脱之前未能充分洗尽菌体，树脂未达到预热温度。null⑵防止结柱的办法 ①将严重破碎的树脂适当给予调换； ②洗脱剂浓度和温度要控制适当； ③上柱完毕，特别对带菌体上柱，树脂必须用自来水反洗充分，并达到预热温度后，方可加碱进行洗脱； ④凡是结柱以后，树脂的处理必须要彻底。6.4.9 离子交换树脂的保养6.4.9 离子交换树脂的保养保养树脂一般应注意以下几点： ①在用碱洗脱后用自来水洗时，因自来水压力高，容易引起树脂破碎。 ②上柱过程中不得超过90℃，因高温下树脂容易破碎 ③严防谷氨酸在树脂中结柱，造成树脂破碎。null④由于酸碱处理，冷热变化频繁，以及反复冲洗引起树脂破碎。操作上要求树脂反冲适度，温度升降时不能骤冷骤热，以减少树脂破碎率。 ⑤防止油污、氧化剂和金属离子，特别是重金属离子与树脂接触污染。 ⑥树脂停止使用时，应处理清洁并转成钠型，以湿润状态密封保存，且温度不得低于0℃ ，还要避免日光及其它射线的照射。6.5 等电点-离子交换法提取谷氨酸6.5 等电点-离子交换法提取谷氨酸6-126.6 浓缩连续等电点法提取谷氨酸6.6 浓缩连续等电点法提取谷氨酸浓缩连续等电点法工艺过程： 具体操作：将发酵液和硫酸同时加入等电点罐中，始终保持罐内pH在3.0-3.2，发酵液在等电点罐中采用低温等电点法结晶，待析晶完全后，以晶体及母液作为“种子”，维持一定的温度和pH，然后一边连续添加新发酵液，一边从等电点罐底部放出已结晶的谷氨酸，使进出料量保持一致，放出的物料在育晶罐中进行育晶，让晶体长大，育晶结束后进行分离，得到谷氨酸晶体。思考题思考题1、谷氨酸发酵液一般具有哪些特征？ 2、分离发酵液中菌体的方法有哪些？ 3、对于离子交换树脂，何谓视真密度、交联度、理论交换量、工作交换量？ 4、简要说明等电点法提取谷氨酸的原理，如何防止等电点提取谷氨酸过程中产生β-型结晶？ 5、简要说明离子交换法提取谷氨酸的基本原理，写出阳离子树脂提取谷氨酸的工艺流程，并简要说明各步骤控制要点？ 6、选择谷氨酸提取工艺的原则？课前回顾课前回顾谷氨酸发酵噬菌体的主要特性:具有非常专一的寄生性、不耐热、对pH 的稳定性、嗜氧性、干燥条件下的稳定性、不耐药性、传播性、在UV照射下失活 噬菌体的检测方法：单层平板法、双层平板法、平板交叉划线法、快速检测法 噬菌体的防治:⑴合理使用抗性菌株⑵利用药物防治噬菌体⑶采取以环境净化为中心的综合防治措施①净化生产环境，消灭污染源；②提高过滤系统的净化能力；③坚持进行噬菌体的检测预报；④做好菌种管理与使用工作；⑤做好设备管理与改进工作；⑥严格执行无菌操作 感染噬菌体的挽救:并罐法;轮换菌种或使用抗性菌种;放罐重消法;罐内灭噬菌体法null谷氨酸发酵中染菌的原因分析: 染菌的途径：①菌株或一级种子不纯；②生产设备与工艺管路存在隐患；③生产操作不当；④操作环境条件差 检查杂菌的常用方法:显微镜检查；平板划线培养检查；肉汤培养检查；④其他检查方法(溶氧水平异常变化显示染菌;排气中CO2含量异常变化显示杂菌) 防止染菌的措施:空气净化;培养基和设备的灭菌;发酵设备的安装;培养物的移接；加强操作环境空间的卫生管理，定期进行环境消毒，保持良好的环境卫生；对染菌的发酵罐次要高度重视，并积极分析且及时采取处理措施；还要善于，防范类似现象；选用粗放菌种和选用抗药性菌种。回正文