油菜含油量性状QTL关联分析及有利等位基因在品种中的构成分析

中国农业科学 2012,45(19):3921-3931 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2012.19.003 收稿日期：2012-05-02；接受日期：2012-07-25 基金项目：国家自然科学基金面上项目（31171180）、浙江省自然科学基金重点项目（Z3100592）、浙江省科技重大科技专项重点农业项目 （2011C12005） 联系方式：孙中永，E-mail：yczzszy@163.com；程 爽，E-mail：chengs823@163.com。孙中永和程爽为同等贡献作者。通信作者赵坚义，Tel：0571- 86403406；E-mail：jyzhao3@yahoo.com 油菜含油量性状 QTL 关联分析及有利等位基因 在品种中的构成分析 孙中永 1,2，程 爽 1,2，王继变 3，黄吉祥 1，陈 飞 1，倪西源 1，赵坚义 1 （1 浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所，杭州 310021；2 杭州师范大学生命与环境科学学院，杭州 310036；3 浙江大学农业与生物技术学院， 杭州 310058） 摘要：【目的】验证不同遗传背景下 7 个含油量 QTL 的稳定性、通用性和实用性，检测 QTL 连锁标记辅助选 择提高含油量的可行性，发掘可能实质性影响油菜含油量性状的候选基因。【方法】利用已发表的 SG 群体在 11 种 环境下的 QTL 结果，在 7 个主效 QTL 峰值或置信区间内选择 14 个油脂形成相关候选基因标记对 81 份核心种质两 年度的含油量数据进行关联分析，并鉴定各 QTL 位点高油等位基因在不同品种中的分布。【结果】4个 QTL（OilA1、 OilA5、OilA7 和 OilC8-1）位点的 6个连锁标记在 81 个品种高、低 2种等位基因间平均含油量差异达到显著或极 显著；对其中 4个标记 Ra2E04、ZAAS919、ZAAS828 和 ZAAS441 的跟踪选择和聚合，可相应提高含油量 5个以上百 分点；根据标记基因型推测，OilA1 和 OilC8-1 位点，超过 80%的欧洲春、冬油菜品种中已含 Sollux 高油等位基 因，但中国品种中则 80%和 60%的品种含低油等位基因；OilA5 和 OilA7 位点上，几乎所有被检欧洲材料均不含 Gaoyou 高油等位基因，而中国双低和双高品种中也只有约 20%—30%含此有利等位基因。【结论】与 4 个 QTL 连锁 的 6个拟南芥油脂相关同源基因（At3g51830、At2g42450、At2g44620、At1g73600、At1g73480 和 At1g13560）有 可能实质性参与油菜种子油分累积；当聚合了包括 OilA7 在内的 3 个或 3 个以上 QTL 位点高油等位基因时，含油 量可相应提高 5个百分点；所揭示的 4个 QTL 高油等位基因在中国尚有较大利用空间而 OilA5 和 OilA7 的 Gaoyou 等位基因可能尤为欧洲油菜育种家们关注。 关键词：甘蓝型油菜；含油量；关联分析；分子标记辅助选择 Validation of QTL for Oil Content in a Population of Worldwide Rapeseed Cultivars by Association Analysis SUN Zhong-yong1,2, CHENG Shuang1,2, WANG Ji-bian3, HUANG Ji-xiang1, CHEN Fei1, NI Xi-yuan1, ZHAO Jian-yi1 (1 Institute of Crop and Nuclear Technology Utilization, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021; 2College of Life and Environmental Sciences, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036; 3College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310058) Abstract: 【Objective】 The objective of this study is to validate the genetic stability of 7 major QTL for oil content，which were detected in authors’ previous researches, and to assess the feasibility of marker assisted selection for improving seed oil content using closely linked functional makers.【Method】Fourteen lipid related candidate gene markers located in the 7 QTL regions were chosen to amplify 81 core collections of Brassica napus and then a linkage disequilibrium was estimated by marker-trait association analysis. Meanwhile, the allelic distribution among 81 world-wide cultivars in each QTL was investigated.【Result】By association 3922 中 国 农 业 科 学 45 卷 analysis, significant differences in oil content were detected between favorable and unfavorable allele genotypes in each of six linked markers flanking four QTL (OilA1, OilA5, OilA7 and OilC8-1), respectively. Over 5 percentage in oil content could be increased by assembling favorable alleles together through four QTL linked markers Ra2E04，ZAAS919，ZAAS828 and ZAAS441. According to the marker genotypes, in the loci of OilA1 and OilC8-1, higher than 80% of European cultivars have carried positive alleles from “Sollux”, while 80% and 60% Chinese materials contain unfavorable alleles. On OilA5 and OilA7, almost all the tested European varieties did not show favorable alleles from “Gaoyou” and for Chinese materials, also only around 20%-30% cultivars carrying these positive alleles.【Conclusion】Six orthologous gene markers (corresponding to At3g51830, At2g42450, At2g44620,At1g73600, At1g73480 and At1g13560), which closely link to OilA1, OilA5, OilA7 and OilC8-1 might be functional important in the accumulation of oil content in rapeseed. When favorable alleles from three QTL including OilA7 or all four selected QTL combined together, the oil content could be increased more than 5 percentages. The results showed that the positive alleles in screened out 4 QTL loci are potentially interesting for present breeding programs in China, while the Chinese alleles from OilA5 and OilA7 should be also attractive to rapeseed breeders in European countries. Key words: Brassica napus; oil content; association analysis; marker assistant selection (MAS) 0 引言 【研究意义】油菜是中国最重要的食用植物油来 源之一，最大限度提高单位面积产油量是油菜生产的 最终目的。菜籽产量和含油量是决定产油量的两大要 素，经过多年的育种实践，中国油菜单产已发展到一 个较高的水平，而种子含油量尚有较大提升空间[1]。 油菜种子含油量是一个由多基因控制的复杂数量性 状，易受环境影响，表现为基因×基因以及基因×环 境互作，因此，应用常规方法往往难以达到理想的改 良效果。近年来，基于连锁图谱的 QTL（quantitative trait loci）分析理论的提出和标记技术的发展为重要数 量性状的遗传研究奠定了基础。通过 QTL 分析，可以 将控制油菜种子含油量这类复杂性状的众多基因定位 到染色体的特定位置，借助连锁标记进行选择，最终 达到聚合优良等位基因，有效提高油菜种子含油量的 目的。【前人研究进展】过去二十年中，已有众多研 究者对油菜含油量性状进行了QTL的定位和分析[2-8]， 发现所有 19 条甘蓝型油菜连锁群上都有 QTL 的检测 报道。Delourme 等[7]通过比较 5 个 DH 群体的分析结 果，发现位于 A1、A3、A8 和 C3 上的 QTL 相对稳定， 很可能是相同的基因位点。最近，Zhao 等[6]利用新版 SG-图谱，对 2001—2009 年共 11 个环境的含油量性 状进行 QTL 定位以及 QTL 和油脂形成相关候选基因 的共线性比对，在 8 条连锁群上共获得 9 个主效含油 量 QTL 和一系列位于 QTL 置信区间的油脂形成相关 候选基因。尽管油菜含油量性状 QTL 的研究至今已有 众多报道，但其在不同遗传背景下的稳定性和分子标 记辅助选择的可行性尚未阐述。在其它作物如玉米产 量[9]、棉花的纤维强力[10]、菜豆抗病[11]、水稻抗病[12] 等的遗传改良中，基于 QTL 信息的分子标记辅助选择 已显示出较好的应用效果。在油菜作物中，分子标记 技术目前还只局限在对单基因或主效基因控制的如抗 病、种皮颜色和育性基因等的选择应用。Pilet 等[13] 利用 RAPD 和 RFLP 标记，Plieske 等[14]利用 AFLP 和 RFLP 标记对甘蓝型油菜黑胫病抗性进行标记辅 助选择；刘志文等[15]应用标记辅助，将黄籽基因导 入波里马恢复系，育成黄籽波里马恢复系；倪西源 等[16]利用与 Bnms3 和 Bnrf 连锁标记筛选临保系基因 型，选择效率达到 90%以上。显示出分子标记应用于 作物育种的良好前景。【本研究切入点】所有 19 条 甘蓝型油菜连锁群上均有发现含油量 QTL，但这些 QTL 是否稳定遗传、可否应用于育种实践，国内外 均未见报道。【拟解决的关键问题】本研究重点在于 利用多年多环境下含油量 QTL 的分析结果，对国内 外不同遗传背景不同含油量水平的品种资源进行标 记-性状关联分析，鉴定含油量 QTL 的稳定性及实用 性，提出标记辅助聚合高油等位基因的育种理论和实 践依据。 1 材料与方法 1.1 材料 供试的 81 份甘蓝型油菜品种（多代自交）是从约 500 份品种资源中筛选出的核心种质，分属 4 大类组： 中国双低（低芥酸和低硫苷）油菜（A 组）、中国双 高（高芥酸和高硫苷）油菜（B 组）、国外春油菜（C 组）和国外冬油菜（D 组）[17]。除国外冬油菜外，各 类组内品种（系）间含油量极差均超过 10 个百分点。 供试材料由浙江省农业科学院油料室提供，品种介绍 见表 1。 19 期 孙中永等：油菜含油量性状 QTL 关联分析及有利等位基因在品种中的构成分析 3923 表 1 供试甘蓝型油菜品种介绍 Table 1 Survey on oilseed rape (Brassica napus) used 编号 Code 品种（系） Cultivars 来源 Oringin 品质 Quality 含油量 Oil content (%) 2006 2007 平均 Mean A1 浙双 72 Zheshuang72 浙江 Zhejiang 00 45.52 41.00 43.26 A2 4312 华中农业大学 Huazhong Agricultural University 00 39.98 36.24 38.11 A3 22108 华中农业大学 Huazhong Agricultural University 00 40.51 35.56 38.03 A4 68-1 中国农业科学院油料作物研究所 Oil Crops Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences 00 41.84 39.17 40.51 A5 中双 821 Zhongshuang821 中国农业科学院油料作物研究所 Oil Crops Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences 00 38.56 33.13 35.84 A6 中双 2 号 Zhongshuang2 中国农业科学院油料作物研究所 Oil Crops Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences 00 30.07 35.25 32.66 A7 中双 7 号 Zhongshuang7 中国农业科学院油料作物研究所 Oil Crops Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences 00 46.57 44.52 45.55 A8 中双 8 号 Zhongshuang8 中国农业科学院油料作物研究所 Oil Crops Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences 00 47.55 40.39 43.97 A9 沪油 15 Huyou15 上海 Shanghai 00 40.90 37.08 38.99 A10 浙双 3 号 Zheshuang3 浙江 Zhejiang 00 46.60 40.50 43.55 A11 沪油 18 号 Huyou18 上海 Shanghai 00 43.21 34.78 39.00 A12 湘油 11 号 Xiangyou11 湖南 Hunan 00 36.70 39.90 38.31 A13 湘油 15 号 Xiangyou15 湖南 Hunan 00 45.99 41.59 43.79 A14 苏 9303-1 Su9303-1 江苏 Jiangsu 00 45.99 38.78 42.38 A15 红油 3 号 Hongyou3 四川 Sichuan 00 42.20 39.37 40.78 A16 优 88 You88 南京 Nanjing 00 45.58 41.38 43.48 A17 浙油 18 Zheyou18 浙江 Zhejiang 00 45.14 41.89 43.52 A18 浙双 758 Zheshuang758 浙江 Zhejiang 00 41.05 39.90 40.47 A19 5802 浙江 Zhejiang 00 44.25 40.48 42.36 A20 浙优油 2 号 Zheyouyou 2 浙江 Zhejiang 00 40.24 39.11 39.68 A21 H40 西南 Xi’nan 00 44.77 41.04 42.91 A22 24729 华中农业大学 Huazhong Agricultural University 00 45.04 37.46 41.25 A23 华双 3 号 Huashuang3 华中农业大学 Huazhong Agricultural University 00 45.34 43.36 44.35 B1 长荚油菜 Changjiayoucai 浙江 Zhejiang + 37.94 36.98 37.46 B2 宁油 5 号 Ningyou5 江苏 Jiangsu + 40.64 34.56 37.60 B3 淮油 6 号 Huaiyou6 江苏 Jiangsu + 39.75 40.21 39.98 B4 军垦 1 号 Junken1 江苏 Jiangsu + 34.74 31.91 33.32 B5 苏 128 Su128 江苏 Jiangsu + 33.93 31.37 32.65 B6 矮架早 Aijiazao 四川 Sichuan + 40.16 40.15 40.15 B7 万油 5 号 Wanyou 5 四川 Sichuan + 40.80 33.90 37.35 B8 丰收 4 号 Fengshou 4 四川 Sichuan + 32.59 38.20 35.39 B9 特早 13 号 Tezao13 四川 Sichuan + 34.75 36.17 35.46 B10 沪油 9 号 Huyou9 上海 Shanghai + 40.41 38.92 39.67 B11 美间 Meijian 西藏 Xizang 0+ 36.31 37.57 36.94 B12 沪油 3 号 Huyou3 上海 Shanghai + 35.45 36.69 36.07 B13 西油 2 号 Xiyou2 贵州 Guizhou + 42.68 38.42 40.55 B14 黔油 8 号 Qianyou8 贵州 Guizhou + 38.15 39.06 38.61 B15 贵 77-2 Gui77-2 贵州 Guizhou + 33.47 35.80 34.63 B16 黔油 13 号 Qianyou13 贵州 Guizhou + 32.19 34.79 33.49 3924 中 国 农 业 科 学 45 卷 续表 1 Continued Table 1 编号 Code 品种（系） Cultivars 来源 Oringin 品质 Quality 含油量 Oil content (%) 2006 2007 平均 Mean B17 黔 326 Qian326 贵州 Guizhou + 37.95 38.28 38.11 B18 云油 31 Yunyou31 云南 Yunnan + 33.35 32.58 32.96 B19 云油 6 号 Yunyou6 云南 Yunnan + 42.88 39.06 40.97 B20 湘油 4 号 Xiangyou4 湖南 Hunan + 39.27 37.23 38.25 B21 中油 821 Zhongyou821 中国农业科学院油料作物研究所 Oil Crops Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences + 34.70 37.59 36.14 B22 华油 9 号 Huayou9 华中农业大学 Huazhong Agricultural University + 42.79 39.26 41.02 B23 1060(2)-4 华中农业大学 Huazhong Agricultural University + 46.63 42.75 44.69 B24 1419②-2 华中农业大学 Huazhong Agricultural University + 40.91 38.33 39.62 B25 新都 7315 Xindu7315 江西 Jiangxi + 39.14 40.28 39.71 B26 高油 605 Gaoyou605 浙江 Zhejiang + 52.03 41.43 46.73 B27 九二 Jiu’er 浙江 Zhejiang + 37.61 37.01 37.31 B28 79601 浙江 Zhejiang + 36.80 37.56 37.18 B29 82769 浙江 Zhejiang + 38.99 40.28 39.63 B30 480 浙江 Zhejiang + 38.97 38.35 38.66 B31 三高油菜 Sangaoyoucai 浙江 Zhejiang + 39.25 35.44 37.35 B32 农林 18 Nonglin18 日本 Japan + 38.62 39.68 39.15 B33 日本 3 号 Riben3 日本 Japan + 35.75 42.00 38.87 B34 村崎 Cunqi 日本 Japan + 35.19 45.80 40.49 B35 荣山油菜 Rongshanyoucai 朝鲜 Korea + 40.35 41.00 40.68 C1 Princeton 瑞典 Sweden 00 38.40 37.96 38.18 C2 Orca 德国 Germany 00 48.36 41.66 45.01 C3 Topic 德国 Germany 00 42.79 42.10 42.45 C4 Westar 加拿大 Canada 00 34.55 37.00 35.77 C5 Tower 加拿大 Canada + 38.05 36.56 37.30 C6 Wesroona 澳大利亚 Australia + 35.88 39.55 37.72 C7 Marnoor 澳大利亚 Australia 00 38.27 37.20 37.74 C8 Topas 瑞典 Sweden 00 41.26 40.32 40.79 C9 Delta 瑞典 Sweden 00 42.87 38.71 40.79 C10 Bingo 丹麦 Denmark 00 41.39 36.56 38.98 C11 Ural 德国 Germany 00 45.08 40.60 42.84 D1 Casino 瑞典 Sweden 00 37.76 41.41 39.59 D2 Mendel 德国 Germany 00 41.99 43.86 42.92 D3 Tapidor 法国 France 00 42.60 42.71 42.65 D4 Sollux 德国 Germany + 46.13 38.24 42.18 D5 Panter 瑞典 Sweden 00 38.81 40.95 39.88 D6 Ceres 德国 Germany 00 38.38 39.75 39.06 D7 Lirajet 德国 Germany 00 43.24 41.43 42.34 D8 Express 德国 Germany 00 44.64 41.13 42.88 D9 Viking 德国 Germany 00 42.30 43.35 42.82 D10 Rasmus 德国 Germany 00 43.30 41.68 42.49 D11 Artus 德国 Germany 00 41.70 38.81 40.26 D12 Baldur 德国 Germany 00 43.96 42.23 43.09 00：无芥酸和低硫代葡萄糖苷 Erucic acid free and low glucosinolate；+：高芥酸和高硫代葡萄糖苷 High erucic acid and high glucosinolate；0+：低芥酸 和高硫代葡萄糖苷 Erucic acid free and high glucosinolate 19 期 孙中永等：油菜含油量性状 QTL 关联分析及有利等位基因在品种中的构成分析 3925 1.2 田间试验和含油量性状考察 81 份油菜品种资源于 2005—2007 年种植在浙 江省农业科学院内试验田。随机排列，两行区，行 长 3 m，行、株距 0.3 m×0.15 m。成熟时随机混收 小区中部 5 株健康植株上主轴和最上面 2 个大分枝 上的种子，自然晒干后用近红外（NIRS）分析仪测 定含油量，每样品测定 3 次，取平均值。测定时每 间隔 50 个样品加一个高含油量（＞50%）和低含油 量（＜40%）对照，以控制测定误差在 0.5 个百分点 以内。 1.3 含油量 QTL 和连锁标记 根据新版 SG 遗传图谱和 SG 群体在 11 个环境下 的含油量 QTL 定位结果[6]，从 7 个主效含油量 QTL （表 2）峰值位置或置信区间选取 14 个拟南芥油脂形 表 2 用于辅助选育的含油量 QTL 以及连锁基因标记信息[6] Table 2 QTL and linked markers information used for assistant selection QTL 名称 Name of QTL 置信区间 Confidence interval (cM) 加性效应 a Additive effect (%) 贡献率 R2 (%) QTL 区间 连锁标记 b Linkage marker 位置 Position (cM) 拟南芥 同源基因 Orthologous to Arabidopsis 基因功能 Gene annotation 引物序列 Primer sequence (5′-3′) OilA1 49.9—66.9 0.46 5.49 Ra2E04 63.8 At3g51830 含Sac功能域，跨膜蛋白G5P（AtG5） Sac domain-contain, putative transmembrane protein G5P (AtG5) mRNA ACACACAACAAACAGCTCGC AACATCAAACCTCTCGACGG ZAAS573 63.0 At4g16700 线粒体磷脂酰丝氨酸脱羧酶 Encodes a mitochondrial phosphatidylserine decarboxylase CCTGCAACCTTCTTTCAAGC TCTCAGGAAATTCCGGTCTG OilA5 0.0—25.5 -0.39 4.42 ZAAS919 9.0 At2g42450 脂肪酶 3 类家族蛋白 Lipase class 3 family protein TTGGATGAAGGGAGTTCTGG GGACAAGTGTCATCGAGAAGG ZAAS397 15.4 At2g44620 线粒体酰基载体蛋白 Mitochondrial Acyl carrier protein GCAAAACCTAGCGGTGAGAG CCCCAAATCCTTCTGGAAAT OilA7 32.2—48.7 -0.64 13.13 ZAAS828 41.3 At1g73600 磷酸乙醇胺-甲基转运酶 Phosphoethanolamine N-methyltransferase TCAAAACCAAGTTCCCTCCT CTACCGGGTCGCATCATATT ZAAS839 41.7 At1g73480 单甘酯脂肪酶 Monoglyceride lipase AAACCGGCTACGAGATCCTT CGCTGGTTTAGCCAATCTAA OilC2 13.6—35.8 0.72 7.49 ZAAS619 29.7 At5g10160 Plastidial 羟- ACP 脱水酶 Plastidial hydroxyacyl-ACP dehydrase TCGAGATCAATCGACAATGG ATTCATCGGTGGAGCAGAAG ZAAS616 30.8 At5g13640 卵磷脂：二酰基甘油酰基转移酶 Diacylglycerol acyltransferase (PDAT) GTTTTCAATCTCAGACGGCG GGGAGGTGACACAATATGGG OilC3 73.8—92.1 -0.55 6.00 ZAAS401 84.6 At2g29980 ω- 3 脂肪酸去饱和酶 Omega-3 fatty acid desaturase, endoplasmic reticulum (FAD3) CATCCATCACGACATTGGAA AATCGGTATTGCTCCTGACG ZAAS343 96.8 At2g39290 磷酸乙醇胺-甲基转运酶 Plastidial phosphatidylglycerolphosphate synthase ATTGCAATAGAAGGCACCGT GGTCGGATCATGAACGTTTT OilC6 15.2—32.2 -0.33 3.40 ZAAS893 27.3 At3g61580 Δ- 8 鞘脂脱氢酶 Delta-8 sphingolipid desaturase (SLD1) TGGTGGAAATGGACTCACAA GTCGGTAAGCAGGAAACCAA ZAAS834 36.9 At1g73600 磷酸乙醇胺-甲基转运酶 Phosphoethanolamine N-methyltransferase TGGCATTGGTCGTTTCACTA TGTGACATCAGCGCACATAA OilC8-1 9.5—11.0 0.54 5.51 ZAAS433 8.2 At1g15110 磷脂酰丝氨酸合成酶蛋白 Phosphatidyl serine synthase family protein GTGGGATCATTCTGTTGGCT CACAATGGCATCTCTGTTGG ZAAS441 8.6 At1g13560 编码氨基乙醇磷酸转移酶 Encodes amino alcohol phosphotransferase AAPT1 CCAATTTTTGCAGGTTGTGA CACATTGCAGTGCTTCCAAA a 加性效应值方向为正表示欧洲亲本 Sollux 等位基因提高含油量，方向为负值表示中国亲本 Gaoyou 等位基因提高含油量；bQTL 置信区间拟南芥油 脂形成相关同源候选基因标记 a Additive effect with positive values indicate that QTL alleles increasing seed oil content originated from the European parent “Sollux” and negative values means favorable alleles from Chinese parent “Gaoyou”; b Arabidopsis lipid-related orthologous gene markers 3926 中 国 农 业 科 学 45 卷 成同源基因标记对 81 个品种资源进行标记和含油量 性状之间的关联分析。高油等位基因在 7 个主效 QTL 位点的分布为，3 个源于欧洲亲本 Sollux，4 个来自中 国亲本 Gaoyou。 1.4 标记技术 样本 DNA 的提取参见任丽平等[17]方法，PCR 扩 增体系和反应程序参照 Zhao 等[4]，扩增产物采用 2 种 电泳技术，一种是 PCR 产物长度多态性检测，用 6% 的聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺﹕甲叉双丙烯酰胺= 19﹕1）电泳，检测双链 DNA 的长度多态性；另一种 是 SSCP（single strand conformation polymorphism）法， 即单链构象多态性，对未检出长度多态性的引物进一 步采用 SSCP 法，8%的聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺﹕ 甲叉双丙烯酰胺=29﹕1）电泳，检测单链 DNA 构象 多态性。用 SG-群体双亲 Sollux 和 Gaoyou 分离带型 作为参照，银染法染色，电泳结果扫描保存。 1.5 数据统计 根据电泳结果记录 81 份材料 DNA 扩增片段的电 泳分离带型，针对含油量 QTL 位点条带分离位置，同 Sollux 带型记为 1，同 Gaoyou 带型记为 2，缺失记为 –。 在 PC 机上利用 Microsoft Excel 进行考种数据及 QTL 标记数据的分类筛选计算；利用 SPSS 17.0 进行方差分 析和多重比较；以 2 个年份参试品种含油量数据作为重 复，以 MINQUE 方法[18] 计算遗传率。 2 结果 2.1 含油量性状 QTL 位点在品种中的分布 选取 SG-群体 7 个主效含油量 QTL 区间 14 个与 拟南芥油脂形成相关候选基因高度同源的基因标记， 逐一对 81 个油菜品种资源进行高、低含油量等位基因 带型分析，统计每个标记位点含不同等位基因品种含 油量的平均值和品种数（图 1）。位于 OilA1、OilA5 和OilA7置信区间的 6个基因标记ZAAS573、Ra2E04、 ZAAS919、ZAAS397、ZAAS828 和 ZAAS839，两种 标记基因型间品种含油量均值表现为携高油等位基因 材料明显高于低油等位基因品种，与 SG 群体中检测 到的 QTL 效应方向一致。位于 OilA1 区间的 ZAAS573 和Ra2E04，含Sollux等位基因品种含油量较含Gaoyou 等位基因的平均高约 1 个百分点, 与 QTL 的加性效应 值（a=0.46，aa=2×0.46）接近，81 个品种中分别有 52 和 32 个品种已包含 Sollux 等位基因；与 OilA5 和 OilA7 紧 密 连 锁 的 ZAAS919/ZAAS397 和 ZAAS828/ZAAS839，高油等位基因均源于 Gaoyou， 图 1 清晰表明含 Gaoyou 和 Sollux 二种等位基因品种 平均含油量间差异除 ZAAS397 较小，其余 3 个均高 出 2 个百分点以上，但多数品种基因组尚未携带此高 ZA A S5 73 R a2 E0 4 ZA A S9 19 ZA A S3 97 ZA A S8 28 ZA A S8 39 ZA A S6 19 ZA A S6 16 ZA A S4 01 ZA A S3 43 ZA A S8 93 ZA A S8 34 ZA A S4 33 ZA A S4 41 含 油 量 O il co nt en t ( % ) “+”指高油等位基因，“–”指低油等位基因；图中数字为品种数 “+” and “–” indicate the alleles for increasing and decreasing oil content at individual QTL loci; Numbers in the fig means the number of varieties for each marker genotypes at individual loci 图 1 7 个含油量 QTL 区间 14 个油脂形成相关候选基因标记基因型和平均含油量 Fig. 1 Marker genotypes and their correspondence of average oil content in 14 candidate gene marker loci located in the confidence intervals of 7 major QTL for oil content 19 期 孙中永等：油菜含油量性状 QTL 关联分析及有利等位基因在品种中的构成分析 3927 油等位基因；位于 OilC6 和 OilC8-1 区间的各 2 个标 记，ZAAS834和ZAAS441在品种中的检测结果与QTL 信息趋势一致，但 ZAAS893 和 ZAAS433 则正好相反， 含低油等位基因品种含油量反而高些；而与 OilC2 和 OilC3 连锁的 4 个标记，2 种标记基因型间含油量除 ZAAS619 有一定趋势，其余没有明显差异。 2.2 基于 QTL 候选基因的含油量性状关联分析 利用 MINQUE 方法，首先根据 2 年度 81 个品种 含油量表型数据估算出遗传力为 49.25%，说明该性状 是一个遗传力为中等大小的数量性状。为筛选获得与 油菜种子含油量显著相关的分子标记，对 14 个连锁标 记与 81 份品种资源进行标记基因型和含油量表现型 的关联分析，每标记位点 2 种等位基因含油量均值间 方差分析结果列于表 3。共有 4 个 QTL 位点的 6 个连 锁标记 Ra2E04（OilA1）、ZAAS919 和 ZAAS397 （OilA5）、ZAAS828 和 ZAAS839（OilA7）和 ZAAS441 （OilC8-1）高、低二种等位基因间平均含油量差异达 到显著或极显著水平（表 3），其对应拟南芥同源基 因分别是 At3g51830 、 At2g42450 、 At2g44620 、 At1g73600、At1g73480 和 At1g13560。说明这些基于 QTL 信息的标记用于辅助选择在不同遗传背景下证 明有效。通过对 4 个分别与不同 QTL 关联紧密的标记 Ra2E04、ZAAS919、ZAAS828 和 ZAAS441 的高油等 位基因跟踪选择和聚合，理论上可相应提高含油量约 7 个百分点。 分析上述 6 个差异显著标记在 81 个品种高、低两 种等位基因的分布，发现在 Ra2E04（OilA1）位点， 大部分欧洲春油菜（81.8%）和所有欧洲冬油菜均已 携 Sollux 等位基因，但在中国双低和双高品种中则仅 有 13%和 20%的品种含此等位基因；标记 ZAAS919 （OilA5）的检测结果，81 个品种中含高油等位基因 （Gaoyou）的品种只有 15 份，分布在中国双低（7 份）和中国双高品种（8 份）中，占同类型检测品种 的 30.43%和 22.86%，而所有被检欧洲春油菜（11 份） 和欧洲冬油菜（12 份）中均不存在；而 OilA5 区间另 一和 ZAAS919 相距 6 cM 标记 ZAAS397，含 Gaoyou 等位基因的品种有 44 个，较为均匀地分布在中国双 低、中国双高、欧洲春油菜和欧洲冬油菜中，分别占 各自同类型的 40%—60%。标记ZAAS828和ZAAS839 （OilA7）显示 Gaoyou 等位基因的材料分别只有 17 表 3 QTL 标记基因型和含油量表现型的关联分析 Table 3 Association analysis between oil content and QTL linked marker genotypes QTL 名称 QTL name 高油等位基因来源 Positive alleles 连锁标记 Linked marker Sollux 基因型 Gaoyou 基因型 差值 a D value P 值 b P value 品种数 N 均值 Mean (%) 品种数 N 均值 Mean (%) OilA1 Sollux ZAAS573 52 40.04 29 39.15 0.89 0.229 Ra2E04 32 40.61 49 39.28 1.33 0.048* OilA5 Gaoyou ZAAS919 66 39.27 14 41.77 2.50 0.006** ZAAS397 37 38.91 44 40.40 1.49 0.034* OilA7 Gaoyou ZAAS828 64 39.20 17 41.69 2.49 0.003** ZAAS839 60 39.46 21 41.57 2.11 0.046* OilC2 Sollux ZAAS619 33 40.34 48 39.29 1.05 0.142 ZAAS616 26 39.67 55 39.74 -0.07 0.930 OilC3 Gaoyou ZAAS401 39 39.79 40 39.54 -0.25 0.725 ZAAS343 34 39.83 47 39.64 -0.19 0.790 OilC6 Gaoyou ZAAS893 33 40.26 46 39.47 -0.79 0.268 ZAAS834 71 39.53 10 41.09 1.56 0.142 OilC8-1 Sollux ZAAS433 54 39.10 27 40.95 -1.85 0.012* ZAAS441 41 40.43 39 39.14 1.29 0.044* a 含高油等位基因品种含油量平均值和低油等位基因品种含油量平均值的差值；b*、**分别表示在 0.05 和 0.01 水平上差异显著 a indicates the difference of mean oil content between varieties carrying positive and negative allele in each QTL; *, ** indicate significant at 0.05and 0.01 level, respectively 3928 中 国 农 业 科 学 45 卷 和 21 份，主要分布在中国双低（5 和 9 份）和中国双 高品种（8 和 10 份）中，但出现的频率也偏低。只发 现 1 个欧洲春油菜，2 个欧洲冬油菜品种在这两个标 记位点上含 Gaoyou 等位基因。与 OilC8-1 显著相关的 ZAAS441 位点有半数（40 个）品种携带 Sollux 高油 等位基因，包括中国双低和双高品种各 12 个（52.17%） 和 9 个（25.71%），欧洲春油菜 9 个（81.82%）和欧 洲冬油菜 10 个（83.33%）。 2.3 有利 QTL 聚合效果分析 为了检验 SG-群体在 11 个环境中获得的 QTL 信 息在育种中的应用价值，从 P 值达到显著或极显著的 6 个标记中选取 4 个与含油量性状关联紧密的标记 Ra2E04、ZAAS397、ZAAS828 和 ZAAS441（对应 4 个 QTL）按 81 个品种的标记基因型进行所有出现的 单标记、双标记、三标记和四标记随机组合（类型组 合数只有 1—2 个的未包括），比较含油量的变化趋势 （图 2，表 3）。图 2 清晰地显示出随着高油等位基因 聚合数量的增加，含油量逐步提高。4 个标记位点均 含低油等位基因的10个品种平均含油量为37.62%（表 3，类型 1），在所有 10 个类型中为最低；含一个高 油等位基因（类型 2）的品种含油量平均数在 37.86% —39.61%，而不含高油 OilA7 的二标记组合（类型 3， 含 油 量 O il co nt en t ( % ) 0：所有 4个QTL位点均含低油等位基因；1—4分别代表与OilA1、OilA5、 OilA7 和 OilC8-1 紧密连锁的分子标记 Ra2E04、ZAAS397、ZAAS828 和 ZAAS441 显示高油等位基因型 0: varieties containing unfavorable marker alleles in all 4 major QTL loci; 1-4 represent marker genotypes showing favorable alleles in each of 4 QTL loci (OilA1, OilA5,OilA7 and OilC8-1) by closely linked markers Ra2E04, ZAAS397, ZAAS828 and ZAAS441, respectively 图 2 4 个 QTL 位点高油等位基因间随机组合和相应品种平 均含油量的分布（n=81） Fig. 2 Marker-defined genotypes with different allele combinations on 4 oil QTL loci and their corresponding phenotypes of mean oil content in 81 rapeseed materials 1+4/2+4）含油量在 40%左右，但所有这些标记组合内 品种间含油量波动均较大（SD 在 2.39—3.42），组合 间差异未达显著；但当聚合了 OilA5 和 OilA7 2 个高油 等位基因时（类型 3，2+3），含油量达 40.78%，较 类型 1 显著提高；三基因聚合时（类型 4，1+2+4）较 类型