猪流行性腹泻病毒RT_PCR检测方法的建立

猪流行性腹泻病毒ＲＴ－ＰＣＲ检测方法的建立 罗永珍 （青海省湟源县城关镇兽医站，青海湟源　８１２１００） 摘要：试验根据ＧｅｎＢａｎｋ上发的猪流行性腹泻病毒（ＰＥＤＶ）核衣壳（Ｎ）蛋白基因序列，设计合成了一对寡聚核苷酸引 物，扩增大小为２４５ｂｐ的目的片段，建立起ＰＥＤＶ　Ｎ 基因的ＲＴ－ＰＣＲ检测方法。试验结果表明，该方法具有很强特异性和很 高的敏感性，可作为猪流行性腹泻临床快速诊断的一种方法。 关键词：猪流行性病毒；ＲＴ－ＰＣＲ；检测 中图分类号：Ｓ８５８．２８　　　　　文献标识码：Ａ　　　　　文章编号：１６７１－７２３６（２０１２）０５－００７９－０３ 　　 猪流行性腹泻 （ｐｏｒｃｉｎｅ　ｅｐｉｄｅｍｉｃ　ｄｉａｒｒｈｅａ， ＰＥＤ）是由猪流行性病毒（ｐｏｒｃｉｎｅ　ｅｐｉｄｅｍｉｃ　ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ，ＰＥＤＶ）引起的一种以呕吐、腹泻和脱水为特 征的猪 肠道 传 染 病。ＰＥＤＶ 属 于 尼 多 病 毒 目 （Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ）冠状病毒科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）冠状病毒 属（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ），其基因组为单链正股ＲＮＡ，全长 为２８０３３ｎｔ。ＰＥＤＶ粒子形态与其它冠状病毒非常 相似，呈多形性，直径９５～１９０ｎｍ，外有囊膜，囊膜 上有花冠状的纤突，纤突长１８～２３ｎｍ。近年来，国 内外学者对ＰＥＤ的诊断方法行了较为深入的研究， 先后建立了显微病变观察、中和试验（ＮＴ）、免疫荧 光技术（ＩＦ）、酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）、免疫组织 化学法、病毒分离、聚合酶链反应（ＰＣＲ）和探针原位 杂交等，而便捷、敏感、高效的特点使得ＰＣＲ技术在 疫病诊断中得到广泛应用。本研究以ＰＥＤＶ疫苗 株Ｎ蛋白基因为研究对象，建立了ＰＥＤＶ的 ＲＴ－ ＰＣＲ检测方法，用于猪流行性腹泻的临床诊断，也 为Ｎ蛋白基因的表达奠定了基础。 １　材料与方法 １．１　病毒株　猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎 病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪蓝耳病毒、猪乙型脑 炎病毒为山东滨州预防兽医学与动物生物技术重点 保存。 １．２　细胞及来源　Ｖｅｒｏ细胞由山东滨州预防兽医 学与动物生物技术重点实验室保存。 １．３　引物　根据 ＧｅｎＢａｎｋ上发表的ＰＥＤＶ　Ｎ蛋 白基因序列，ＤＮＡＭＡＮ比对所有ＰＥＤＶ　Ｎ蛋白基 因序列，利用Ｐｒｉｍｅｒ　５．０在保守区设计１对引物， 收稿日期：２０１１－１０－０４ 作者简介：罗永珍（１９７３－），女，青海人，本科，研究方向：兽 医技术。 扩增目的片段大小为２４５ｂｐ。引物序列为：Ｐ１：５′－ ＴＴＴＴＴＣＧＣＴＴＴＣＡＧＣＡＴＣＣＴ－３′；Ｐ２：５′－ＧＴＡＧ－ ＣＡＡＣＣＴＴＡＴＡＧＣＣＣＴＣＴ－３′。引物由上海生物 技术有限公司合成。 １．４　病毒ＲＮＡ制备　采用上海生工公司的Ｔｒｉｚｏｌ 试剂合提取ＲＮＡ。主要步骤为：①取病毒接种细胞 一瓶，反复冻融３次，７０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，吸出 上清。②取２００μＬ上清液后加入４００μＬ　Ｔｒｉｚｏｌ，振 荡１ｍｉｎ，静置１０ｍｉｎ，加入２００μＬ氯仿，混匀后静 置１０ｍｉｎ，４℃１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ。③取出 上清转移至一个新的离心管中，加入一倍体积以上 异丙醇，颠倒混匀，－２０℃沉淀５０ｍｉｎ，４℃１２０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，沉淀溶于２０μＬ　ＤＥＰＣ－Ｈ２Ｏ。 １．５　ＲＴ－ＰＣＲ反应 １．５．１　反转录（ＲＴ）　２５μＬ反转录体系中，反转 录引物（Ｐ２）２μＬ，模板１１μＬ，７０℃加热１０ｍｉｎ，冰 浴１０ｍｉｎ；再加入５×Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ；２．５ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰ　５μＬ，ＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １μＬ，ＡＭＶ 反 转 录 酶 １ μＬ，充 分 混 合 后 离 心，４２℃，６０ｍｉｎ，７０℃１５ｍｉｎ灭活反转录酶，冰 浴２ｍｉｎ，－２０℃保存。 １．５．２　ＰＣＲ　反转录产物５μＬ，１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ，２．５ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰ　４μＬ，上（Ｐ１）、下（Ｐ２）游 引物各１μＬ，ｒ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　０．５μＬ，加水 至５０μＬ。优化ＰＣＲ循环参数，确定ＰＣＲ的最佳反 应程序为：９４℃变性４５ｓ，５２℃退火４５ｓ，７２℃延 伸４５ｓ，３５个循环；７２℃延伸５ｍｉｎ。取５μＬ　ＰＣＲ 产物，１％琼脂糖凝胶电泳检测。 １．６　最佳退火温度的确定　分别采用不同的退火 温度进行ＰＣＲ反应，总体系２５μＬ，反应条件：９４℃ 预变性５ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ；４５、４８、５２、５６、６０、６３、 ６４℃退火，时间均采用４５ｓ，７２℃延伸３０ｓ，３４个 ·９７·中国畜牧兽医 　２０１２年第３９卷第５期 生物技术 循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ；４℃终止反应。 １．７　最佳ｄＮＴＰ浓度确定 　其它条件相同，在最 佳退火温度下，分别采用不同的ｄＮＴＰ浓度０．０５、 ０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３ｐｍｏｌ／μＬ进行２５μＬ体系 的ＰＣＲ反应。 １．８　最佳 Ｍｇ２＋浓度确定　其它条件相同，在最佳 退火温度和ｄＮＴＰ浓度下，分别采用不同的 Ｍｇ２＋ 浓度０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０ｐｍｏｌ／μＬ进行２５ μＬ体系的ＰＣＲ反应。 １．９　最佳Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶终浓度确定　其它条 件相同，在最佳退火温度和ｄＮＴＰ、Ｍｇ２＋浓度条件 下，分 别 采 用 Ｔａｑ　ＤＮＡ 聚 合 酶 终 浓 度 为 ０． ２５、０．７５、１．２５、１．７５、２．２５Ｕ／２５μＬ进行２５μＬ体 系的ＰＣＲ反应。 １．１０　敏感性试验　将ＰＥＤＶ按照其病毒滴度以 １０倍比例稀释，提取核酸，以反转录的ｃＤＮＡ作为 模板，用已确定的最佳反应条件进行ＰＣＲ反应，以 确定该方法的敏感性。 １．１１　特异性试验　用已提取的 ＴＧＥＶ、ＰＥＤＶ、 ＲＶ、ＣＳＦＶ、ＰＲＲＳＶ和ＪＥＶ的ｃＤＮＡ为模板，用已 确定的最佳反应条件进行ＰＣＲ反应，以确定该方法 的特异性。 １．１２　ＰＣＲ产物测序鉴定　将ＰＣＲ产物送上海生 物工程有限公司测序，将测序结果与ＧｅｎＢａｎｋ中序 列进行比较。 １．１３　临床应用　从不同地区猪场的疑似病猪采取 病变组织样品，用已建立的ＲＴ－ＰＣＲ方法和本实验 室病毒分离鉴定方法进行符合比较。 ２　结果与分析 ２．１　ＰＣＲ反应条件的确定和优化 ２．１．１　退火温度的确定　采用不同的退火温度进 行ＰＣＲ扩增，电泳结果图１所示，在４５～６３℃范围 内均可扩增出目的片段，最终确定中间反应温度５６ ℃为最优退火温度。 图１　ＰＣＲ反应退火温度的确定 注：Ｍ为ＤＬ２０００ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１～７分别为４５、４８、５２、５６、６０、 ６３、６４℃退火温度下扩增的ＰＣＲ产物。 ２．１．２　ｄＮＴＰ浓度确定 　采用不同浓度的ｄＮＴＰ 进行ＰＣＲ反应，电泳结果见图２所示。从结果可以 看出最佳ｄＮＴＰ终浓度为０．１～０．１５ｐｍｏｌ／μＬ。 图２　ＰＣＲ最佳ｄＮＴＰ浓度的确定 注：Ｍ 为 ＤＬ２０００ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１～６ 中 ｄＮＴＰ 浓度分别 为０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３ｐｍｏｌ／μＬ；７为空白对照。 ２．１．３　Ｍｇ２＋浓度确定 　采用不同浓度的 Ｍｇ２＋进 行ＰＣＲ反应，电泳结果如图３所示。从结果可以看 出最佳 Ｍｇ２＋终浓度为１．０～２．０ｐｍｏｌ／μＬ。 图３　ＰＣＲ最佳引物浓度的确定 注：Ｍ为ＤＬ２０００ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１～６中Ｍｇ２＋浓度分别为０．５、 １．０、１．５、２．０、２．５、３．０ｐｍｏｌ／μＬ；７为空白对照。 ２．１．４　Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶终浓度确定 　采用不同浓 度的Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶进行ＰＣＲ反应，结果见图４，试 验结果表明，Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶终浓度为０．０５Ｕ／μＬ。 图４　最佳Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶浓度确定 注：Ｍ为ＤＬ２０００ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１～５中Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶浓度 分别为０．２５、０．７５、１．２５、１．７５、２．２５ Ｕ／２５μＬ；６为空 白对照。 ２．２　敏感性试验 　将ＰＥＤＶ按照其病毒滴度分别 ·０８· 生物技术 中国畜牧兽医 　２０１２年第３９卷第５期 进行系列稀释，提取核酸，并以反转录的ｃＤＮＡ作为 模板，用已确定的最佳反应条件进行ＰＣＲ反应，结果 见图５，可知该ＰＣＲ敏感度为ＰＥＤＶ　１０ＴＣＩＤ５０。 图５　ＰＣＲ敏感性试验 注：Ｍ为ＤＬ　２０００ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１～３分别为１００至１０－２倍稀 释的ＰＥＤＶ；４为空白对照。 ２．３　特异性试验 　提取ＴＧＥＶ、ＰＫ－１５细胞对照、 ＰＥＤＶ、Ｖｅｒｏ细胞对照、ＲＶ、ＣＳＦＶ、ＰＲＲＳＶ和ＪＥＶ 的ＲＮＡ，分别以它们的反转录产物为模板，用已确 定的最佳反应条件进行ＰＣＲ反应，电泳结果见图６ 所示，以ＴＧＥＶ、ＰＥＤＶ提取的核酸为模板，只能扩 增出２４５ｂｐ的条带；而其它为阴性。 ２．４　ＰＣＲ产物测序鉴定 　将 ＲＴ－ＰＣＲ 扩增的 ＰＥＤＶ的产物测序结果分别与 ＧｅｎＢａｎｋ中已发表 的基因序列进行比较，同源性可达到９９．５％以上。 ２．５　临床应用　应用ＲＴ－ＰＣＲ方法对２０份病料进 行检测，并分别与实验室建立的病毒分离鉴定结果作 比较，符合率为１００％。表明所建立的ＲＴ－ＰＣＲ敏感 性与病毒分离无差异，可用于临床病料检测。 图６　ＰＣＲ特异性试验 注：Ｍ为ＤＬ　２０００ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１～９分别为以ＴＧＥＶ、ＰＫ－１５ 细胞对照、ＰＥＤＶ、Ｖｅｒｏ细胞对照、ＲＶ、ＣＳＦＶ、ＰＲＲＳＶ、ＪＥＶ 的反转录产物为模板。 ３　讨论 本研究建立的ＲＴ－ＰＣＲ敏感性高，最小检出量 １０个ＴＣＩＤ５０ＰＥＤＶ；同时间不同其它相关病毒、组 织的ＲＮＡ发生扩增，表明本方法具有很好的特异 性。ＰＣＲ的特异性和敏感性一般取决于引物的特 异性、Ｔａｑ酶的质量、模板的纯度、Ｍｇ２＋浓度及退火 温度等因素。本方法选取相对保守的Ｎ 基因中高 度保守的区域设计１对扩增２４５ｂｐ片段的引物，试 验还对反应体系中 Ｍｇ２＋浓度进行摸索，发现商品 化带有 Ｍｇ２＋的ＰＣＲ缓冲液均可有效地扩增出目 的片段。Ｍｇ２＋浓度在此方法中对ＰＣＲ反应得特异 性影响不是很大。本研究的进行为猪流行腹泻病毒 临床快速检测提供了技术支持，同时为猪流行性腹 泻病毒、猪传染性胃肠验、猪轮状病毒多重ＰＣＲ检 测方法的建立奠定了基础。 Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　ＲＴ－ＰＣＲ　ｆｏｒ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｏｒｃｉｎｅ　Ｅｐｉｄｅｍｉｃ　Ｄｉａｒｒｈｅａ　Ｖｉｒｕｓ ＬＵＯ　Ｙｏｎｇ－ｚｈｅｎ （Ｔｈｅ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｓｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｈｅｎｇｇｕａｎ　Ｔｏｗｎ，Ｈｕａｎｇｙｕａｎ　Ｃｉｔｙ　ｉｎ　Ｑｉｎｇｈａｉ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｈｕａｎｇｙｕａｎ　８１２１００，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ａｒｔｉｃｌｅ　ａｃｔｓ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｇｅｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｎ　ＧｅｎＢａｎｋ　ａｎｄ　ｄｅｓｉｇｎｓ　ｏｎｅ　ｐａｉｒ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｈｉｃｈ　ｃｏｕｌｄ　ａｍｐｌｉｆｙ　２４５ｂｐ　ｆｒａｇｍｅｎｔ．Ａ　ｓｅｒｉｅｓ　ｏｆ　ｔｅｓｔ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｉｓ　ｍｅｔｈｏｄ　ｈａｓ　ｔｈｅ　ｖｅｒｙ　ｓｔｒｏｎｇ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ａｎｄ　ｔｈｅ ｖｅｒｙ　ｈｉｇｈ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ｍａｙ　ｔａｋｅ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｅｐｉｄｅｍｉｃ　ｄｉａｒｒｈｅａ　ｖｉｒｕｓ　ｔｈｅ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｆａｓｔ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｎｅ　ｍｅｔｈｏｄ． Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｐｏｒｃｉｎｅ　ｅｐｉｄｅｍｉｃ　ｄｉａｒｒｈｅａ　ｖｉｒｕｓ；ＲＴ－ＰＣＲ；ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ 櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅 櫅 櫅 櫅 櫅 櫅 櫅 櫅 櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅 櫅 櫅 櫅 櫅 櫅 櫅 櫅 殯 殯殯 殯 书　讯 　　２０１０、２００９、２００８年合订本（每册１２８元），并有少量２００４、２００５年合订本（每册７０元），１９９９、２０００、 ２００１、２００２、２００３年合订本（每册４０元）。如有订购者，请汇款到：１００１９３中国农业科学院北京畜牧兽医 研究所　《中国畜牧兽医》编辑部收。 ·１８·中国畜牧兽医 　２０１２年第３９卷第５期 生物技术