黄鳝血清转铁蛋白的提取及表征

第12卷第1期 过 程 工 程 学 报 Vol.12 No.1 2012 年 2 月 The Chinese Journal of Process Engineering Feb. 2012 收稿日期：2011−06−03，修回日期：2011−12−20 基金项目：国家自然科学基金资助项目(编号：20872093)；上海市教委基金资助项目(编号：1122122)；上海市重点实验室基金资助项目(编号：07dZ22303) 作者简介：王博文(1989−)，女，山西省临汾市人，硕士研究生，高分子化学与物理专业；任天瑞，通讯联系人，Tel: 021-64328850, E-mail: trren@shnu.edu.cn 黄鳝血清转铁蛋白的提取及征 王博文 1,2， 任天瑞 1,2， 董亚明 1， 王 丰 1,2 (1. 上海师范大学生命与环境科学学院；2. 上海师范大学资源化学教育部重点实验室，上海 200234) 摘 要：对从黄鳝血液中提取的蛋白层析纯化后进行生物质谱测试，确定为血清转铁蛋白. 利用十二烷基硫酸钠−聚 丙烯酰胺凝胶电泳、原子力显微镜、圆二色谱法对蛋白的分子量、表面形貌、二级结构进行了表征. 结果表明，该转 铁蛋白分子量为 74 kDa，含量为 0.750 mg/mL，含α-螺旋 29.8%，β-折叠 6.6%. 关键词：黄鳝；转铁蛋白；十二烷基硫酸钠−聚丙烯酰胺凝胶电泳；生物质谱；原子力显微镜 中图分类号：R284.2；Q956 文献标识码：A 文章编号：1009−606X(2012)01−0125−06 1 前 言 黄鳝(Monopterus albus)属合鳃鱼目，合鳃鱼科，黄 鳝属，亦称罗鳝、蛇鱼、长鱼，为热带及暖温带鱼类， 主要分布于中国东南部和泰国、印度尼西亚等东南亚地 区. 黄鳝有补血补气 [1,2]、消炎消毒 [3]、除风湿等功 效 . 其富含二十二碳六烯酸(DHA)和卵磷脂，这些物质 是人类脑细胞生长不可缺少的营养成分[4]. 黄鳝所特有 的黄鳝素能调节血糖，其肉质所含脂肪极少，是糖尿病 人、体虚、产后患者的理想食品. 此外，黄鳝血还可治 疗口眼歪斜，在中医药方面有很多用途. 黄鳝在中医学领域的药用价值很大，同时随着分子 生物学和生物技术的飞速发展,具有生物活性的黄鳝蛋 白和多肽的分离、纯化和鉴定已有报道. 皮建华等[5]制 备了鳝鱼抗 H 血清；尹绍武[6]观察了黄鳝的红细胞，测 定了其脱氧核糖核酸(DNA)含量；李联泰等[7]综述了黄 鳝研究现状及其活性物质研发的前景，归纳总结了黄鳝 遗传学、分子生物学、氮代谢及活性物质的最新研究成 果；诸葛燕[8]比较了 7 种淡水鱼中天然色素和酪氨酸酶 的活性；Siripan 等[9]比较了亚洲鳗鱼、鳝鱼的血细胞值， 并观察了其形态；李连泰[10]从全血中提取出鳝鱼凝血 酶，具有相当高的凝结活性. 血清转铁蛋白(Serotransferrin, Tf)具有很好的增强 机体免疫力的生理功能[11]，能促进婴幼儿对铁及营养物 的吸收，能有效防止贫血[12]、抑制肠道致病菌和病毒体 内自由基的生成[13]、缓解类风湿关节炎和抗衰老. Tf 是 体液中不可缺少的成分，不仅参与呼吸、细胞增殖和免 疫系统的调节，还能调节铁离子平衡和能量平衡，更具 有抗菌杀菌的保护功能[14,15]. 龙华等[13]用硫酸铵分级沉 淀法及十二烷基硫酸钠−聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS− PAGE)法获得了含鲤(Cyprinus carpio)血清转铁蛋白的 条带，同时除去 SDS 及考马斯亮蓝，分离纯化了转铁 蛋白，并进行了铁离子结合实验及光谱分析，结果表明， 转铁蛋白结合铁离子后的特异吸收峰为 467 nm，说明去 SDS 后蛋白仍具有很强的结合能力，用 SDS−PAGE 法 测得鲤血清 Tf 分子量约为 74000 Da. 杨严俊等[16]采用 固定化金属螯合亲和色谱法(IMAC)从蛋清中分离和提 取卵转铁蛋白(OVT), OVT 纯度达 96%，远高于商品 OVT 纯度，分子量为 76500 Da. 截至目前，未见对黄 鳝体内的蛋白质进行生物质谱鉴定、原子力显微镜 (Atomic Force Microscope, AFM)表面形貌表征及圆二 (Circular Dichroism, CD)色谱测定. 黄鳝在我国南方分布广泛，人们主要是食用其肉， 所以黄鳝血液来源相对丰富且价格便宜，利用率较低， 是一种极为重要的天然药物开发资源，同时也是一种很 好的药物原材料. 本研究通过研究黄鳝血清蛋白，提取 具有药理活性的蛋白质化学组分，开发黄鳝的药用成 分，提高黄鳝的利用价值. 准确测定了黄鳝血清转铁蛋 白的分子量及相对含量，并对血清转铁蛋白进行表征， 首次对黄鳝体内的蛋白质进行了生物质谱鉴定、AFM 表面形貌的表征及 CD 色谱的测定，得到的蛋白结构数 据可为进一步对其进行药理研究打下基础. 2 实 验 2.1 原料和仪器 实验材料：新鲜黄鳝购自超市；硫酸铵、聚乙二醇 (Carbowax 4000W)、氯化钠、三羟甲基氨基甲烷(Tris)， 十二烷基硫酸钠(SDS)、过硫酸铵、甘氨酸、巯基乙醇、 甘油、溴酚蓝、考马斯亮蓝 R250、甲醇、冰醋酸、氨 水、氯化钾、磷酸二氢钾、浓盐酸购于上海国药有限公 司；丙烯酰胺(Acr)、双甲叉基丙烯酰胺(Bis)、四甲基乙 二胺溴化乙啶(TEMED)、预染色蛋白质分子量标准 126 过 程 工 程 学 报 第 12 卷 (Prestained Protein Marker)购于生工生物有限公司，以上 试剂均为分析纯；层析介质为 Deithylaminoethyl cellulose DE52, 由英国 Whatman 公司生产. 实验仪器：Anke GL-16G-H 型高速冷冻离心机(上 海安亭科学仪器厂)，DW-FL135 低温冰箱(中科美菱低 温科技有限责任公司)，24-DN 制胶器，DYY-3C 电泳仪 (北京六一仪器厂)，WD-9413B 凝胶成像分析仪(上海沪 西分析仪器厂)，CXG-1 电脑恒温层析柜(上海沪西分析 仪器厂)，J-715 圆二色谱仪(CD，日本 JASCO 会社)， LTQ-Velos 质谱仪(MS，美国 ThermoFinnigan 公司)， Digital Instrument NanoScope IV 原子力显微镜(AFM，铂 悦仪器有限公司)，透析袋(即用型，截留分子量 10000 Da，压平宽度 16 mm，直径 10 mm，长 1 m，上海生工 生物有限公司)，超滤管(美国 Millipore 公司，截留分子 量 10000 Da). 2.2 实验方法 2.2.1 黄鳝血清的制备 取 100 mL 黄鳝新鲜血液于 15℃静置沉淀 1 h，得 深红色块状物质，放入 4℃冰箱静置 12 h. 离心，弃去 血细胞，取上清液，即得血清. 2.2.2 球蛋白的提取与纯化 下述所有操作过程均在 4℃下进行. 用 50% (NH4)2SO4溶液盐析法提取血清 2 次，得粗 蛋白，按文献[17]的方法透析除盐. 采用阴离子交换柱层析纯化球蛋白，交换柱填料为 DE52，用 0.01 mol/L 的 PBS 磷酸缓冲液(pH 7.0)充分平 衡，装柱. 将除盐后的蛋白溶于缓冲液. 硫酸铵沉淀物用层 析柱缓冲液(0.01 mol/L PBS, pH 7.02)透析平衡. 将透析平衡后的蛋白液控制流速加到柱上，上样量 为 10 mg(约 4 mL)，上样时间约 2 min. 柱层析条件：洗 脱速度 0.3 mL/min，每管收集 5 mL 紫外检测，波长 254 nm. 收集峰值范围内组分，用透析法和超滤法浓缩备用. 2.2.3 蛋白质含量的测定 蛋白质含量采用紫外分光光度法按文献[17]的方法 测定. 在波长280和260 nm处分别测得待测样品的光密 度值(OD280和 OD260)，以 0.01 mol/L 磷酸缓冲溶液(pH 7.2)作空白对照，用吸收差法经验计算蛋白质浓度： 蛋白质浓度(mg/mL)=(1.45A280−0.74A260)×稀释倍数, 式中，A280和 A260分别为波长 280 和 260 nm 处待测样品 的吸光度. 2.2.4 血清球蛋白的纯度及分子量测定 采用 SDS−PAGE 凝胶电泳法，所用标准蛋白质如 表 1 所示. 表 1 标准蛋白 Table 1 Standard proteins Molecular weight (kD) Protein name Source 14.2 Lysozyme Albumen 21.5 Soybean trypsin inhibitor Soybean 31 Carbonic anthydrase Cattle 45 Ovalumin Hen egg white 66 Bovine serum albumin, BSA Cattle 97.4 Phosphorylase B Rabbit 浓缩胶浓度 4%，分离胶浓度 12.5%. 待测样品与样 品缓冲液(0.0625 mol/L Tris−HCl, pH 7.0，含 2% SDS, 10%甘油，0.05%溴酚蓝)体积比 1:1 混合；加入终浓度 2.5%的 2-巯基乙醇，沸水浴 10 min，冷却至室温后上样. 先 100 V 恒压电泳 20 min，再 200 V 恒压电泳 40 min, 0.25%考马斯亮蓝 R250 溶液[甲醇:乙酸:水=40:10:50(ϕ) 配成]固定并染色，7.5%乙酸溶液(含 5%甲醇)脱色. 2.2.5 蛋白的表面形貌表征 采用原子力显微镜表征蛋白质表面形貌. 所用探 针微悬臂为氧化蚀刻硅微悬臂，采用轻敲(Tapping)模式 成像，所用基片为新剥离的云母片 . 将云母片浸于 NH4OH:H2O2:H2O=1:2:5(ϕ)的溶液中，恒温 80℃浸泡 5 min，再于 H2O:30% H2O2:37% HCl=6:1:1(ϕ)的溶液中 80 ℃恒温浸泡 5 min，用水和乙醇反复冲洗，云母表面形 成亲水层，置于干燥器中备用. 在实验温度 25℃，湿度 50%下，取 0.75 mg/mL 血 清蛋白液 10 μL 滴到处理过的云母表面使其形成薄膜， 30 min 后用去离子水轻轻冲洗表面以除去杂质盐沉积 物和弱吸附蛋白质，再用无水乙醇洗涤表面脱去水分， 在无尘台上自然风干后用 AFM 观察. 2.2.6 蛋白的圆二色谱测定 首先用溶解蛋白的缓冲液在相同的仪器条件下扫 描基线，移除缓冲液，将待测样品即蛋白液放入样品池 中进行扫描，从扫描图谱中减去基线的影响. 最后运用 JASCO J-715 型圆二色谱系统分析软件对图谱数据进行 定量计算. 圆二色谱测量温度为 25℃，样品蛋白液的测量范 围为 190∼260 nm，灵敏度设为标准，扫描速度为 100 nm/min，测量次数 8∼16 次. 2.2.7 蛋白液的生物质谱检测 用胰蛋白酶酶解蛋白质，高效液相色谱(HPLC)分 离酶解肽段，柱子规格为 0.15 mm×15 cm(Column Technology Inc.)，色谱柱为 Zorbax 300SB C18(Agilent)， 检测器扫描范围 300∼1800 Da. 电喷雾离子阱质谱 (ESI-ITMS)在线测定完整肽段的分子量，再根据其 MS/MS 谱解析(人工解析或蛋白质数据库自动搜寻)肽 第 1 期 王博文等：黄鳝血清转铁蛋白的提取及表征 127 段的序列. 质谱条件：正离子检测，微喷进样，毛细管 柱温 200℃，流动相为 0.1%甲酸−84%乙腈，流速 65 μL/min. 产 生 的 串 联 质 谱 图 生 成 质 量 数 据 文 件 在 Smegmamorpha蛋白库中进行检索比对，SEQUEST结果 过滤参数为：肽段电荷数为1时，互相关系数Xcorr≥1.9， 为2时，Xcorr≥2.2，为3时，Xcorr≥3.75，分值差异≥0.1. 3 结果与讨论 3.1 球蛋白的分离纯化 DE52 柱层析色谱如图 1 所示. 流动相为 pH 值 7.0 的 PBS 缓冲液，梯度范围为 0.01~0.05 mol/L. 随洗脱梯 度增加，依次出现 2 个蛋白峰，第 1 个层析峰 A−B 与 第 2 个层析峰 C−D 相比，峰面积小得多，且峰高与峰 宽也远不如 C−D，说明仅有少量蛋白出现；二者没有重 叠，表明样品中 2 种蛋白已完全分开，预示后者在其分 部份收集过程中纯度较高，为上样量的 70%以上；第 1 种蛋白的洗脱体积为 30 mL，第 2 种蛋白的洗脱体积为 228 mL，继续用 PBS 溶液洗脱，未发现其他组分，洗 脱效果较好. 分别收集含蛋白的 2 种组分，经饱和硫酸 铵法提取得到的球蛋白粗提物在磷酸缓冲溶液中呈微 黄色. 盐析法提取的蛋白纯度不能满足制备单克隆抗体 及其他高纯度产品的要求. 为此，经盐析沉淀后采用离 子交换层析方法得到纯度较高的蛋白，根据文献[17]选 择 0.01~0.05 mol/L 梯度范围. 图 1 黄鳝血清蛋白的 DE52 柱层析色谱 Fig.1 DE52 ion-exchange column chromatography of Monopterus albus serum protein 3.2 黄鳝血清组分分析 紫外分光光度法测得蛋白质浓度为 0.750 mg/mL. 通过 SDS−PAGE 凝胶电泳对其蛋白纯度进行鉴定，结 果如图 2 所示，泳道 1 为标准蛋白，泳道 2 为经 DE52 离子交换柱层析纯化后浓缩的蛋白液. 黄鳝血清球蛋白 在 SDS 和 2-巯基乙醇的作用下分子中共价二硫键被还 原，解离成亚基形式，单体的球蛋白被拆解为 H 和 L 链亚单位，所以每种蛋白应该有分别代表 H 和 L 链亚 单位的 2 个条带. 经 DE52 离子交换柱层析纯化后，每 种组分中都只有 1 个明显而清晰的条带，原因是盐析法 和柱层析法纯化蛋白的过程较长，蛋白易降解，使分子 量较小的条带不易看出. 从图可明显看出 2 种组分的分 子量不同，且差异较大. 用 Gel-Pro-Analyzer 分析软件 可得黄鳝血清蛋白分子量 A−B 约为 16 kDa, C−D 约为 72 kDa. 鲫鱼[18]、草鱼[19]、欧洲鳗[20]、鲈鱼[21]、莫桑比 克罗非鱼[22]和大黄鱼[23]等的血清球蛋白[24]重链的分子 量为 52~79 kDa，可见需要的球蛋白为 C−D 组分. (a) A−B (b) C−D 图 2 黄鳝血清蛋白 SDS−PAGE 电泳图谱及分子量鉴定 Fig.2 SDS−PAGE of serum protein from Monopterus albus 3.3 蛋白液的种类鉴定 对纯化后的球蛋白进行生物质谱检测，以鉴定其具 体种类. 用 SEQUEST 程序在蛋白数据库(如 OWL 或 nr 库)中搜寻MS/MS谱. 蛋白的质谱Basepeak图显示主要 色谱峰分得较清楚，HPLC 分离取得到了较好效果. 蛋 白的质谱 Basepeak 图在每个主要峰上都标出了具体的 保留时间，如 2.41 min 时有 1 个丰度为 17%的峰，7.00 min 时有 1 个丰度为 100%的峰，8.22 min 时有 1 个丰度 为 72%的峰. 从中选择信号最强烈的 10 个峰，保留时 间分别为 7.00, 8.22, 10.00, 12.06, 13.6, 15.33, 20.79, 28.50, 33.15, 40.30 min，进行 MS/MS 检测，得出表 2 的鉴定结果. 表中 Protein group 即从 Smegmamorpha 蛋 白库中搜库得到的蛋白质组群，编号中的第一个数字相 同表示同源性较好，为一个组群，组群序号从 1 到 4 表 示可信度由强到弱；Sequence 是根据 MS/MS 谱数据从 Smegmamorpha 蛋白库中搜寻得到的对应的序列名称， MW为重均分子量，Cover percent 为覆盖率，Pep count 10 15 20 25 30 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 A bs or ba nc e Time (h) BA C D Da 97 400 66 200 43 000 31 000 20 100 14 400 Da 97 400 66 200 43 000 31 000 20 100 14 400 1 2 1 2 128 过 程 工 程 学 报 第 12 卷 即在 Smegmamorpha 蛋白库中自动搜寻得到的肽段数， Unique pep count 即唯一肽段数，PI 为蛋白质的等电点， PI rank 为等电点范围，是根据搜库结果得到序列，根据 序列计算得到的；Charge 为电荷数；Identified name 即 蛋白的 ID 号，根据搜库可以找到蛋白质组群的种类. 由表 2 可看出蛋白质组群 1 有 2 个肽段，分别为 K.LCELCK.G 和 K.SDDYQLICPGK.G.，分子量为 74600 Da. 分子量组群 2-1 为 87514.4 Da，组群 3-1 为 51541.4 Da，组群 4 为 35223.1 Da. 唯一肽段数≥2 合格，组群 1 唯一肽段数为 2，组群 2, 3 和 4 唯一肽段数均为 1，因 此，只有蛋白质组群 1 可信. 组群 1∼4 的等电点分别为 6, 7.61, 8.53 和 8.14，等电点范围均为 1. 肽段 K.LCELCK.G 的电荷数为 1, K.SDDYQLICPGK.G 的电 荷数为2. 根据 ID号可知1-1为血清转铁蛋白和其前体， 1-2 为血清转铁蛋白的前体，来自稻田鱼 (Oryzias latipes). 从 Smegmamorpha 蛋白库中自动搜寻，由于该库中 没有黄鳝蛋白，对库中相似的其他鱼类进行比对. 根据 Protein group 的编号，鉴定该 MS/MS 谱(组群序号为 1， 排列在第 1 位, 相关性值为 1)最可能为稻田鱼的血清转 铁 蛋 白 的 肽 谱 ， 其 肽 段 为 K.LCELCK.G 和 K.SDDYQLICPGK.G ，分子量约为 74600 Da ，与 SDS−PAGE 测得的分子量一致. 唯一肽段数为 2，合格, 提取出的蛋白为 Serotransferrin，即血清转铁蛋白. 表 2 血清蛋白的质谱鉴定结果 Table 2 Mass spectrometry appraisal result of serum proteins Protein group Sequence MW (Da) Cover percent (%) Pep count Unique pep count PI PI rank Charge Identified name (ID) 1-1 6.08 Rec name: Full=Serotransferrin, Flags: Precursor 1-2 6.14 Serotransferrin precursor (Oryzias latipes) 1-3 K.LCELCK.G K.SDDYQLICPGK.G 74 600.6 2.46 2 2 6.14 1 1 1 2 Transferrin (Oryzias latipes) 2-1 R.ATPNVYKR.K 87 514.4 1.04 2 1 7.61 1 1 Enhancer of zeste homolog 1 (Drosophila) (Oryzias latipes) 3-1 K.EALVNNAEEFGDR.D 51 541.4 2.88 1 1 8.53 1 2 Cytochrome P450 monooxygenase CYP2K1 (Oryzias latipes) 4-1 R.GNADLPK.L 35 223.1 2.21 1 1 8.14 1 1 Forkhead box D4 (Oryzias latipes) (a) AFM plane (b) 3D modle 图 3 浓度为 0.750 mg/mL 的血清转铁蛋白液的 AFM 图像 Fig.3 AFM images of 0.750 mg/mL serum serotransferrin (scanning range: 30 μm ×30 μm) 3.4 AFM 表征血清转铁蛋白的表面形貌 血清转铁蛋白液通过静电作用结合在经过处理的 云母表面，异相界面的存在环境与其在膜上的环境有相 似性. 空气湿度大于45%时云母表面会覆盖一层水膜[25]. 本实验样品是在空气湿度为 50%的环境中成像，血清蛋 白仍处于液相，但脱离了原来的溶液环境. 因此，采用 AFM 观察到样品比扫描电子显微镜更接近自然状态[26]. 本实验采取轻敲模式，避免了针尖粘附到样品上及在扫 描过程中对样品的损坏. 图 3(a)是浓度为 0.750 mg/mL 的血清转铁蛋白的 AFM 二维图像，可见许多分散、无序、大小高度不一 的颗粒分布在云母表面，有些颗粒呈不规则形状，说明 蛋白液浓度较大，部分蛋白发生不同形态的聚集. 图 3(b) 是三维扫描图，能更直观地看到样品表面结构及突起颗 粒，即血清转铁蛋白分子或其聚集体. 杨培慧等[27]用原 子力显微镜探索了转铁蛋白及其抗体分子间的作用，比 较了饱和铁转铁蛋白和脱铁转铁蛋白与抗体之间作用 力的差异，表明饱和铁转铁蛋白与抗体分子之间互相嵌 第 1 期 王博文等：黄鳝血清转铁蛋白的提取及表征 129 合，结合更紧密，分子间力曲线亦显示饱和铁转铁蛋白 与抗体之间的特异性结合力明显大于脱铁转铁蛋白. 3.5 黄鳝血清转铁蛋白的二级结构分析 为了研究血清转铁蛋白的圆二色性，在远紫外区对 其二级结构在0.01 mol/L Tris−HCl (pH 7.02)中进行了评 估，血清转铁蛋白的浓度为 0.75 mg/mL. 同一样品扫描 次数为 8∼16 次. 由于中间的变化不明显，只选取扫描次 数最少的 8 次和最多的 16 次的结果，见图 4. 图 4 血清转铁蛋白的圆二色光谱 Fig 4 CD spectra of serum serotransferrin 图 4(a)只有一个较强的极值，在 218 nm 处 . Greenfield 等[28]最早通过计算CD光谱了蛋白构象， 其中聚赖氨酸在 100% α-螺旋时于 218 nm 处有一个小 峰，在 100% β-螺旋时于 218 nm 处有极小值. Kelly 等[29] 研究了用 CD 表征蛋白的方法，给出了巨大芽孢杆菌的 完整细胞色素 P450 BM3 及其用大肠杆菌重组蛋白表达 的结构域混合物的 CD 谱图，峰形与图 4(a)相似. 图 4(b) 由于扫描范围扩大、扫描次数增多，图谱中有 2 个较强 的极值，极大值在 198 nm 处，极小值仍在 218 nm 处. Alexander 等 [30]研究了人血清冷不溶性球蛋白 (1.02 mg/mL)的结构和稳定性，给出了其远紫外区 CD 谱图， 在 218 nm 处有一极小值，在 230 nm 处有一极大值. 沈 星灿等[31]综述了圆二色光谱的分析方法，α-螺旋在靠近 192 nm 处有一正的谱带，在 222 和 208 nm 处有 2 个负 的特征肩峰谱带，与本实验的谱图吻合 . 用 JASCO J-715 型圆二色谱系统分析软件计算可知，α-螺旋含量 为 29.8%. 由于使用的缓冲液含的 Na+在 200 nm 处会对 CD 图谱产生干扰，所以图谱中 200 nm 以下为不可信区 域，不能作为分析α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规结构 定量的证据. 表 3 是波长范围为 200~260 和 190~260 nm 的 CD 谱测定结果，比较可知，差异主要在β-折叠的含量上， 200~260 nm 的为 0, 190~260 nm 的为 6.6%. 从图 4(a)中 也可看出β-折叠的特征不明显，而图 4(b)中β-折叠的特 征较明显. 这是由于图 4(a)扫描次数较少，β-折叠的含 量很少，不易扫描出来，随扫描次数增多，β-折叠的特 征才逐渐表现出来[31]. 蛋白质的药理性质与其二级结 构特点密切相关，通过圆二色图谱对转铁蛋白的二级结 构进行分析，为开发该蛋白的药理活性作了必要的铺垫. 表 3 血清转铁蛋白 CD 光谱测定结果 Table 3 CD spectral quantitative results of serum serotransferrin Wavelength (nm) Secondary structure fragment (%) 200~260 190~260 α-Helix 30.9 29.8 β-Fold 0.0 6.6 β-Turn 31.8 33.7 Random 37.3 29.9 RMS 50.499 27.395 4 结 论 通过对黄鳝血清蛋白的分离、纯化，得到了分子量 74 kDa、含量 0.750 mg/mL 的血清转铁蛋白. 用原子力 显微镜表征其表面形貌，可见有许多分散无序的颗粒分 布在云母表面. 用圆二色谱法对血清转铁蛋白的二级结 构进行了分析，结果表明，α-螺旋含量为 29.8%，β-折 叠量为 6.6%. 将提取出来的转铁蛋白作为治疗神经系 统疾病药物的原料，具有较高的应用潜力和综合开发前 景. 参考文献： [1] 耿浩，张长竞. 黄鳝稻田无公害养殖技术 [J]. 水产养殖, 2009, (8): 20. 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The results show that the molecular weight of serotransferrin is 74 kDa, its content 0.750 mg/mL, including α-helix 29.8% and β-fold 6.6%. Key words: Monopterus albus; transferrin; SDS−PAGE; biological mass spectrum; atomic force microscopy