石榴皮水煎液对脾虚泄泻模型小鼠血清sIgA等影响的实验研究_吴苗敏

第 30 卷 第 12 期 2 0 1 2年 1 2 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 30 No． 12 Dec． 2 0 1 2 药 效 学 研 究 盘 点 中 华 中 医 药 2748 学 刊 石榴皮水煎液对脾虚泄泻模型小鼠血清 sIgA等影响的实验研究 吴苗敏1，单丽娟2 (1．新疆医科大学第四附属中医医院，新疆 乌鲁木齐 830002;2．新疆医科大学中医学院，新疆 乌鲁木齐 830011) 摘 要:目的:观察石榴皮对脾虚泄泻小鼠的止泻作用并初步探讨脾虚泄泻与机体免疫功能之间的关系。方 法:以清洁级昆明小鼠 40 只，随机分组(正常组、模型组、治疗组、对照组) ，采用苦寒药物灌胃致小鼠脾虚泄泻模 型，治疗组以石榴皮水煎液反佐验证治疗，同时设立对照组(思密达) ，观察实验小鼠一般情况，以放射免疫法测 定小鼠血清分泌性免疫球蛋白 A(sIgA)含量等指标。结果:造模后小鼠出现活动减少、蜷卧、扎堆、摄食次数减 少、大便稀溏等变化，符合脾虚泄泻证现。治疗组小鼠症状明显改善，血清 sIgA 含量、T 淋巴细胞百分率及转 化率、腹腔吞噬细胞百分率及吞噬指数、胸腺 /脾脏指数与模型组相比较(P ＜ 0． 05) ，治疗组与对照组比较(P ＞ 0． 05)。结论:石榴皮能改善脾虚泄泻小鼠症状，并能降低造模后小鼠血清 sIgA 含量，提高 T 淋巴细胞百分率及 转化率、腹腔吞噬细胞百分率及吞噬指数等指标，提示石榴皮的止泻作用可能与调节机体免疫机制有关。 关键词:脾虚泄泻;免疫功能;石榴皮 中图分类号:R285． 5 文献标识码:A 文章编号:1673 － 7717(2012)12 － 2748 － 03 Experimental Study on How Granatum Affecting Immunologic Function of Rats of Spleen Asthenia Type WU Miao-min1，SHAN Li-juan2 (1． Subsidiary Chinese Medicine Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830002，Xinjiang，China; 2． College of Traditional Chinese Medicine of Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，Xinjiang，China) Abstract:Objective:To make an approach to the relationship between the spleen asthenia and immunologic function by observing how granatum invigorating the spleen to arrest diarrhea of the rats of spleen asthenia． Methods:40 clean grade Kunming rats were randomly divided into 4 groups:normal，treated，model，control groups． The model rats were fed with the liquid of folium scnnae to make the spleen asthenia model and treated with the granatum，then their feeding be- havior，activity，fur，fecal frequency and so on were observed;the rats＇ content of sIgA，celiac phagocytic cells percentage and phagocytic index were tested by RIA;the rats＇ thymus and spleen weight change were tested;the spleen thymus patho- logical changes were tested by HE staining technique． Results:The model rats appeared to be less active，curling up lying， gathering，feeding rate decreasing，loose stool and so on． It is almost accordant to the symptoms of spleen asthenia． The content of sIgA，celiac phagocytic cells percentage and phagocytic index in mode group were increased compared with those in the normal one(P ＜ 0． 05)． The treated group had obvious improvement in symptoms． The content of sIgA，celi- ac phagocytic cells percentage，phagocytic index and immune organs weight in treated group had significance compared with those in the model group(P ＜ 0． 05) ，there was no obvious difference between the treated group and control sample group(P ＞ 0． 05)． Conclusion:Granatum can improve the symptoms of spleen asthenia，it may be related to the gastroin- testinal mucosa protection and the immune mechanism． Key words:diarrhea due to spleen asthenia;immune function;granatum 收稿日期:2012 － 07 － 26 作者简介:吴苗敏(1973 －) ，女，副主任医师，研究方向:中医证型 现代研究，中西医结合内、妇科基础及临床研究。 通讯作者:单丽娟，女，教授、主任医师，硕士研究生导师，研究方 向:方剂学教学改革研究，中西医结合血液病基础及临 床研究。E-mail:shanlj@ 163． com． cn。 中医现代化已经成为中医药学发展的主要方向，而证 的实质的研究是中医迈向现代化的起点。脾虚证是中医临 床常见的证候之一，也是当前中医现代化研究中的一个重 要［1］。本文借助佐剂性脾虚泄泻小鼠模型，观察石榴 皮对脾虚泄泻模型小鼠免疫指标的影响，通过实验探索脾 虚泄泻证与免疫机制之间的关系，探讨中药对机体免疫机 制的影响及相互关系。 8472 第 30 卷 第 12 期 2 0 1 2年 1 2 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 30 No． 12 Dec． 2 0 1 2 中 华 中 医 药 2749 学 刊 1 实验材料与 1． 1 实验材料 1． 1． 1 实验动物 昆明种小鼠 40 只［许可证号:SCXK (新)2003 － 0001］，清洁级，雌雄各半，体重 18 ～ 22g;标准 颗粒饲料(均由新疆医科大学实验动物中心配制) ;动物在 实验前适应性驯养一周。 1． 1． 2 主要仪器 主要仪器:全自动生化仪、电子天 平、低温离心机 KWS － MAE型、721 分光光度计、多管放射 免疫 γ计数仪 DFM －96 型、医用净化工作台等。 1． 1． 3 主要试剂及药品 100%番泻叶浸剂:番泻叶购于 新疆医科大学附属中医医院，90℃热水浸泡 4 次，每次 30min，收集 4 次的浸泡液，浓缩后含原生药 1g /mL (0． 2mL /10g)。 石榴皮:购于新疆医科大学附属中医医院，将石榴皮 500g加自来水 1000mL，浸泡 30min后，放置于不锈钢锅内， 将电磁炉火温调至中火，煎至 300mL，经纱布过滤后待用。 思密达(双面体蒙脱石散剂) :购自新疆医科大学附属 中医医院，用蒸馏水配制成混悬液，经口插管灌胃。 分泌型免疫球蛋白(sIgA)放射免疫试剂盒:购自南京 建成生物有限公司(批号:20090822) ，组成:1)sIgA 标准品 6瓶:0． 15、0． 40、0． 80、1． 60、3． 20、6． 40μg /mL;2)sIgA标记 1 瓶(红色冻干品) ;3)sIgA 抗体 1 瓶(蓝色溶液) ;4)NSB (非特异)1 瓶(白色冻干品) ;5)第二抗体 1 瓶(白色冻干 品) ;6)PEG1 瓶(无色溶液) ;7)磷酸缓冲液 1 瓶。 1． 2 实验方法 1． 2． 1 模型制备 昆明种幼鼠 40 只，适应性饲养一周，编 号称重，随机分为 4 组，即正常对照组、模型组、治疗组、对 照组 4 组，每组 10 只，造模方式根据文献及参考陈小野［2］ 所著《实用中医证候动物模型学》制作，属于中医病因造模 方法中较为常用的一种造型方式，采用苦寒泻下方式制作 脾虚泄泻模型小鼠，除正常对照组每天用自来水灌胃外，其 余 3 组均用 100%番泻叶浸剂(0． 2g /mL)灌胃。每日 1 次， 连续 8 天，造成脾虚泄泻模型。给予 100%番泻叶浸剂后， 实验小鼠出现蜷卧、畏寒扎堆、困倦、食欲不佳、便溏甚至肛 门水肿，据全国中西医结合虚证老年病防治学术会议制定的 “中医虚证参考标准”及北京师范大学造脾虚模型标准，制 定本实验动物模型标准:1)泄泻、严重者甚至脱肛;2)摄食减 少;3)消瘦，体重减轻;4)神态萎靡，四肢不收，毛色枯稿;5) 蜷缩聚堆;6)易疲劳。第 1)、2)项为主症，第 3)～ 6)项为兼 项，具备两项主症及两项兼症时，即可认为脾虚造模成功。 1． 2． 2 给药方法 造模成功后，连续给药 7 天。根据《新 药研究与方法》［3］不同动物剂量(mg /kg)折算系数(K)和 简化倍数，小鼠 K = 1，简化倍数为 9，即 1． 0mg /kg，灌胃一 般不超过 0． 3mL /10g。误差允许范围为 0． 5 ～ 1 倍。 正常组:生理盐水 0． 2mL /10g，1 日 1 次定时灌胃。 模型组:生理盐水 0． 2mL /10g，1 日 1 次定时灌胃。 治疗组:石榴皮水煎液 0． 2mL /10g，1 日 1 次定时灌胃。 对照组:思密达 0． 2mL /10g，1 日 1 次定时灌胃。 1． 2． 3 标本采集及制备 实验第 15 天，4 组小鼠均从眼 球取血 3mL /只，4℃ 4500rpm 离心 10min，分离血清，4℃ 3000rpm离心，5min，取上清测定。保存，待测。处死小鼠 后摘除脾和胸腺，去掉筋膜及脂肪组织，置于电子天平待测 胸腺 /脾重。 2 观察指标 根据脾虚泄泻证的临床特点，观察小鼠体温、毛发、精 神状态、活动能力、食量、粪便等情况。 3 统计学处理 原始数据经过整理后，采用双人录入法建立数据库，应 用 SPSS 13． 0 统计软件进行数据处理，所有资料为计量资 料，用均数 ±标准差(珋x ± s)表示，统计方法采用用方差分析 或秩和检验。检验水准 α = 0． 05，P≤0． 05，则有统计学意 义。 4 实验结果 4． 1 小鼠的一般情况 正常组小鼠活跃，毛发光泽，食欲好，大小便正常，模型 组小鼠大部分于第 2 ～ 3 天出现便溏、摄食减少，第 5 天开 始出现蜷卧、嗜睡、反应迟钝、毛发失去光泽，体重减轻，第 7 ～ 8 天出现明显便溏，嗜卧、行动呆滞、毛发蓬松、食欲不 振、饮水少、甚则肛门水肿，肛门处毛发沾染粪便。给予药 物治疗后治疗组小鼠上述症状和体征逐渐消失，食欲恢复， 摄食次数增加，较治疗前活动增加、大便次数逐渐减少、毛 发恢复光泽等，大多数小鼠基本恢复正常，对照组小鼠大便 次数减少，活动次数及反应不及治疗组小鼠。 4． 2 免疫功能检测结果 4． 2 ． 1 实验小鼠血清 sIgA 测定结果 实验表明，模型 组、治疗组及对照组经苦寒药物造模后，血清 sIgA 含量 升高，与正常组相比(P = 0． 021，P ＜ 0． 05) ，有统计学意 义，说明脾虚泄泻模型已建立。给予石榴皮与思密达 后，治疗组与对照组以上指标与模型组相比有统计学意 义(P = 0． 040，P ＜ 0． 05) ，说明造模后小鼠血清 sIgA 含 量发生改变，石榴皮有止泻作用并对免疫功能有影响， 能降低血清 sIgA 含量。治疗组与对照组比较(P = 0． 058，P ＞ 0． 05) ，无统计学意义，说明石榴皮具有与思 密达相同的止泻效果，见表 1。 表 1 4 组动物 sIgA测定结果(珋x ± s) 组别 n sIgA(μg /mL) 正常组 10 20． 651 ± 8． 200 模型组 10 46． 055 ± 16． 107* 治疗组 10 23． 311 ± 7． 386＊＊ 对照组 10 32． 932 ± 3． 180＊＊＊ 注:与正常组比较，* P ＜ 0． 05;与模型组比较，＊＊P ＜ 0． 05; 与对照组比较，＊＊＊P ＞ 0． 05。 4． 2． 2 免疫功能部分指标测定 T 淋巴细胞计数 (ANAE)检测法［4］表明模型组淋巴细胞百分率低于正常组 (P = 0． 038，P ＜ 0． 05)。治疗组与模型组比较(P ＜ 0． 05) ， 有统计学意义，说明石榴皮对 T 淋巴细胞百分率有影响。 治疗与对照组比较(P ＞ 0． 05) ，无统计学意义，见表 2。 T淋巴细胞转化率(体内法)［5］脾虚模型组淋巴细胞 转化率与正常对照组比较(P ＜ 0． 05) ，说明模型组淋巴细 胞转化率降低。治疗组与模型组比较(P ＜ 0． 05) ，说明石 榴皮提高小鼠淋巴细胞转化率。治疗组与对照组两组比较 无统计学意义(P ＞ 0． 05) ，见表 2。 9472 第 30 卷 第 12 期 2 0 1 2年 1 2 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 30 No． 12 Dec． 2 0 1 2 中 华 中 医 药 2750 学 刊 表 2 4 组动物 T淋巴细胞百分率及 转化率比较(n = 10，珋x ± s) 项目 n T淋巴细胞百分率(%) T细胞转化率(%) 正常组 10 58． 56 ± 2． 26 45． 77 ± 2． 23 模型组 10 41． 68 ± 2． 93* 26． 37 ± 3． 32* 治疗组 10 60． 14 ± 3． 46＊＊ 56． 48 ± 3． 82＊＊ 对照组 10 59． 61 ± 3． 87＊＊＊ 56． 55 ± 3． 36＊＊＊ 注:与正常组比较，* P ＜ 0． 05;与模型组比较，＊＊P ＜ 0． 05; 与对照组比较，＊＊＊P ＞ 0． 05。 腹腔巨噬细胞吞噬功能［6］结果显示模型组吞噬百分 率和吞噬指数明显与正常组比较(P ＜ 0． 05)。说明造模后 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能降低，治疗组与模型组比较(P ＜ 0． 05) ，说明石榴皮对腹腔巨噬细胞吞噬功能有影响，可 提高小鼠吞噬指数，与对照组比较无统计学意义(P ＞ 0． 05) ，见表 3。 表 3 4 组动物腹腔吞噬细胞百分率细胞及 吞噬指数比较(n = 10，珋x ± s) 项目 n 腹腔巨噬细胞百分率(%) 细胞吞噬指数 正常组 10 59． 37 ± 2． 87 0． 45 ± 0． 018 模型组 10 33． 31 ± 2． 53* 0． 22 ± 0． 0194* 治疗组 10 63． 91 ± 1． 96＊＊ 0． 45 ± 0． 018＊＊ 对照组 10 65． 36 ± 1． 25＊＊＊ 0． 42 ± 0． 028＊＊＊ 注:与正常组比较，* P ＜ 0． 05;与模型组比较，＊＊P ＜ 0． 05; 与对照组比较，＊＊＊P ＞ 0． 05。 4． 2． 3 脾脏 /胸腺指数及镜下结构 脾脏 /胸腺指数:处 死动物后，立即解剖，取出胸腺、脾脏，用千分之一天平称 重，每鼠脾重、胸腺重除以体重即得脾脏指数与胸腺指数。 结果显示模型组脾脏、胸腺指数与正常组两组间比较(P ＜ 0． 05) ，说明造模后小鼠脾脏、胸腺指数降低，治疗组与模型 组比较(P ＜ 0． 05) ，有统计学意义，说明石榴皮治疗后小鼠 体重增加，脾脏、胸腺指数升高。治疗组与对照组比较无统 计学意义(P ＞ 0． 05) ，说明石榴皮具有与思密达相同止泻 效果，见表 4。 表 4 4 组动物胸腺 /脾脏指数比较(珋x ± s) 组别 n 脾脏指数(g) 胸腺指数(g) 正常组 10 0． 63 ± 0． 027 0． 55 ± 0． 033 模型组 10 0． 4 ± 0． 028* 0． 34 ± 0． 024* 治疗组 10 0． 64 ± 0． 028＊＊ 0． 56 ± 0． 039＊＊ 对照组 10 0． 63 ± 0． 02＊＊＊ 0． 55 ± 0． 012＊＊＊ 注:与正常组比较，* P ＜ 0． 05;与模型组比较，＊＊P ＜ 0． 05; 与对照组比较，＊＊＊P ＞ 0． 05。 5 讨 论 现代研究认为免疫系统改变是脾虚证的内在原因之 一，陈业强等［7］采用 3H － TDR 掺入法对利血平制模的小 鼠进行脾淋巴细胞增殖功能的测定，结果表明，脾虚证小鼠 脾脏 T淋巴细胞增殖功能较正常组明显下降。T淋巴细胞 可分泌多种活性细胞因子，这些细胞因子参与淋巴细胞及 其他细胞的生长、分化，并借此增强或抑制免疫功能。脾脏 和胸腺是机体重要的免疫器官，其产生的 T 淋巴细胞决定 着机体的细胞免疫功能［8］，脾脏脾小结的减少和缩小，生 发中心不活跃，反映了淋巴细胞的增殖受到阻碍，表现为 T 淋巴细胞的减少，测定 T淋巴细胞百分率和转化率、腹腔巨 噬细胞吞噬率和吞噬指数均减低，说明免疫功能测定与镜 下观察相一致，提示脾虚模型动物的细胞免疫功能低下，表 现出精神萎靡，倦怠嗜卧等症。杨春波等［9］研究表明，脾 虚湿热证患者胃黏膜和外周血 IgG 均显著增强，IgA、IgM 在胃黏膜显著增强，循环免疫复合物(CIC)亦明显升高。 现代医学认为，中医理论中脾的生理功能与消化、神 经、免疫、内分泌和物质代谢等系统的功能密切相关。已有 研究表明，脾虚泄泻证有明显的免疫功能异常表现，有关 “脾虚”的各种指标不下 50 种，这些指标中如唾液淀粉酶 活性试验、木糖吸收试验等［10］。中医药对脾虚泄泻证免疫 功能影响的研究日益深入，治疗泄泻的中药多为性味苦温， 多具健脾燥湿，补气温阳，涩肠止泻等功效，且具增强免疫 功能，近年来国内外很多对石榴的研究报道证实了石榴在 抗癌、降血糖、免疫调节作用、改善心血管系统，具有抗氧 化、调节血脂等作用［11］，显示出石榴皮突出的生物学活性。 本实验以中医经典理论为依据，采用苦寒药物造模法制作 脾虚泄泻小鼠模型，观察血清 sIgA 含量等指标的变化，并 用中药石榴皮对模型小鼠进行干预反证，探讨脾虚泄泻的 部分特性及石榴皮对其的作用，本实验中石榴皮能降低造 模后小鼠血清 sIgA 含量，提高 T 淋巴细胞百分率及转化 率、腹腔吞噬细胞百分率及吞噬指数，脾脏指数等指标，提 示石榴皮能改善脾虚泄泻小鼠症状并具有明显止泻效果， 并且石榴皮的止泻作用可能与调节机体免疫机制有关，通 过实验从免疫学方面对脾虚泄泻证进行了初步研究和探 讨。中医药治疗慢性腹泻积累了丰富的临床经验，但以临 床研究多，实验研究少，动物模型有其局限性，其相关机制 有待更深入的实验研究与临床实践。加强脾虚泄泻证临床 的前瞻性研究，扩展治疗脾虚证方药的深度和广度。 参考文献 ［1］ 王运平，李波清，邱世翠．脾虚小鼠免疫功能的探讨［J］．中国 中西医结合脾胃杂志，1998，6(1) :34 － 36． ［2］ 陈小野． 脾虚证动物模型的造模思路［J］． 中医杂志，1995 (4) :239． ［3］ 邓世明，林强．新药研究思路与方法［M］．北京:人民卫生出 版社，2008:83． ［4］ 上海市医学化验所．临床免疫学检验(上册) ［M］．上海科技 出版社，1983:4． ［5］ 关铁． 用 PHA 在小鼠体内诱发淋巴细胞转化的初步观察 ［J］．上海免疫学杂志，1984(1) :57． ［6］ 徐淑云． 药理学实验方法学［M］． 北京:人民卫生出版社， 1982． ［7］ 陈业强，潘宇政，陈永斌，等． 脾虚证病人免疫功能的测定 ［J］．广西医科大学学报，1998，15(3) :86 － 87． ［8］ 沈鹰，孙弼纲．生化乏源动物免疫器官改变的实验研究［J］． 安徽中医学院学报，1983，4:59 － 61． ［9］ 杨春波，傅肖岩，柯晓，等．慢性胃炎脾胃湿热证的免疫组织 化学研究［J］．中国中西医脾胃杂志，1998:6(2) :68． ［10］ 朱曙东，李彬裴，乔樵云．母粉对脾虚泄泻大鼠淀粉酶、木糖 的影响［J］．浙江中医学院学报，2002，26(6) :46 － 47． ［11］ 李云峰，郭长江，杨继军，等．石榴皮抗氧化物质提取及其体 外抗氧化作用研究［J］．营养学报，2004，26(2) :144 － 147． 0572