溺毒清合剂对慢性肾衰竭大鼠纤维化指标的影响_李玉卿

收稿日期:2012 － 09 － 23 基金项目:浙江省中医药科研资助项目(2011ZB150) 作者简介:李玉卿(1977 －) ，男，主治医师，硕士，研究方向:中西医 结合治疗肾脏病。 2． 9 样品测定 对 3 批薄荷传统饮片按照“2． 3 项”下制备供试液，取 薄荷脑对照品溶液(1． 36 g·L －1) ，分别进样 1 μL，测定峰 面积，按外标法测定薄荷脑的含量，结果见表 3。 表 3 薄荷脑含量测定结果(n = 3) 产地 批号 薄荷传统饮片 薄荷脑含量 (mg·g － 1) RSD (%) 薄荷新型饮片 薄荷脑含量 (mg·g － 1) RSD (%) 浙江杭州 101013 7． 30 1． 01 7． 03 1． 32 安徽亳州 100728 5． 23 1． 23 4． 82 0． 98 江苏江阴 100925 6． 51 1． 09 5． 94 1． 02 3 讨 论 《中华人民共和国药典》对于薄荷的含量测定是对挥 发油量进行了规定，考虑到薄荷油测定时需要样品量大，误 差大等问题，并且不能反应薄荷脑的实际含量。采用本法 测定 3 个产地的薄荷饮片及其新型饮片中的薄荷脑，不需 提取薄荷油，直接测定薄荷中的薄荷脑含量，所需样品量 少，方法灵敏，结果准确，并且内标法操作简单，可以作为控 制薄荷新型饮片及其传统饮片质量的常规检测手段。两者 的气相色谱检测结果表明，薄荷新型饮片与传统饮片薄荷 脑含量无较大差异。 参考文献 ［1］ Edris AE，Farrag ES． Antifungal activity of peppermint and sweet basil essential oils and their major aroma constituents on some plant pathogenic fungi from the vapor phase［J］． Nahr- ung，2003，47(2) :117 － 121． ［2］ Schuhmacher A，Reichling J，Schnitzler P． Virucidal effect of peppermint oil on the enveloped viruses herpes simplex virus type1 and type2 in vitro［J］． 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CRF大鼠的肾功能，通过降解Ⅳ型胶原等细胞外基质而抑制 5 / 6 肾切除大鼠残肾组织肾小球硬化，从而延缓慢性肾衰进展，与厄贝沙坦有相近的肾脏保护作用。 关键词:溺毒清合剂;慢性肾衰;大鼠 中图分类号:R285． 5 文献标志码:A 文章编号:1673 － 7717(2013)02 － 0350 － 03 Influence of Niduqing on fibrosis index of chronic renal failure rats LI Yuqing1，ZHANG Zhongxian1，FEI Desheng1，ZHANG Xuefeng1，DING Weiwei1， ZHOU Fuming1，WEI Xianjin1，CHENG Xinfa2，CHEN Hua2 (1． Pinghu Hospital of Traditional Chinese Medicine，Pinghu 314200，Zhejiang，China; 2． Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，Zhejiang，China) Abstract:Objective:To explore the mechanism of the therapeutic effect of Niduqing on experimental chronic renal failure(CRF)． Methods:Fifty male SD rats were made into CRF model by 5 /6 nephrectomy and were randomly sorted into 053 第 31 卷 第 2 期 2 0 1 3 年 2 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 31 No． 2 Feb． 2 0 1 3 中 华 中 医 药 351 学 刊 following groups:model group，Niduqing low and high dose groups，Erbesartan group and sham － operation group． By the end of the second month，the rats were killed． The change of renal function was observed and IV collagen，FN and TGF － β in nephridial tissue were detected by SABC，then the pathologic changes in renal tissue were observed by light microsco- py． Results:Niduqing can improve the renal function of CRF fats as Erbesartan does． IV collagen，FN and TGF － β expres- sions decreased in Niduqing high dose group． Conclusion:Niduqing can significantly improve the renal function of CRF fats and inhibit glomerulosclerosis in CRF fats by degrading extracellular matrix(ECM) ，thus delaying the progress of CRF， which has similar renal protection as Erbesartan． Key words:Niduqing;chronic renal failure;rat 慢性肾功能衰竭(chronic renal failure，CRF)是危害人 们身体健康的危重病之一。我们根据其临床表现，以中医 理药论为指导，衷中参西，研制成溺毒清合剂用于 CRF，经 临床观察溺毒清合剂对慢性肾衰竭患者改善症状、延缓肾 衰进展疗效理想。为了探讨溺毒清合剂治疗慢性肾衰的作 用机理，我们进行了相关的动物实验。 1 材料与方法 1． 1 材料 1． 1． 1 实验药物 溺毒清合剂(黄芪、制大黄、淫羊藿、丹 参、附片、牡蛎)组成，按临床处方比例。水煎两次，浓缩成 2 ∶ 1，溺毒清合剂低剂量组每毫升含生药 0． 75 g，溺毒清合 剂高剂量组每好生含生药 1． 5 g /mL，4 ℃冰箱保存。对照 组服用药物:厄贝沙坦:江苏恒瑞制药生产，150 mg /片，批 号:11041152，制成混悬液，每 mL含原药 10 mg。 1． 1． 2 实验动物 选用 50 只雄性的体重为(200 ± 20)g 的 SD大鼠(浙江中医药大学提供)。 1． 1． 3 实验环境 浙江中医药大学实验动物中心清洁级 大鼠饲养室。 1． 1． 4 主要试剂及仪器 日本产 7020 自动生化仪， 日本希森 K21 自动生化分析仪，752 分光光度计，SOD、 MDA、NO、ET － 1 试剂盒(南京建成生物研究所提供)。 1． 2 方法 1． 2． 1 模型制作 50 只大鼠先饲养 1 周，然后随机抽出 10 只作为假手术组组，其余 40 只在腹腔注射麻醉下，对左 侧肾脏进行大部分切除，所切除部分重量占单侧肾脏重量 的 2 /3(0． 6 ～ 0． 7)g，术后两周对右侧肾脏进行全部切除。 随机抽出的 10 只大鼠同样进行以上造模步骤，但不切除肾 脏。 1． 2． 2 实验分组 除假手术组外，造模后大鼠随机分为 4 个组即:模型组、溺毒清低剂量组(简称溺低组)、溺毒清高 剂量组(简称溺高组)、厄贝沙坦对照组(简称厄贝组)。 1． 2． 3 用药方法 分好组后实验大鼠以每笼 5 ～ 6 只饲 养，自动饮水，自由进食，饲料予以普通饲料。溺毒清合剂 低剂量组每日灌服含生药 0． 75 g /mL溺毒清合剂 1． 0 mL / 100 gBW，给药剂量为 7． 5 g /kg(为临床给药剂量的 10 倍) ;溺毒清合剂高剂量组每日灌服含生药 1． 5 g /mL 溺毒 清合剂 1． 0 mL /100 gBW，给药剂量为 15 g /kg(为临床给药 剂量的 20 倍) ;厄贝沙坦对照组每日灌服含 10 mg /mL 的 厄贝沙坦溶液 1． 0 mL /100 gBW，给药剂量为 50 mg /kg(为 临床给药剂量的 10 倍)。假手术组、模型对照组均每日灌 服无菌蒸馏水 1． 0 mL /100 gBW。 1． 2． 4 观察指标及检测方法 给药 8 周后，各组大鼠上 代谢笼，测定大鼠的采食量、饮水量和尿量，并测定尿液中 肌酐、尿素氮和总蛋白;用 3%戊巴比妥钠 50 mg /kg 腹腔 注射麻醉大鼠，心脏采血 6 mL，分离血清，自动生化仪 测定血肌酐、尿素氮、胆固醇、三酰甘油，取肾脏标本甲 醛固定，石蜡包埋，免疫组化查Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白 (FN) ，转化生长因子(TGF － β1) ;在浙江中医药大学实 验动物中心检验室进行检测，严格按照试剂盒说明操 作。肾脏标本用中性甲醛固定，石蜡包埋，常规苏木 － 伊红(HE)染色，切片 3 μm，光镜下观察。均有浙江中 医药大学协助完成。 1． 2． 5 免疫组化检测 用 SABC 法测定肾组织中Ⅳ型胶 原、纤维连接蛋白(FN) ，转化生长因子(TGF － β1)表达。 采用图像分析系统，系统定标，每张标本按顺序选 5 个视 野，计算每个视野内染色区域的面积及积分光密度，以均值 计算每个标本的面积及积分总光密度，最后以每组的均值 进行比较。 1． 2． 6 统计方法 所有数据用(珋x ± s)表示，组间比较采用 F检验(用 SPSS 13． 0 统计软件计算)。 2 结 果 2． 1 5 组大鼠的体重、采食量、饮水量、尿量 见表 1。 表 1 5 组大鼠的体重、采食量、饮水量、尿量比较 组别 n 体重(g) 采食量(g) 饮水量(mL) 尿量(mL) 模型组 10 431． 36 ± 47． 52 26． 86 ± 4． 98 72． 38 ± 26． 62 42． 20 ± 12． 54 溺低组 10 432． 75 ± 18． 27 25． 75 ± 2． 55 65． 25 ± 14． 47 35． 44 ± 9． 05 溺高组 10 428． 37 ± 45． 9 23． 13 ± 3． 40 65． 13 ± 11． 26 34． 09 ± 9． 05 厄贝组 10 411． 75 ± 30． 52 26． 38 ± 3． 02 63． 13 ± 15． 38 34． 88 ± 11． 54 假手术组 10 483． 62 ± 39． 00* 20． 25 ± 2． 50* 28． 38 ± 6． 76* 16． 19 ± 5． 65* 注:假手术组体重、采食量、饮水量、尿量与其他四组比较，* P ＜ 0． 05。从表 1看出其他四组组间 比较无统计学意义，饮水量、尿量变化可能与肾脏浓缩功能变化有关。 2． 2 5 组大鼠血肌酐、尿素氮、血胆固醇、血甘油三酯比较 见下表 2。 表 2 5组大鼠血肌酐、尿素氮、血胆固醇、血甘油三酯比较 组别 n 胆固醇 (mmol /L ) 甘油三酯 (mmol /L) 血肌酐 (μmol /L) 血尿素氮 (mmol /L) 模型组 10 2． 35 ± 0． 70 0． 77 ± 0． 23 115． 25 ± 5． 95 22． 73 ± 1． 87 溺低组 10 3． 03 ± 1． 31 0． 91 ± 0． 43 96． 13 ± 12． 69＊＊ 14． 98 ± 3． 24＊＊ 溺高组 10 2． 23 ± 0． 51 0． 74 ± 0． 22 89． 87 ± 10． 34＊＊ 12． 22 ± 2． 49＊＊★ 厄贝组 10 2． 35 ± 0． 52 0． 68 ± 0． 20 98． 12 ± 11． 60＊＊ 18． 50 ± 3． 64＊＊ 假手术组 10 1． 34 ± 0． 12* 0． 73 ± 0． 20 55． 13 ± 2． 64* 5． 18 ± 0． 52* 注:* 表示假手术组胆固醇、血肌酐、尿素氮与模型组比较 P ＜ 0． 01;＊＊表示溺低组、溺高组、厄 贝组血肌酐、尿素氮与模型组比较 P ＜ 0． 05;★溺高组尿素氮与厄贝组比较 P ＜ 0． 05。 153 第 31 卷 第 2 期 2 0 1 3 年 2 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 31 No． 2 Feb． 2 0 1 3 中 华 中 医 药 352 学 刊 2． 3 5 组大鼠肾组织 IV 胶原、FN、MMP2、TGF － β 免疫组 化结果 图 1 5 组大鼠免疫组化 FN总光密度值 从图 1 看出假手术组与模型组比较 FN 总光密度值 P ＜ 0． 01，溺高组、厄贝组 FN 总光密度值与模型组比较 P ＜ 0． 05。 图 2 5 组大鼠免疫组化 IV总光密度值 从图 2 看出假手术组与模型组比较 IV 总光密度值 P ＜ 0． 01，溺高组、厄贝组 IV 总光密度值与模型组比较 P ＜ 0． 05。 图 3 5 组大鼠免疫组化 TGF － β总光密度值 从图 3 看出假手术组与模型组比较 TGF － β总光密度 值 P ＜ 0． 01，溺高组、厄贝组 TGF － β总光密度值与模型组 比较 P ＜ 0． 05。 2． 4 肾切片显微镜下形态 肾切片在显微镜下观察，正常组大鼠肾小球形态基本 正常，模型组大鼠肾小球缩小，个别增大，血管球明显缩小， 肾球囊明显扩大或中等扩大，部分血管球结构比较紧密，肾 小管扩张，部分里面充满蛋白或管型，肾间质有大量的炎性 细胞浸润，血管球纤维化严重;肾衰宁组大鼠肾小球缩小较 模型组轻，肾小球囊扩大，肾小管扩张，间质有少量的炎性 细胞浸润，血管球纤维化较轻;益肾组大鼠肾小球缩小较肾 衰宁组轻，血管球纤维化明显较肾衰宁组轻，肾球囊扩大不 明显，少数肾小球形态正常，肾小管简质无或少量炎性细胞 浸润。 3 讨 论 根据 CRF的临床表现，属于中医学中的“溺毒”、“关 格”、“水肿”、“癃闭”等范畴，是因脾肾衰败，二便失司，湿 浊毒邪不得由尿液排泄，滞留于体内而产生的一种病症，与 现代医学的慢性肾衰竭相当。认为本病病机中脾肾虚衰是 肾脏衰竭的根本，瘀浊内阻是肾衰恶化的基础［1］。因此我 们设计以黄芪、大黄、淫羊藿、丹参、附片、牡蛎组方溺毒清 合剂，具有益气温阳、化瘀泄毒的功效。经临床观察溺毒清 合剂对慢性肾衰竭患者有抗纤维化的作用［2］，并能改善肾 功能，延缓慢性肾衰竭进展［3］。为了进一步探讨溺毒清合 剂治疗慢性肾衰的作用机理，我们进行了动物实验。 肾间质纤维化是多种慢性进行性肾脏疾病进展至终末 期引起肾功能衰竭的共同病理改变，细胞外基质过度沉积 是引起肾问质纤维化的主要原因。在人类的各种肾小球疾 病中，细胞外基质(ECM)的沉积也是以Ⅳ胶原、FN 的沉积 为主［4 － 5］，TGF － β 与肾纤维化密切相关已得到人们的共 识，它除可直接促进 ECM 沉积外，并可与各种肾脏固有细 胞、炎症细胞、其他细胞因子、血管活性物质相互作用，相互 影响，形成复杂的细胞因子网络，通过细胞内信号转导产生 复杂生物学效应，导致肾纤维化的发生［6］。免疫组化显示 溺毒清高剂量组比模型组 IV胶原、FN、TGF － β表达减少， 从而抗肾纤维化。 溺毒清合剂可显著改善 CRF 大鼠的肾功能，可能与 其改善肾血流，降低血浆 ET － 1 升高 NO 水平，从而抑制 肾小球系膜细胞及间质细胞增值，通过降解Ⅳ型胶原等细 胞外基质而抑制 5 /6 肾切除大鼠残肾组织肾小球硬化，从 而延缓慢性肾衰进展，与厄贝沙坦有相近的肾脏保护作 用。 参考文献 ［1］ 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