2010年第5期
沙丁胺醇免疫原的合成与鉴定
吴玉苹1’2王 宾¨,王自良2,张海棠2
(1.中国农业大学生物学院,北京100094;2.河南科技学院动物科学学院,河南新乡453003)
摘要:将沙丁胺醇(SAL)经过琥珀酸单酯化后,采用混合酸酐法与载体蛋白偶联,用紫外扫描
(UV)和变性凝胶电泳(SDS—PAGE)方法检验偶联效果,推算分子结合比;制备全抗原后免疫
BALB/c小鼠,间接EI。ISA测定多抗血清效价,阻断EI。ISA鉴定其敏感性。UV和SDS—PAGE
分析结果
明,成功制备了BSA—HS—SAL,SAL—HS与BSA的分子结合比为11:1;ELISA结
果表明,获得了高效价、敏感的SAL多克隆抗体,为SAL残留免疫学检测方法的建立奠定了基础。
关键词:沙丁胺醇;人工抗原;合成;混合酸酐法;鉴定
中图分类号:$859.84文献标识码:A 文章编号:1004—3268(2010)05一0114—04
IdentificationoftheArtificiallySynthesizedSalbutamolAntigen
WUYu—pin91”,WANGBinh.WANGZi—lian92,ZHANGHai—tan92
(1。CollegeofBiologicalScience,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100094,China;
2.TheAnimalScienceCollege,HenanInstituteofScienceandTechnology,Xinxiang453003,China)
Abstract:Inthisstudy,themixedanhydridereactionwasemployedtoconjugatesalbutamolsul—
fate(SAL)withlargecarrierprotein.ThemonosuccinylderivativeofSAL(SAL—HS)waspre-
paredbymixingtheSALhaptenwithsuccinicanhydrideinagivencondition,linkedtobovinese—
rumalbumin(BSA)andaBSA—HS—SALconjugationobtained.TheimmunogenofBSA—HS—
SAI。wasidentifiedbyUVspectrogramandSDS—PAGE.BALB/cmicewereimmunizedwith
BSA—HS—SALandthetitreofpolyclonalantibody(pAb)wasdeterminedbyindirectELISA.
ThesensitivityofpAbwasidentifiedbyblockingELISA.TheresultsofUVspectrogramand
SDS—PAGEshowedthatthecharacteristicpeakofBSA—HS—SALhasbeenchangedcompared
toBSAandSAL.TheCOniugationratioofSALtoBSAwasabout11:1.pAbsanti—SALof
hightiterandsensitivityhavebeenproducedbyimmunizingBALB/cmice,whichmadeitpossi—
bletoestablishimmunoassayfordetectingSALresiduesinfeedandanimalfood.
Keywords:Salbutamol;Aritificialantigen;Synthesis;Mixedanhydridereaction;Identification
沙丁胺醇(Salbutamol,SAL),又名羟甲异丁肾
上腺素,羟甲叔丁肾上腺素,化学名1一(4一羟基一3一
羟甲基苯基)一2一(叔丁氨基)乙醇,是一种人工合成
的B2一肾上腺素受体激动剂(B2一激动剂)【l】,其中
有活性作用的是R一型沙丁胺醇,临床常用其硫酸
盐形式治疗支气管哮喘[2]。此外,SAL还具有一定
的营养重分配作用[3巧J,常被用作饲料添加剂非法用
于肉用畜禽生产。为防止SAI。超标的畜产品进入
市场,必须建立一种简便、快速、灵敏、准确的检测方
法,对SAI。残留进行有效的监测。目前,SAL的残
留检测主要依靠理化检验方法,如气相色谱(GC)、
高效液相色谱(HPLC)、气一质联用(GC—MS)、液一
质联用(HPLC—MS)等f6],尽管这些方法有很高的
灵敏度和准确性,但存在需要昂贵的仪器、样品前处
理复杂、繁琐费时、不能现场操作等缺陷,限制了其
应用[7]。免疫学分析方法由于具有灵敏、快速、特
收稿日期:2009一10—16
基金项目:国家“十一五”科技支撑计划重大项目(2006BAK02A21/I)
作者简介:吴玉苹(1978一),女,河南延津人,讲师,硕士.主要从事动物微生物与免疫学研究。
*通讯作者:王宾(1957一),男,北京人,教授,博士,博士生导师,主要从事动物疫苗的研究和开发工作。
·114·
万方数据
河南农业科学
异、简便等优点,近年来国内外在兽药、农药残留检
测领域广泛应用‘8‘。本研究采用混合酸酐法制备
BSA—HS—SAL人工抗原,旨在为SAL残留免疫
学检测方法的建立奠定基础。
l材料和方法
1.1材料
1.1.1 试剂 SAL为江苏金坛产品,纯度≥
99.5%;牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白
(0VA)、1,4丁二醇缩水甘油醚为Pierce产品;弗
氏完全佐剂(FCA)和弗氏不完全佐剂(FIA)为Gib—
co产品;其他试剂市售所得,均为AR级。
1.1.2主要仪器 U一3000紫外扫描仪(UV),日
本岛津公司产品;FTS—E1585一Q冷冻干燥机,美
国STONERIDGG公司生产;Bio—Rad一550型酶
标仪,美国Bio—Rad公司生产;AE260电子天平生
产,德国METTLER公司生产;H19321酸度计,美
国HANNA公司生产。
1.1.3试验动物SPF级6周龄雌性BALB/c小
鼠,购自郑州大学医学院实验动物中心,由河南科技
学院残留物免疫检测研究室动物房饲养。
1.2人工抗原的合成
1.2.1沙丁胺醇半琥珀酸单酯(HS—SAL)的合成
参照文献[9]的方法,称硫酸沙丁胺醇718mg溶
于50mL无水甲醇中,通过真空旋转蒸发器将溶剂
除去,制得黄色油状残留物即沙丁胺醇碱,用
100mL无水甲醇溶解,搅拌情况下加入300mg琥
珀酸酐,室温下搅拌3h,真空旋转蒸发仪蒸干溶
剂,得到黄色结晶油状的沙丁胺醇半琥珀酸单酯。
1.2.21,4一丁二醇缩水甘油醚法连接载体蛋白
称取40mgBSA溶于2mLPBS中,4℃过夜,将
HS—SAL溶于1,4一二氧六环、PBS和三丁胺的混
合物中,再加入氯甲酸异丁酯,室温搅拌30min;
40mgBSA(2mLPBS溶解过夜)逐滴加入到上述
混合物中,停止搅拌,收集反应液,在4℃下对
1000mLPBS(pH7.2)透析,每天换液1次,透析
7d,透析后的反应物反应液进一步用葡聚糖凝胶
SephadexG一25柱纯化,4℃搅拌过夜;反应物在
4℃下PBS液透析5d,每天换透析液2次。透析后
得到纯化的BSA—HS—SAL。同法制得包被抗原
0VA—HS—SAL。冻干~20℃保存备用。
1.3人工抗原的鉴定
1.3.1紫外扫描鉴定 用PBS配制SAI。与BSA
溶液,然后称取BSA—HS—SAI。溶于PBS中,
用紫外吸收法测定其蛋白质的浓度和特征峰,调节
BSA—HS—SAL溶液的蛋白质浓度与BSA标准溶
液一致,在波长220~400nm范围内进行紫外扫
描,根据峰的变化判断偶联效果,并计算BSA与
HS—SAL的分子结合比[10。。
1.3.2SDS—PAGE鉴定参照郭尧君[111介绍的
方法配制各种电泳溶液,选择浓缩胶质量浓度为
5%,分离胶为12%,浓缩胶电压为120V,分离胶电
压为60V,考马斯亮蓝染色,根据条带分子量的大
小变化判断偶联效果[1引。
1.3.3多抗血清(pAb)鉴定
1.3.3.1SALpAb制备用BSA—HS—SAL免
疫6周龄雌性BALB/c小鼠5只,免疫剂量为
50,g/只,背部皮下4~6点注射。首免3周后加强
免疫,用无菌PBS溶解BSA—HS—SAL,与等量
FlA混合乳化,共免4次,每次间隔3周,免疫剂量
同首次免疫。每隔2周加强免疫1次,3次免疫后
16d断尾采血分离血清,--20℃保存备用。
1.3.3.2效价测定 采用间接ELISA测定SAL
效价,基本程序参照Tijssen[121的方法。以待测孔
OD。。。值≥NCOD4。。值的2.1倍(P/N≥2.1),判为
阳性。
1.3.3.3敏感性鉴定采用阻断ELISA鉴定其敏
感性。阻断EI,ISA测定抗血清对SAL的50%抑
制浓度(IC5。),并以IC。。作为敏感度。
2结果与分析
2.1 UV鉴定结果
BSA的最大吸收峰在278nm,SAL的最大吸
收峰在276nm,BSA与HS—SAI。偶联后,在233~
304am处紫外吸收峰发生上移(图1),表明偶联成
功;依据朗伯一比尔定律,推算出HS—SAL与BSA
的分子结合比为11:1。
14.80
14.00
1:1.(J0
12.00
11.00
10.()()
9.00
8.00
7.0()
6.OO
5.00
4.00
3.OO
2.00
1.OO
().00
波长/rim
图1 liSA、SAlt,和lISA—Ills—SAL的紫外扫描光谱
2.2 SDS—PAGE鉴定结果
图2表明,BSA的泳动速度大于BSA—HS一
· 115·
万方数据
2010年第5期
SAL,说明BSA—HS—SAL的分子量大于BSA,证
明SAL与BSA已成功偶联。
1.蛋白质Marker;2.BSA标准物;3.偶联物BSA—HS—SAL
图2 SAL偶联物的SDS—PAGE鉴定
2.3 pAb鉴定结果
2.3.1 间接ELISA效价测定结果经过4次免疫
后,分别用OVA—HS—SAL包板测定免疫小鼠的
血清效价,结果见表1。由表1可知,5只小鼠血清
抗体效价均在1:6400以上,说明获得了较好的免
疫效果,其中2号小鼠效价最高,达到1:25600。
2.3.2pAb敏感性鉴定结果用OVA—HS—
SAL包板,做阻断ELISA,5只小鼠均产生了一定
的抑制。2号小鼠抗血清对SAL的抑制效价见表
2。SAL在0~250ftg/L范围内,将其A伽值转化为
B/B0,再对Lg[-SAL-]进行回归分析,此小鼠的线性
回归方程、R2、IC5。分别为:y一--34.609x+102.56,R2
为0.9689,IGo为33.01弘∥L。
表1 BSA—HS—SAL免疫组小鼠抗SAL血清效价
小鼠编号
抗血清稀释倍数
400
阴性对照 空白对照
2.753 2.175 1.416 1.084 0.620 0.382 0.217 0.076 0.069
3讨论
大多数兽药是小分子物质(分子量小于1ooo),
本身不具有诱导产生抗体的能力。因此,将小分子
物质与载体蛋白质偶联制备人工抗原成为建立兽药
酶免疫分析方法的关键。常作为兽药人工抗原的载
体蛋白质有BSA、OVA、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人
血清蛋白(HAS)、结核杆菌毒素蛋白(TT)等。同
一半抗原选用不同的载体制备人工抗原得到的抗体
质量也有所不同[1引。BSA物理化学性质稳定、不易
变性、价廉易得,且赖氨酸含量高,自由氨基多,在不
同的pH和离子强度下均有较大的溶解度,在含有
有机溶剂(如吡啶、N,N一二甲基甲酰胺)情况下均
可和半抗原进行偶联,且在偶联后仍保持可溶状态,
是经常使用的载体蛋白质。本试验选用BSA作为
抗原获得了较好的抗体。
在有机小分子半抗原的免疫分析中,合成具有
免疫原性的人工抗原是建立免疫分析方法的关键。
一般在合成人工抗原后先用物理化学方法初步鉴
· 】】6 ·
定。鉴定小分子人工抗原常用的方法有UV、lR、
SDS—PAGE、核磁共振碳谱(C13一NMR)、标记抗原
示踪法等。UV和SDS—PAGE是目前鉴定人工抗
原较为适用的方法,但最终还要靠免疫结果来验证。
本研究用UV法和SDS—PAGE鉴定偶联效果,结
果表明,这2种方法均取得了较好的结果。
本研究成功合成了SAL人工抗原,免疫
BALB/c小鼠制备出高效价的pAb,为抗SAL单克
隆抗体(mAb)的进一步研制和免疫学分析方法的
建立奠定了基础。
参考文献:
[1]AlejandraH,CarlosF,MarcelaP,eta1.Validationofa
chiralHPLCassayfor(R)-salbummolsulfate[J].Pharrna—
ceuticalandBiomedicalAnalysis,2004,34:45—51.
[2]KimYS,SaimRD,FedazzoJ,eta1.Effectofrmtemalad—
ministrationofsalbutamoltOsowsonpostnatalgrowthand
carcasscharacteristicsintheprogencyAustrilian[-J].Ag一一
cultureResearch。1994,45(7):271-272.
(下转第119页)
9
l
0
9叮够∞∞
O
O
0
O
8
7
9
8∞∞凹卯
0
O
O
O
1
2
1
5毖玛加强
O
O
0
O
6
2
1
8∞舛孔弱
O
l
O
O
4
5
4
5"鲳鸱鸺
O
1
O
0
5
4
l
3卯%趴趴
1
1
O
l
6
9
2
1卯钉"驼
1
2
1
2
2
3
5
6孙¨舵钉
2
2
1
2
6
7
8
7钉坞弱韶
2
3
2
2
万方数据
河南农业科学
菌株生长的影响,结果见表2。由表2可见,除
40mg/L黄芪多糖对大肠杆菌标准菌株
ATCC25922和临床分离的大肠杆菌LYG没有抑
菌作用外,其余均显示了不同程度的抑菌作用。其
中,对大肠杆菌标准菌株ATCC25922以20mg/L
抑菌效果最好,对临床分离大肠杆菌LYG和沙门
氏菌XM以10mg/L抑菌效果最好,对葡萄球菌标
准菌株ATCC25923以40mg/L抑菌效果最好。
表2黄芪多糖对供试菌株生长的影响 oD6:。值
注:同行数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05),相同字母表示差异不显著(P<0.05)
3讨论
在提取黄芪多糖的相关研究中,认为碱法提取
比水提法收率高[3],其中氧化钙提取法比碳酸钠
好[4],但未见关于氧化钙提取黄芪多糖最佳pH的
报道。本试验通过比较pH值为8、9、10、11条件下
碱法提取黄芪多糖的收率,寻找最佳pH值。根据
陈芳艳等[53和王淑萍等[6]提取黄芪多糖时对温度、
液固比、提取时间、提取次数的研究结果,本试验其
他提取参数分别为:提取温度100℃,液固比6;1,
提取时间1h,提取3次。结果表明,在其他条件均
相同的情况下,pH值为9的氧化钙溶液提取所得
黄芪多糖收率为3.43%,收率最高。
有研究报道[7],黄芪多糖在体外可显著抑制乳
酸菌和芽孢杆菌的生长。本试验选用4种菌株研究
黄芪多糖的体外抑菌作用,结果表明,黄芪多糖对4
种菌株的生长均有不同程度的抑制作用,再次证明
了黄芪多糖具有抑制细菌生长的作用。
参考文献:
钟凯,杨国宇,王艳玲,等.黄芪多糖对内毒素诱发大
鼠实验性乳腺炎的影响I-J].河南农业科学。2008(2):
107-110.
李宏全,段县平,马海利,等.黄芪多糖提高鸡抗氧化作
用对免疫功能的影响I-J].山西农业大学学报,2002,22
(1):78—81.
刘瑞生,张述斌,王必慧,等.黄芪多糖的提取和含量测
定研究l-J].国外畜牧学——猪与禽,2009,29(I):72-
73.
李红民,黄仁泉,王亚洲.提高黄芪多糖提取收率的工
艺研究[J].西北大学学报:自然科学版,2000,30(6):
509-510.
陈芳艳,梁永彬,王林川,等.黄芪多糖提取方法的研究
l-J].广东畜牧兽医科技,2004,29(5):37-38.
王淑萍,李晓静,张桂珍.黄芪多糖提取分离纯化工艺
的优化研究YJ].分子科学学报,2008,24(1):68—72.
李树鹏,郝艳霜,陈福星,等.黄芪多糖和2株益生菌体
外抑菌作用研究[J]。河南农业科学,2007(4):86—88.
(上接第116页)
[-31WarrissPD,KestinSC,RolphTP,etal.Theeffectof
thebeta—adrenergicagonistsalbutamolonmeatquality
inpigsl-J].JAnimSci,1990,68:128—136.
[4]WilliamJC,MaryEL.Comparisonoftheeffectofsal—
butamolandclenbuteroionskeletalmusclemassand
carcasscompositioninsenescentrats[J].Metabolism,
1994,43(9):1119—1125.
’
[5]HanrahnJ P.Beta-agonistsandtheireffectsonanimal
growthandcarcassquality[-M].ElsevierAppliedSci-
ence,London,1987.
[6]PereiraAV,CassQB.High-performanceliquidchro—
matographymethodforthesimultaneousdetermination
ofsulfamethoxazoleandtrimethopriminbovinemilk
usinganon—lineclean—upcolumnl,J].JournalofChro-
matographyB,2005,826(卜2):139—146.
[7]刘庆堂,职爱民。张改平,等.磺胺二甲基嘧啶人工抗原
的合成及鉴定[J].河南农业科学,2008(2):91—94.
[8]王种,魏松红,李兴海,等.甲拌磷人工抗原的合成及多
克隆抗体制备[J].河南农业科学,2009(3):56—59.
[9]GuyD,AnneBD.Determinationofpagonistsinurine
byenzymeimmunoassaybasedontheuseofananti—
salbutamolantiserum[J].AnalyticaChimicaActa,
1993,275(6):241-247.
[10]杨利国,胡少昶,魏平华,等.酶免疫测定技术I-M].南
京:南京大学出版社,1998:252—258.
[11]郭尧君.蛋白质电泳实验技术[M].北京:科学出版
社,2001.
[12]TijssenP.Practiceandtheoryofenzymeimmunoas-
say[M].Amsterdam:Elsever,1985.
[13]陈继明,陆承平,龚晓明,等.六种不同蛋白质载体制
备克伦特罗抗血清的比较[J].南京农业大学学报,
1998,21(4):83—86.
]
]
]
]
]
]
]
I=l
心
口
H
墨
口
口
万方数据
沙丁胺醇免疫原的合成与鉴定
作者: 吴玉苹, 王宾, 王自良, 张海棠, WU Yu-ping, WANG Bin, WANG Zi-liang, ZHANG
Hai-tang
作者单位: 吴玉苹,WU Yu-ping(中国农业大学,生物学院,北京,100094;河南科技学院,动物科学学院,河
南,新乡,453003), 王宾,WANG Bin(中国农业大学,生物学院,北京,100094), 王自良,张海
棠,WANG Zi-liang,ZHANG Hai-tang(河南科技学院,动物科学学院,河南,新乡,453003)
刊名: 河南农业科学
英文刊名: JOURNAL OF HENAN AGRICULTURAL SCIENCES
年,卷(期): 2010(5)
参考文献(13条)
1.Guy D;Anne B D Determination of β-agonists in urine by enzyme immunoassay based on the use of an
anti-salbutamol antiserum 1993(06)
2.王翀;魏松红;李兴海 甲拌磷人工抗原的合成及多克隆抗体制备[期刊论文]-河南农业科学 2009(03)
3.刘庆堂;职爱民;张改平 磺胺二甲基嘧啶人工抗原的合成及鉴定[期刊论文]-河南农业科学 2008(02)
4.Pereira A V;Cass Q B High-performance liquid chromatography method for the simultaneous
determination of sulfamethoxazole and trimethoprim in bovine milkusing an on-line clean-up column
2005(1-2)
5.Hanrahn J P Beta-agonists and their effects on animal growth and carcass quality 1987
6.William J C;Mary E L Comparison of the effect of salbutamol and clenbuterol on skeletal muscle
mass and carcass composition in senescent rats 1994(09)
7.Warriss P D;Kestin S C;Rolph T P The effect of the beta-adrenergic agonist salbutamol on meat
quality in pigs 1990
8.Kim Y S;Sainz R D;Ferlazzo J Effect of maternal administration of salbutamol to sows on postnatal
growth and carcass characteristics in the progency Austrilian[外文期刊] 1994(07)
9.陈继明;陆承平;龚晓明 六种不同蛋白质载体制备克伦特罗抗血清的比较 1998(04)
10.Tijssen P Practice and theory of enzyme immunoassay 1985
11.郭尧君 蛋白质电泳实验技术 2001
12.杨利国;胡少昶;魏平华 酶免疫测定技术 1998
13.Alejandra H;Carlos F;Marcela P Validation of a chiral HPLC assay for(R)-salbutamol sulfate[外文期
刊] 2004(1)
本文读者也读过(10条)
1. 袁利鹏.孙远明.雷红涛.沈玉栋.黄晓钰.潘科.黄杰.YUAN Li-peng.SUN Yuan-ming.LEI Hong-tao.SHEN Yu-dong
.HUANG Xiao-yu.PAN Ke.HUANG Jie 沙丁胺醇人工抗原合成及鉴定研究[期刊论文]-食品科学2006,27(12)
2. 熊少伶 沙丁胺醇单克隆抗体制备及ELISA检测试剂盒研制[学位论文]2009
3. 邓爱科 亲和层析-酶联免疫吸附法检测β<,2>-兴奋剂的研究[学位论文]2006
4. 胥传来.王武康.贺铁明 食品中残留盐酸克伦特罗免疫原的合成与鉴定[期刊论文]-食品科学2004,25(12)
5. 刘宣兵.张改平.邓瑞广.侯玉泽.王自良.刘庆堂.游雷鸣.柴书军.LIU Xuan-bing.ZHANG Gai-ping.DENG Rui-
guang.HOU Yu-ze.WANG Zi-liang.UU Qing-tang.YOU Lei-ming.CHAI Shu-jun 沙丁胺醇人工抗原的合成与鉴定[期
刊论文]-畜牧与兽医2008,40(10)
6. 贺铁明.胥传来.王武康 盐酸克伦特罗免疫原的合成与鉴定[期刊论文]-中国粮油学报2004,19(2)
7. 邱阳生 抗沙丁胺醇单克隆抗体制备、鉴定与初步应用研究[学位论文]2002
8. 李颖 沙丁胺醇单克隆抗体的制备与ELISA检测方法的初步建立[学位论文]2006
9. 王艺熹 沙丁胺醇兔单克隆抗体的制备及ELISA快速检测试剂盒的研制[学位论文]2008
10. 胡颖 沙丁胺醇单克隆抗体的制备及其间接ELISA检测方法的建立[学位论文]2010
本文链接:http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_hnnykx201005032.aspx