兽用吲哚美辛注射液的临床前的研究（可编辑）

兽用吲哚美辛注射液的临床前的研究（可编辑） 兽用吲哚美辛注射液的临床前的研究 独创性声明 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果,文中己加 了特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同 仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。 加,年,月 签字日期: 争日 学位论文作者:信砺勃 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定,有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院筹可以将学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后适用本授权书.本论文:口不保密, 。 口保密期限至 年 月止 导师签名: 学位论文作者签名:荡曙先 歹碰一 签字日期: 加 年多茂印 签字日期: 加年夕月日目 录 目 录 摘 要.?. 第章文献综述?一 .药理作用及应用.制剂研究进展 .不良反应.兽医临床应用 第章 引 言第章兽用吲哚美辛注射液的处方工艺研究.材料? ..仪器??. ..试药? .与结果. ..处方筛选?.. ..制备工艺?.. .讨论??. 第章兽用吲哚美辛注射液的质量研究?。 .材料一 ..仪器?。??一 ..试药.. ..实验动物? .方法与结果.. ..性状?.. ..鉴别?.. ..检查?.. ..含量测定..有关物质检查 .讨论??. 第章兽用吲哚美辛注射液的稳定性研究??.. .材料??. ..仪器?。 ..试药.. .方法与结果. ..光照试验?一 ..初均速法?。 ..加速试验..长期试验?.. .讨论??.西南大学硕士学位论文 第章兽剧吲哚美辛注射液的部分安全性试验? .材料??. ..仪器?.. ..试药?.. ..实验动物.方法与结果? ..急性毒性试验??.. ..蓄积性试验? .耐受性试验一 ..刺激性试验? ..溶血性试验? ..对小鼠一般行为表现的影响 ..对小鼠自主活动的影响..对小鼠协调机能的影响.讨论??.; 第章兽用吲哚美辛注射液的部分药效试验.材料??. ..仪器?一 ..试药?~ ..实验动物.方法与结果. ..解热试验?一 ..镇痛试验?.. ..抗炎试验.讨论??. 参考文献致 谢??. 在学期间发表的论文和申请的专利.摘要 兽用吲哚美辛注射液的临床前研究 基础兽医学 雷曙光 寸旨导老师 寸日寸?’ 罗永煌 摘 要 吲哚美辛自年由德国默克公司上市以来,已广泛用于人医临床,主要治 疗人的非特异性发热、肾小球肾炎、先天性醛固酮增多症、痛经、腹绞痛、 风湿 性及类风湿性关节炎等疾病,其制剂有肠溶片、胶囊、栓剂、乳膏、贴剂等,未 见注射液上市。本文研制的吲哚美辛注射液属国家三类新兽药,有望应用于猪、 羊、牛等动物的普通感冒、流行性感冒、其他原因引起的发热性疾患、风湿症等。 作者按农业部《兽药注册办法》中华人民共和国农业部第号令要求,对该 注射液处方工艺、质量标准、稳定性、部分安全性和有效性等进行了临床前的部 分研究,旨在为该注射液下一步的临床试验和新兽药注册积累资料。其主要内容 如下: .吲哚美辛注射液处方工艺研究。通过单因素试验和正交试验对二甲基甲酰 胺、二甲基乙酰胺、丙二醇、聚乙二醇.等有机溶剂及其用量进行了筛选。结 果以%甲基甲酰胺、%丙二醇和%水为混合溶媒,无水亚硫酸钠为抗氧 化剂,乙二胺四乙酸二钠为金属螯合剂,乙醇胺和乳酸为调节剂,制备出浓度 为 ?以且初步有效期可达年以上的吲哚美辛注射液。 .吲哚美辛注射液质量标准研究。对制备的吲哚美辛注射液进行了鉴别、检查、 含量测定等研究。结果,鉴别反应灵敏;装量差异、热原、澄明度、值等检查 指标均符合注射液相关要求。吲哚美辛注射液含量测定采取玎方法,其色谱 条件:色谱柱为 .. ,,流动相为. 冰醋酸溶液一甲醇,流速为. ?,检测波长为 ,柱温为 室温。结果,吲哚美辛注射液在 ?浓度范围内与峰面积呈良好线性 关系,.;平均回收率为.%,相对标准偏差为.%; 最低定量限为 ,最低检测限为. ;在该条件下测得吲哚美辛注射液的含量 为 .. ?一。 .吲哚美辛注射液稳定性研究。光照试验照度?测定吲哚美辛 注射液对光的敏感性,初均速法预测吲哚美辛注射液的有效期;加速试验条 件为: 温度?士?、相对湿度%士%;长期试验条件为:温度?士?、相对湿度两南大 学硕十学位论文 %士%。结果,经天光照试验,吲哚美辛注射液的性状、澄明度、含量、 值等指标未见明显变化;初均速法预测吲哚美辛注射液的有效期为.年;加 速试验个月,吲哚美辛注射液的含量、值、性状、澄明度等变化甚微;长期 试验个月,吲哚美辛注射液的含量略有下降,但与对照个月比较差异不显著 .。 .吲哚美辛注射液部分安全性试验。采用改良寇氏法测定吲哚美辛注射的 ,以剂量递增法测定其对小鼠的蓄积性和耐受性,常规法测定其对家兔的溶 血性和肌肉刺激性。结果,吲哚美辛注射液. ?一,该注射液对小鼠无 蓄积性和耐受性,对家兔无明显的溶血性和肌肉刺激性。 .吲哚美辛注射液部分药效试验。用蛋白胨致热新西兰兔作解热试验,热刺痛 和醋酸刺痛法作镇痛试验,大鼠足趾肿胀法作抗炎试验。结果,吲哚美辛注射 液 对蛋白胨致热的新西兰兔具有明显的解热效果,其解热作用与等体积的安乃 近注 射液相当;对小鼠的热刺痛和醋酸刺痛具有明显的镇痛作用;对鸡蛋清致炎 大鼠 的肿胀具有明显的抗炎作用。 关键词:吲哚美辛注射液;处方工艺;质量标准;稳定性;安全性 ????????????????????,?????,?,???,?皂 ., ? ? . ,, . , . , ,,, .. ” ” , ., ? ,,: . : ., ,, . . :%,% % , . / . : ..: ,, , , 两南大学硕士学何论文 .乃:西 。砀 .‘ .皿?.‘. : .:‘ ’ .。 玎 .%, .% .. ...?~. :.? . ??, :, : %%:。 % %. . ; , ,., , .. :. .功, . .?; . , . : ,?., : . , . . : ; ; ; ; 第章文献综述 第章文献综述 一吲哚美辛研究概况及其在动物上的应用 吲哚美辛又名消炎痛,自年由默克公司研发上市以来广泛用于人医临 床,常用于治疗人的非特异性发热、肾小球肾炎、先天性醛固酮增多症 综合症、痛经、腹绞痛、风湿性及类风湿性关节炎等】。该药通过抑制机体内前 列腺素的合成而产生解热镇痛及抗炎作用。《中国药典》年版收载有吲哚 美辛的肠溶片、贴剂、栓剂、乳膏和胶囊剂【】。但《中国兽药典》一直未收载吲 哚美辛及其制剂,且该药在动物临床上的研究及应用报道甚少。本课题组近年来 一直从事吲哚美辛在动物上的应用研究,所研制的兽用吲哚美辛注射液,已经申 请专利并公开【。本文概述了吲哚美辛的药理作用、临床应用、 制剂研究和不良反应等,旨在展望吲哚美辛在兽医临床上的应用前景。 .药理作用及应用 ..解热、镇痛、抗炎作用 吲哚美辛通过抑制环氧合酶的合成,减少前列腺素的生成,使体温调节中枢 的调定点下调,恢复机体正常产热和散热的平衡,可用于治疗非特异性发热【。 魏亚平等【用吲哚美辛治疗剖宫产术后发热例,结果平均体温恢复正常时间为 ...,而且子宫复旧及恶露变化与对照组比较无显著性差异 .,表明吲哚美辛可有效治疗剖宫产术后发热。 吲哚美辛能够降低外周和中枢的前列腺素生成,从而减弱有害刺激引起的外 周和中枢敏感化,使有害刺激引起的炎症疼痛反应减轻,可用于治疗关节痛、肌 肉痛、偏头痛、痛经、肾绞痛等【。贾天成等【】用吲哚美辛胶囊剂、噻庚啶、心 得安治疗偏头痛,将典型病例分为组,分别服上述种药物,观察一年,另选 一组进行联合给药,结果联合用药组有效率为.%,显著高于任何单一用药组 .。黎露等【】用吲哚美辛联合颅通定、阿托品治疗肾绞痛,结果有吲哚美 辛的治疗组的疗效显著优于未加吲哚美辛的对照组.。 吲哚美辛也是血小板环氧合酶的抑制剂,抑制前列腺素的合成,减少纤维素 渗出和炎性介质的渗出,减少多形核白细胞对炎症部位的浸润,有效阻遏炎症部 位释放的溶酶对组织的损伤。人医临床上,常将吲哚美辛和其他药物联用治疗风 湿性疾病、慢性炎性关节炎、扁桃体炎和软组织损伤等【。 ..抗癌作用西南大学硕士学论文 恶性肿瘤是机体在各种致癌因素作用下,局部组织的细胞在基因水平上失去 对其生长的正常调控,导致细胞克隆性异常增生而形成的新生物。研究表明, 吲 哚美辛可预防乳腺癌、结肠癌、膀胱癌和食道癌的发生。有报道称吲哚美辛对 慢性粒细胞白血病细胞的增殖具有抑制效应,并且这种抑制效应与转录 激活子信号转导有关【】。吲哚美辛对喉癌.细胞系的生长有抑制作用,并 诱导细胞凋亡,促进.细胞形态良性转化【?。吲哚美辛能显著诱导胃癌细胞 凋亡,通过下调.基因蛋白的表达和上调.、.基因蛋白表达而实 现。有研究者还发现吲哚美辛可抑制路易士肺癌细胞的增殖,防止肿瘤的扩散, 抑制对肿瘤有促进作用的其他花生四烯酸代谢产物,如前列腺素,血 栓素等【】。 ..其他作用 吲哚美辛能抑制血小板凝集,降低血液凝固力,还对机体内包括细胞色素 及其混合功能氧化酶系、氨基比林一脱甲基酶、乙基吗啡脱甲基酶、苯胺 羟化酶、蛋白激酶、磷脂酶等多种酶产生影响【。吲哚美辛对这些酶的抑制 可能有以下三种途径:抑制透明质酸酶的活性并抑制白细胞游走,降低毛细 血管的通透性;通过抑制前列腺素的合成进而抑制酶的活性;吲哚美辛 直接对酶产生抑制作用【】。 .制剂研究进展 ..注射剂 注射剂药效迅速、作用可靠,其药液可直接注入组织或血管,因而血药浓度 的达峰时间较其它剂型要短。又因其不经过消化道,不受、酶、食物等影响, 无首过效应,药物不易损失疗效可靠,是兽医临床上的常用剂型之一。陈冠蓉 等【】用%聚乙二醇和水作复合溶媒,以缓血酸铵增溶制成注射剂,在 ?时其有效期仅为.年,但该注射液有效期短,不便于实际贮存、运输及临床 应用;邓意辉等‘”采用薄膜分散法制备脂质体注射液,成本很高,制备工艺也较 复杂。本课题组研制的兽用吲哚美辛注射液,制备工艺简单,成本低廉,有效期 达.年,并且显示出较强的解热与镇痛作用【。 ..片剂 ‘赵瑞芝等‘采用新型骨架材料甲壳胺制备吲哚美辛缓释片,经处方工艺筛选 当甲壳胺的粒度小于岬,抗张强度大于埏时,药物缓释作用显著且溶出 度符合美国药典要求。余琰等【】运用常规技术手段,以羧甲基淀粉钠、低取代羟 第章文献综述 丙基纤维素、微晶纤维素、甘露醇在处方中的比例为因素,崩解时限为指标制备 出吲哚美辛口腔崩解片,其质量检查符合口腔崩解片的相关要求。 ..胶囊剂 胶囊剂为吲哚美辛的另一常用剂型,在普通胶囊剂基础上出现包衣型、微丸 型、微球型等缓释胶囊剂。李柱来等【】以壳聚糖和阿拉伯胶为囊材,以微 囊的药 物包封率为制备工艺优化指标,利用复凝聚法,制备出壳聚糖.吲哚美辛缓释微囊, 体外溶出实验表明该微囊具有较好的缓释作用。王君君等‘明选用不同的亲水性载 体,应用热熔挤出技术制备吲哚美辛速释胶囊,具有较高的溶出度。 ..其他 常见的还有吲哚美辛透皮剂、栓剂、滴眼剂、微型灌肠剂等。透皮治疗系统 是在药物缓释持效的最适部位投药,其特点是不受胃肠道、酶的破坏,无首过 效应,体内血药浓度无峰谷现象,副作用小,且药效缓和【】。路绪文等四用吲哚 美辛、辣叔酊、樟脑、二甲亚砜、甘油制备出吲哚美辛搽剂,对例急、慢性 关节炎,痛风性关节炎,关节囊炎,腰肌劳损,肌肉拉伤患者使用该吲哚美辛搽 剂,总有效率达%。 栓剂经直肠给药,可避免药物直接刺激胃和小肠,使药物较少受肠道或 酶的破坏,药物从直肠吸收可减少肝脏首过效应,还可以减少药物对肝脏的毒副 作用,在体内作用时间亦比口服制剂长【。刘金来等【】将脂肪酸甘油酯、卡波姆、 吲哚美辛超声混合,采用新工艺制备出新生儿用吲哚美辛栓剂,并对其含量进行 了测定。 微型灌肠剂特别适用于小儿,可避免胃肠道副反应。袁宗焕等【】研发 吲哚美辛微型灌肠剂,用紫外分光光度法测定其含量,平均回收率为.%,通 过高温加速试验,有效期可达年。 .不良反应 ..胃肠道反应 吲哚美辛所致的消化系统不良反应有恶心、呕吐、腹泻、上腹痛、消化性溃 疡等,长期使用可致胃肠机能减退,甚至胃粘膜侵蚀变性,胃粘膜剥落严重者可 并发出血、穿孔。发生消化系统不良反应的主要原因是该药在胃肠局部的高浓度 阻断了前列腺素的合成,使胃酸分泌亢进所致】。魏希贤口】报道有痛风患者自服 吲哚美辛治疗,出现大便出血,自觉心慌、头昏,全身无力,在治疗剂量下发生 率约为%.%,有%的病人被迫停药,经诊断为胃出血。卢文丽等】曾用 西南大学硕士学论文 吲哚美辛制作胃溃疡模型,结果表明吲哚美辛造模成模率高,吲哚美辛能引起胃 粘膜局部或慢性炎症、水肿甚至出血。 ..过敏反应 有报道称某患者因风湿性关节炎服用吲哚美辛片 /片,未服用其他药 物,服药后小时面颈部开始出现针头大小的红色丘疹,并迅速向躯干部蔓延, 呈散在性分布,后又泛发全身,皮疹融合形成弥漫性红斑,皮肤瘙痒,经诊断 为 过敏性药疹【。 ..心血管反应 崔春阳【报道有患者因使用吲哚美辛贴剂而出现皮肤出血,鼻出血,有自觉 寒战、发热、头晕、乏力、腹胀等症状。经诊断为急性再生障碍性贫血。张 振东 等【报道有患者因反复关节痛服用吲哚美辛片 ,导致头晕、恶心、心慌、 胸闷,双下肢无力,不能站立,经诊断为药物溶血性贫血。 ..中枢神经系统反应 刘玉荣等【】报道对例发热患儿服用正常剂量吲哚美辛出现虚脱和神经精 神异常反应,经保暖补液后恢复正常。申保红【报道有患者因右膝关节疼痛, 服用吲哚美辛 数分钟后出现胸闷、心悸、烦躁继之四肢无力、震颤等症状。 .兽医临床应用 在临床试验中,本文研制的兽用吲哚美辛注射液的解热效果与等体积的安乃 近注射液、复方氨基比林注射液相当,但前者成本更低,因此本品在兽医临床 上 具有潜在的应用前景。 由于吲哚美辛具有较强的解热作用,可以和其他药物联合应用,有望用于治 疗动物的发热性疾患,如猪、羊、牛的感冒、流感以及细菌、病毒、附红细胞体、 弓形体、衣原体等所引起的发热【】。 其次,吲哚美辛可用于治疗术后疼痛、关节炎性疼痛、神经和肌肉性疼痛, 如马跛行和关节肿胀、肌肉疼痛以及家禽的痛风性关节炎等。当吲哚美辛与某些 药物联用时,可以增强临床疗效,如和氟苯尼考、强力霉素、头孢类抗菌药等联 用,可使抗菌药高度聚集于炎性组织周围。 再者,前列腺素是参与炎症反应的活性物质,在发炎组织中大量存在,与缓 激肽等致炎物质有协同作用。而吲哚美辛能抑制前列腺素的合成,具有显著的抗 炎作用。在兽医临床上,吲哚美辛配合抗菌药治疗肺部炎症,抑制胸腔积液产生 第章文献综述 和纤维素在胸膜上附着【】,对鸡大肠杆菌病胸腔感染、鸭传染性浆膜炎和家禽肺 炎等疾病,可能具有较好的治疗作用。 吲哚美辛可以抑制前列腺素的合成,减轻前列腺素对肠壁的刺激,可有效降 低肠上皮毛细血管通透性,抑制细菌毒素进入血液,并促其排出体外‘。因此, 将吲哚美辛与抗茵药联用,治疗动物的肠炎、痢疾等,可能会获得较好的疗效。西南大学硕十学位论文 第章 引言 引 第章 言 发热是兽医临床上许多疾病都会表现的一种症状,比如近些年大面积爆发的 禽流感、猪链球菌病和蓝耳病,严重制约着畜牧业的发展。常用的动物解热镇痛 药有安乃近、氨基比林、阿司匹林、布洛芬、对乙酰氨基酚等。近年人医临床应 用表明,吲哚美辛也是一种很好的解热镇痛药,其解热效果好,若用于兽医临床 将会有广阔的市场前景。本研究旨在研究一种适合于动物应用的吲哚美辛注射液。 吲哚美辛的解热作用主要是作用于下丘脑体温调节中枢,引起外周血管扩张 及出汗,使散热增加;其镇痛作用主要是通过抑制前列腺素的合成,制止炎症组 织痛觉神经冲动的形成;其抗炎作用主要是通过作用于环氧合酶而抑制前列腺素 的合成和释放,从而缓解炎症反应【蚓。在人医临床上,吲哚美辛主要用于急、慢 性风湿性关节炎,痛风性关节炎及癌性疼痛,也可用于滑囊炎、腱鞘炎及关 。在兽医临床应用上,目前仅见 节囊炎,肠绞痛、输尿管结石症引起的绞痛【 由本课题组申报的兽用吲哚美辛注射液专利。中国药典 年版收载有吲哚美辛及吲哚美辛肠溶片、乳膏、贴片、栓剂、胶囊、搽剂,而在 中国兽药典中一直未收载吲哚美辛及其制剂。 本文按照新的《兽药注册办法》中“化学药品注册分类及注册资料要求农 业部公告第号”,对所研制的吲哚美辛注射液进行了临床前的部分研究,包 括处方工艺、质量标准、稳定性试验、部分药效试验和部分毒理试验等,为吲哚 美辛注射液的临床试验以及下一步申报注册类新兽药奠定了基础。 两南大学硕士学位论文 第章 兽用吲哚美辛注射液的处方工艺研究 第章兽用吲哚美辛注射液的处方工艺研究 作为评价非甾体抗炎药的标准药物,吲哚美辛具有极强的解热镇痛作用。目 前上市的人用吲哚美辛制剂主要有片剂、栓剂、胶囊剂、贴剂、微型灌肠剂及缓 控释制剂等【】。但是吲哚美辛在动物临床上的应用却极少报道。近年随着禽流感 和猪链球菌病、蓝耳病的流行,推动了吲哚美辛在动物方面的应用研究。本章主 ’ 要对吲哚美辛注射液的处方及工艺进行了研究。 .材料 ..仪器 .型紫外分光光度计:日立高科技贸易有限公司; 高效液相色谱仪:.色谱工作站,日本岛津公司; 型电子天平:德国公司; .型数据控超声波清洗器:昆山市超声仪器有限公司; .型精密计:上海虹益仪器仪表有限公司; .型澄明度测定仪:天津大学无线电厂; .型恒温水槽:上海精宏实验设备有限公司; 三用恒温水浴箱:北京市医疗设备厂; 高压灭菌锅:上海申安医疗仪器厂。 ..试药 吲哚美辛原料药:含量.%,批号,武汉同兴生物科技有限公司; 二甲基甲酰胺:分析纯,批号,成都市科龙化工试剂厂; 乙醇胺:分析纯,批号 ,成都市科龙化工试剂厂; 丙二醇:分析纯,批号,成都市科龙化工试剂厂; 甲醇:分析纯,成都市科龙化工试剂厂; 乳酸:分析纯,成都市科龙化工试剂厂; 无水硫酸钠:分析纯,成都市科龙化工试剂厂; 四乙酸乙二胺二钠吖心:分析纯,成都市科龙化工试剂厂; 一级纯化水:实验室摩尔超纯水机 制备。 西南大学硕十学位论文 .方法与结果 ..处方筛选 ...低浓度吲哚美辛注射液处方筛选 单因素试验 在本试验处方中以二甲基甲酰胺和注射用水作为混合溶媒,提高吲哚美辛的 溶解度,乙醇胺调节值,进一步增大吲哚美辛溶解度,乳酸调节值减少刺 激性。吲哚美辛易溶于二甲基甲酰胺,但当加入等体积注射用水后吲哚美辛 易析 出。此外值的变化也能影响吲哚美辛的溶解。因此本处方中的影响因素主要 有吲哚美辛的投药量,二甲基甲酰胺用量,乙醇胺用量及值的大小。 确定正交因素水平 影响注射液稳定性的因素主要有:主药的溶解度,酸碱度,溶剂的性质,光 热的影响等;由单因素试验,设定影响因素为以下四个:吲哚美辛用量,二 甲基甲酰胺用量,乙醇胺用量,值大小;设定水平数为三个。 所以本实验为四因素三水平的实验,记为实验,见表.。 表正交试验因素水平 正交试验结果 测定每组吸光度值,从而推算出该条件下吲哚美辛浓度值,以与吲哚美 辛样品液实际浓度的比值为考察指标,评价正交试验结果,见表.。 第章 兽用吲哚美辛注射液的处方工艺研究 , 表吲哚美辛注射液正交试验结果冤, 表不一水平买验结果百分比总和的平均僵; 覆不二水平买验结果思和的平 均僵; 表示三水平实验结果总和的平均值; 为极差。为平均百分比值中的最大值与 最小值之差。 由表.中极差值的大小可知,各因素对吲哚美辛溶解度的主次关系为 ,即辅料影响顺序为二甲基甲酰胺的用量乙醇胺的用量乳酸的用量。 其优化水平组合为。即低浓度吲哚美辛注射液处方组成为:吲哚美辛 . ,二甲基甲酰胺%,乙醇胺.%,无水亚硫酸钠.%,蝌.%, 乳酸适量值...,注射液用水加至。 ...高浓度的吲哚美辛注射液处方筛选 以当前上市的人用吲哚美辛制剂的量以片剂为例: /片来换算,主 药浓度为 ?‘的吲哚美辛注射液完全满足人医临床需要。但是对于兽医临 床而言,尤其是猪、牛、羊、马等动物,主药浓度?。的吲哚美辛注射液存 在给药体积大,不便于临床应用的缺点。为此,本课题组又对高浓度吲哚美辛 注 射液的处方进行了筛选。从‘‘...”可以看出当二甲基甲酰胺的比例在%? 以内时,%/吲哚美辛注射液稳定性差,所得处方的有效药物含量低。为 此,本课题组又提高了二甲基甲酰胺的用量,其中无水亚硫酸钠为抗氧化剂、 为金属螯合剂,具体如下:两南大学硕七学位论支 表.高浓度吲哚美辛注射液的处方设计 二甲基甲酰胺 吲哚美辛 丙二醇值 群 .. 赫 . ? . 璐 . 如 . 斜 。 加 . 璐 . 们 . 甜 . 加 . 僻 . 柏 . 磷 . ? 二甲基甲酰胺 聚乙二醇 吲哚美辛 存 .. . 群. 毒 .. 捌 .. .???一 经过初均速法热稳定性试验初步筛选出合格的处方为:群、群、、群、群、 撑、。最优处方如下: 吲哚美辛 . 二甲基甲酰胺丙二醇 乙醇胺 无水亚硫酸钠. 乙二胺四乙酸二钠. 乳酸 ... 适量 注射用水 加至 ..制备工艺 称量:准确称取吲哚美辛、无水亚硫酸钠、胺四乙酸二钠,分别盛 于洁净的容器内备用; 配制:取二甲基甲酰胺 、丙二醇 和乙醇胺 置洁净的 烧杯内,加入吲哚美辛. ,搅拌,充分溶解; 取注射用水 至洁净的另一烧杯内,加入无水亚硫酸钠. 和第章 兽用吲哚美辛注射液的处方工艺研究 胺四乙酸二钠. ,搅拌,使其充分溶解,转入内,混匀; 在中,加入乳酸适量,调值至...,加注射用水至全量,混 匀,分别用.岬和. 的微孔滤膜过滤,检验合格后,进行灌封,? 灭菌分钟。 按上述处方、工艺,在重庆市吉亨动物药业有限公司中试批吲哚美辛注射 液批号为:,,,每批万支:。 .讨论 吲哚美辛在水中几乎不溶,溶于乙醚、乙醇、氯仿、甲醇等有机溶剂。由于 吲哚美辛不溶于水,在强酸强碱条件下易被水解,因此选用合适的溶媒成为 研制 吲哚美辛注射液的关键。由于低浓度的吲哚美辛注射液不便于大动物临床应 用, 因此研制出高浓度的吲哚美辛注射液具有积极意义。在高浓度吲哚美辛注射 液中 对于有机溶剂的用量和值控制是筛选本注射液处方的关键。 经过筛选吲哚美辛注射液的处方组成为:%吲哚美辛、%甲基甲酰胺、 %丙二醇、%乙醇胺、.%无水亚硫酸钠、.%口州、乳酸适量、注射 用水加至。其中吲哚美辛为主药,无水亚硫酸钠为抗氧剂,为金 属螯合剂,乙醇胺和乳酸均为调节剂。在此处方中,吲哚美辛本身不溶于水, 加入乙醇胺有助于增加吲哚美辛溶解度,但溶液碱性较强对动物的刺激性较 大, 因而选用乳酸回调值至...最佳为.,降低了该注射液的刺激性。西南大学硕 七学位论文 第章 兽用吲哚美辛注射液的质量标准研究 第章兽用吲哚美辛注射液的质量标准研究 药品质量标准是新药研发与注册申报的重要组成部分,是衡量药物质量可控 的重要手段,同时也是为了深入研究制备工艺对药物性质的影响。本章参照 《中 国药典》年版吲哚美辛及其制剂项下的内容重点考察了吲哚美辛注射液的含 量测定方法,并参照“制剂通则项下的要求对吲哚美辛注射液的性状、鉴别、 检查、含量及有关物质分别进行了研究【。 .材料 ..仪器 . 型紫外分光光度计:日立高科技贸易有限公司; 高效液相色谱仪:?检测器,.泵, 液相色谱工作 站,日本岛津公司; 型电子天平:德国公司; .型数据控超声波清洗器:昆山市超声仪器有限公司; .型精密计:上海虹益仪器仪表有限公司; .型澄明度测定仪:天津大学无线电厂; .型恒温水槽:上海精宏实验设备有限公司; 三用恒温水浴箱:北京市医疗设备厂; 高压灭菌锅:上海申安医疗仪器厂; 型循环水真空泵:上海亚荣生化仪器厂。 ..试药 吲哚美辛注射液:规格:,批号:、、, 重庆市吉亨动物药业有限公司试制; 吲哚美辛对照品:供含量测定用,批号.,四川省药品生物制品 检定所: 甲醇:色谱纯,批号,天津四友精细化学品有限公司; 冰乙酸:色谱纯,批号,成都市科龙化工试剂厂; 乳酸:分析纯,成都市科龙化工试剂厂; 氢氧化钠:分析纯,成都市科龙化工试剂厂; 氯化钠:分析纯,成都市科龙化工试剂厂; 重铬酸钾:分析纯,成都市科龙化工试剂厂; 西南大学硕士学位论文 无水亚硝酸钠:分析纯,成都市科龙化工试剂厂。 ..实验动物 中国家兔只,雄性,体重在..埏,购自重庆医科大学动物实验中心。 重庆医科大学实验动物中心,实验动物生产许可证号:渝.; 西南大学药学院实验动物使用许可证号:渝.。 .方法与结果 ..性状 肉眼观察批、、批,下同吲哚美辛注射液 的颜色及澄明度,结果均为淡黄色或黄色的澄明液体。 ..鉴别 参照《中国药典》年版二部吲哚美辛鉴别项,取吲哚美辛注射液适量约 相当于吲哚美辛 ,加入%溶液滴,混合均匀取溶液,加 .%重铬酸钾溶液. ,加热煮沸,放冷,加硫酸~滴,置水浴上缓缓加 热,应显紫色;另取溶液 ,加.%亚硝酸钠溶液. 。加热至沸,放冷, 加盐酸. ,应显绿色,放置后,渐变黄色。 按照上述要求对批吲哚美辛注射液液进行检查。结果显示批注射液的显 色反应呈正反应,符合规定。 ..检查 ... 检查 按照《中国兽药典》年版一部附录“值测定法”要求,检查批吲 哚美辛注射液的值均在...范围。 ...装量检查 参照《中国兽药典》年版一部“注射液装量检查”要求,取批吲哚美 辛注射液各支,将注射液分别用相应体积的干燥注射器及注射针头抽尽,然 后 注入经标化的量具内,在室温下检视。每支的装量均不得少于其标示量。该 注射 液的装量为 /支,经检视,本品批各支装量均符合规定。 ...澄明度检查 按照农业部发布的兽药澄明度检查标准规定对本品进行检查。取批吲哚美 辛注射液各支进行检查,结果其澄明度均符合规定要求。 第章 兽用吲哚美辛注射液的质量标准研究 ...热原检查 参照《中国兽药典》年版一部附录“热原检查法”要求,对吲哚美辛注 射液进行热原检查。 体温测定:兔箱固定法,每组只家兔。将涂有液体石蜡润滑作用 , 的肛表顺肠腔方向,先下后平行轻插入至肛表刻度?处约 。保留. 轻取出读数。隔 后再测体温,取两次体温值的平均值为正常体温。正常体 温在..?。 给药 耳缘静脉注射吲哚美辛注射液. ?,速度缓慢?????注射完毕后 每隔测定体温,测次一 一?计算体温升高值,即次体温中最高值 .正常体温若为负值以计。 结果判断:合格条件:只家兔体温升高数.且只兔体温升高数和 .。不合格条件:只家兔中有只或只以上体温升高数?.。 经过预试筛选合格的家兔进行试验,试验结果如下表: 表吲哚美辛注射液热原检查结果由上表可知,吲哚美辛注射液热原检查体温 升高度数最大为.,只家兔 升高温度的和为.?,表明该注射液热原检查符合规定。 , ..含量测定 ...色谱条件 .. 砌×色谱柱: ,岬;流动相:. 冰醋酸溶液.甲醇:,. ;流速: 滤膜过滤待用;检测波长: . .,进样量:此;柱温:室温。在上述色谱条件下,吲哚美辛与各 杂质峰及溶剂峰分离良好,理论塔板数不低于,分离度大于.。 ...含量测定方法 于 精确量取吲哚美辛注射液. 容量瓶中,加甲醇定容,摇匀,即 为样品溶液;按照吲哚美辛注射液的处方仅去掉吲哚美辛后制备的溶液为空 白溶西南大学硕七学位论文 液。精密称取吲哚美辛对照品适量,以甲醇作为溶剂,配成含吲哚美辛对照品 为 岭?‘的溶液,即为对照品溶液。分别取上述溶液各此进样,色谱图 见图。照相同方法,连续测定批吲哚美辛注射液,按外标法计算含量,结 .士. 果为 ?~。 . . . . . . . . . 姗 / . . . . . 洳 图. 吲哚美辛注射液含量测定色谱图 :对照品溶液 :样品溶液 :空白溶液 . : : : ...方法专属性考察 ?. 取吲哚美辛注射液适量,配制浓度为 ?。样品溶液,分别经 的溶液煮沸、 ?。的溶液煮沸、?水浴破坏、 士下强光照射处理,反应完毕后用甲醇配制成含吲哚美辛为 烬?以的溶液,分别作为碱破坏溶液、酸破坏溶液、高温破坏溶液和光照破坏 溶 液。取上述四种溶液,照“...色谱条件进样,记录色谱图,详见图。结果, 吲哚美辛注射液经酸、碱破坏后有少量杂质出现,经光照和高温破坏后杂质 较多。 第章 兽用吲哚美辛注射液的质量标准研究 ? 。譬 止 . 卫 . . 卫 删 ? ?州 叭 一? 囊 . . ~ 卫 ’矗’ .撕撕 图.吲哚美辛注射液专属性实验色谱图 :碱破坏溶液:酸破坏溶液:光照破坏溶液:高温破坏溶液 . : ::: ...线性试验 精密称取吲哚美辛对照品适量,以甲醇作为溶剂,配成含吲哚美辛 .?的溶液,进一步用甲醇稀释成含吲哚美辛鹏?~;嵋?~; 肛?一;鹇?~;腭?一; ?一;鹏?。的溶液,按“... 和...项下方法测定峰面积,以浓度为横坐标,峰面积?为纵坐标,进行 线性回归,得回归方程:.,.,结果吲哚美辛 在一“?浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。 两南大学硕士学位论文 图.吲哚美辛注射液含量测定线性关系 ...最低检测限和定量限 取“...”项下的最低浓度对照品溶液 ?。,逐步稀释至信号为 噪音的倍时得出最低定量限约为 /;再稀释至信号为噪音的倍时 得出最低检测限为. /。 ...中间精密度试验 取“...项下浓度为 ?一、 ?~、 ?以的高、中、低 个浓度的对照品溶液,测定日内、日间精密度。结果日内 分别为.%、.%、.%,平均为.%;日间分别为.%、 .%、.%,平均为.%,并且每次检出杂质峰个数、峰面积基本一致。 ...加样回收率试验 取已知含量的吲哚美辛注射液,分成组,各组再分别加入吲哚美辛对照品溶 液、、 ,然后用流动相稀释、定容后按“...和...项下方法测定含 量。结果吲哚美辛注射液高、中、低个浓度的加样回收率,分别为.%、 .%、.%,平均回收率为.%,为.%。第章 兽用吲哚美辛注射液的质量标准研究 表也吲哚美辛注射液回收率测定结果 . . . . ~ . . ~ . . . . . . . . 一 . . 五 . . 一 . . . 一 . 一 . . . . . . 一 . . . . 以 一 . / . . . ...重复性试验 棕色容量瓶中,加甲醇定容至刻度, 于 精密量取吲哚美辛注射液. 按“...和...项下方法,连续进样针,所得峰面积的平均值为., 值为.%。 表.吲哚美辛注射液重复性试验 .编号 峰面积 平均值 %. . ???????????????????一 ..有关物质检查 精密量取吲哚美辛注射液适量约相当于吲哚美辛 ,用流动相稀释 制成含吲哚美辛浓度为 ?’的溶液,作为供试品溶液;精密量取适量,加流 动相制成含吲哚美辛浓度为 ?。的溶液,作为对照溶液。照含量测定项下的 色西南大学硕士学位论文 谱条件,取对照溶液肛注入液相色谱仪,调节检测灵敏度,使主成分能准确积 分。再取供试品溶液依法测定,记录色谱图至主成分保留时间的倍,量取除溶剂 峰外各杂质峰面积总和,用自身对照法计算杂质含量【。 表吲哚美辛注射液有关物质测定结果结果显示,吲哚美辛注射液的有关物质均在.%以内。 .讨论 《中国药典》年版二部吲哚美辛栓剂、胶囊剂的含量测定方法,所 用流动相为. ?‘的冰醋酸溶液.乙腈:。作者用该流动相测定吲哚美 辛注射液含量时,保留时间仅为. ,并且有拖尾现象。作者将乙腈更换为甲 醇,流动相的比例调整为:,结果在该条件下主成分峰的保留时间延长到了 . ,并且主成分峰与溶剂峰、杂质峰分离良好。 《中国药典》年版二部吲哚美辛栓剂、胶囊剂的含量测定所用检测 波长为 /,吲哚美辛的降解产物为.甲氧基一.甲基..吲哚醋酸和.氯苯甲酸 【。作者发现这个降解产物在检测波长 处亦有较大吸收且与吲哚美辛完 全分离。可见,该检测波长不仅能够满足吲哚美辛注射液的含量测定,也适用于 吲哚美辛注射液的有关物质测定。 吲哚美辛注射液在高温、光照条件下不稳定,会产生较大的杂质峰;在强酸、 强碱条件下较稳定,只产生较小的杂质峰。提示,今后测定吲哚美辛注射液的 含 量时,尽量在温和的温度和弱光条件下进行,以减少吲哚美辛的降解。 热原是指能致热的微生物的尸体及代谢产物,即细菌的一种内毒素,是 一种由磷脂、脂多糖和蛋白质所组成的复合物。细菌、霉菌、病毒都可以产 生热原。目前用于热原检查的方法有鲎试剂法和家兔法。鲎试剂法属于体外检查 法,操作迅速、简单,试验成本低廉,是生产过程中热原控制的常用方法,但对 革兰氏阴性菌以外的内毒素不够灵敏。家兔法属于体内检查法,为各国药典所收 载,结论具有权威性汹。通过家兔热原检查,证实吲哚美辛注射液的热原检查符 合规定。第章兽用吲哚美辛注射液的稳定性研究 第章兽用吲哚美辛注射液的稳定性研究 药品的稳定性是新药研究中的重要环节。按照农业部《兽用化学药物稳定性 研究技术指导原则》,稳定性研究包括影响因素高温、高湿、强光照射试验、 加速试验和长期试验。原料药需进行影响因素试验、加速试验和长期试验;制剂 需进行影响因素试验中的光照试验、加速试验和长期试验。为了快速考察吲哚美 辛注射液的热稳定性,本文增加了初均速法,这既可辅助筛选注射液的处方工艺, 又可验证注射液的初步稳定性,还可初步预测注射液的有效期。 .材料 ..仪器 高效液相色谱仪:.色谱工作站,日本岛津公司; 电摩尔超纯水机 :上海摩勒科公司; 型电子天平:上海精天仪器有限公司; .型澄明度检测仪:天津大学精密仪器厂; .型酸度计:上海虹益仪器仪表有限公司; 型超声波清洗机:昆山市超声仪器有限公司; .型循环水真空泵:上海亚荣生化仪器厂; 型数显恒温水浴锅:上海上登实验设备有限公司; .药品稳定性试验箱:上海林频仪器股份有限公司; 型恒温水槽:上海精宏实验设备有限公司。 ..试药 吲哚美辛注射液:规格,批号:,,, 重庆市吉亨动物药业有限公司试制; 吲哚美辛对照品:供含量测定用,批号.,由四川省药品生物 制品检定所提供; 甲醇:色谱纯,成都市科龙化工试剂厂; 冰乙酸:色谱纯,成都市科龙化工试剂厂; 乳酸:分析纯,成都市科龙化工试剂厂。两南大学硕学位论文 .方法与结果 ..光照试验 将批吲哚美辛注射液各支,置药品稳定性试验箱内,调节照度为 ,在第天和第天取样检测性状、澄明度、含量、值等指标,结 果见表.。 表. 吲哚美辛注射液光照试验结果..初均速法 本试验采用初均速法考察吲哚美辛注射液的热稳定性。即在若干个温度点 下, 测定反应的初始平均速度即反应开始阶段单位时间浓度的变化,进而按 指数规律,以代替值推求室温贮存期【。取已经熔封、灭菌的同一批 次的吲哚美辛注射液,分别于?、?、?、?、?、?、?条件 下水浴加热、、、、、、。加热后的注射液迅速冷却至室温, 终止反应,用甲醇稀释成含吲哚美辛 .?以溶液,经.岬滤膜过滤,照“含 量测定项色谱条件,分别进样 ,测定样品中吲哚美辛含量。根据各样品含 量计算其室温下的有效期,初均速法处理的数学模型为:以吲哚美辛的初始 浓度 为,并假设其残存率为%,再将不同温度和相应的时间时所测浓度分别 .% ,再 转换成残存率%,然后按下式计算不同温度下的初均速 / 以 .,.,...年。 第章兽用吲哚美辛注射液的稳定性研究 表吲哚美辛注射液在不同温度下的初均速..加速试验 按照农业部《兽药稳定性试验指导原则》的要求,取批吲哚美辛注射液批 号:,,各支,每个批号样品分装在个干净的 敞口瓶中,置药品稳定性试验箱中,并设置温度为???、相对湿度%? %,放置时间为个月,于第、、、、月末取样一次,考察注射液的性状、 澄明度、含量、值,与个月样品比较。结果,批吲哚美辛注射液的质量稳 定,性状无明显变化,澄明度良好,含量与月相比,未见显著性差异,见表.。 两南大学硕士学位论文 表.吲哚美辛注射液加速试验结果 ? ..长期试验 按照农业部《兽药稳定性试验指导原则》的要求,取批吲哚美辛注射液批 号:,,各支,每个批号样品分装在个干净的 敞口瓶中,置药品稳定性试验箱中,并设置温度为???、相对湿度%? %,放置时间为个月,取样时间点在第一年一般为每个月一次,即于、 、、月末取样一次,第二年为每个月一次,以后每年一次。考察性状、澄 明度、含量、值,并与个月样品比较。结果,到目前为止,经过个月的 加速试验,批吲哚美辛注射液的质量稳定,性状无明显变化,澄明度良好,含 量与月相比,未见显著性差异,见表.。长期试验仍在继续考察中。第章兽用 吲哚美辛注射液的稳定性研究 表吲哚美辛注射液长期试验结果.讨论 吲哚美辛注射液在超常条件下,通过加速其化学或物理变化,探讨吲哚美辛 注射液的稳定性,了解影响其稳定性的因素及可能的降解产物,为吲哚美辛注射 液的包装、运输及贮存条件等提供必要的资料。 初均速法为温度加速试验中的一种,主要考察药物在加热条件的热稳定性。 药物在不同温度下分解初阶段的平均速度的对数,代替反应速度常数的对数,按 照方程,不需要计算反应常数,不必知道反应级数的条件下计算出活 化能和室温贮存期。试验采用初均速法设计,按照含量测定项下的色谱条件,测 定了吲哚美辛注射液在不同温度条件下的含量。从结果可以看到当温度高于 及以上时,吲哚美辛的分解加快,表明吲哚美辛注射液在高温条件下容易分解。 药物热稳定性试验方法主要有加速试验和长期试验,其中长期试验是考察药 物稳定性的最可靠方法,但该方法耗时较久。而加速试验尤其是其中的初均速法 特别适合新药、新制剂处方及工艺的筛选,能够快速预测出药物在室温下的有效 期一。本文采用的初均速法,提前预测吲哚美辛注射液在?下的有效期为. 年,为继续长期试验确定该注射液的有效期奠定了基础。 西南大学硕士学何论文第章兽用吲哚美辛注射液的部分安全性试验 第章兽用吲哚美辛注射液的部分安全性试验 药品的毒理学试验是进行下一步临床试验的重要前提,是新药研发中的一个 重要内容。本文按类新兽药注册要求,测定了吲哚美辛注射液的半数致死量、 蓄积性、耐受性、溶血性、肌肉刺激性等安全性指标,并初步考察了该注射 液对 小鼠一般行为、自主活动和协调机能的影响。 .材料 ..仪器 .型小鼠自主活动测试仪:成都泰盟科技有限公司; 小鼠转棒式疲劳仪:成都泰盟科技有限公司; .型台式微量高速离心机:长沙湘仪离心机仪器有限公司; 紫外.可见分光光度计:上海菁华科技有限公司; 摩尔超纯水机:上海摩勒科公司; 肝素钠管:浙江拱东医疗科技有限公司: 一次性注射器、手术操作台、天平、手术器材等为实验室常规仪器和器皿。 ..试药 吲哚美辛注射液:规格:,批号:,重庆市吉亨动物药 业有限公司试制; 生理盐水:本实验室自制; ..实验动物 小鼠, ,雌雄各半,重庆医科大学动物实验中心; 中国家兔,.~. ,雌雄各半,重庆医科大学动物实验中心。 重庆医科大学实验动物中心,实验动物生产许可证号:?渝; 西南大学药学院实验动物使用许可证号:渝.。 .方法与结果 ..急性毒性试验 预试验:取小鼠只,每组只,雌雄各半,分别肌肉注射不同剂量 的吲哚美辛注射液,给药后观察,预试找出受试药物%和%致死量。 正式试验:根据预试的和,将只小鼠雌雄各半随机分组。两南大学硕十学位论 文 根据按.:的等比级数设为等个剂量组。每组只,肌肉注射 给药。给药后连续观察,记录小鼠临床表现及死亡数,并剖解死亡小鼠,观 察其主要实质器官的病理变化。采用改良法计算吲哚美辛注射液的半数致 死量及其%可信区间【】。 ??一.】 其中,:最大剂量组剂量的对数值; :相邻两组剂量高剂量与低剂量之比的对数值; :各组动物死亡率; :动物死亡率总和。 表. 吲哚美辛注射液急性毒性试验结果 通过预试,得吲哚美辛注射液的个剂量值,分别是. 、. 、 . 、 瓜、 、 /,肌肉注射给药,观察天,记录 小鼠的中毒情况及死亡情况。试验结果按改良法进行计算,即 /,%可信区间的值 ~...,结果吲哚美辛注射液的. 为.. 。 ..蓄积性试验 选取小鼠只,雌雄各半,随机分成试验组和对照组,每组分别为只小 鼠,试验采用剂量递增法给药,给药前禁食 ,但不禁水。试验组每天肌肉注射 给药. ’即. ,相当于. ?,为一期,以后给药 剂量按.倍每递增一次,称重并比较体重变化;对照组腹腔注射同体积生理盐 水。连续观察,根据公式/计算出蓄积系数;对药物的蓄积性 进行评价【。 第章兽用吲哚美辛注射液的部分安全性试验 表蓄积性试验给药方案给药时间/ 每天剂量/ 每期剂量// 累计剂量// . . . ~ . . . . . . ~ . . . . . . 表蓄积作用评价标准 ? 蓄积系数 蓄积强度分级 极度蓄积 强蓄积 ~ 中度蓄积 若蓄积或基本无蓄积 表吲哚美辛注射液蓄积毒性试验结果士, 士, 给药时间/ 累计剂量/ 死亡动物数 小鼠体重儋 对照 用药 / 对照 用药 .士. .士. ..士. .士. ~ ..士. .士. ~ ..士. .. ~ ... .士. ~ ..士. .士. 整个实验结束,用药组小鼠死亡只,蓄积系数,表明吲哚美辛注射液无 蓄积性。