蛋白质组学茵陈蒿汤文献翻译

蛋白质组学研究中传统中药公式茵陈蒿汤的保肝药与二维聚丙烯酰胺凝胶电泳和基质辅助激光去吸附/离子化时间质谱法结合 摘要： 蛋白质组学在中医药研究中的突破。茵陈蒿汤，一个著名的方剂，已被用于缓解各种类型的肝脏损伤。然而，茵陈蒿汤与肝损伤相关的药物靶点的机制在很大程度上是未知的。确定茵陈蒿汤可能的靶蛋白，二维电泳电泳（2-DE）为基础的蛋白质组学和蛋白进行治疗后，茵陈蒿汤MALDI-TOF / TOF-MS。有趣的是发现改变，15例调制蛋白被鉴定出7例发现是由茵陈蒿汤显著改变。茵陈蒿汤治疗引起显著的锌指蛋白407、触珠蛋白、巨球蛋白、α1-抗胰蛋白酶显著下调；调节甲状腺素运载蛋白，维生素D结合蛋白和凝血因子，可能参与代谢，产生能量，分子伴侣，抗氧化作用、信号转导、蛋白质折叠和凋亡。最后，交互网络从7个差异表达蛋白的信号相关蛋白的生物信息学分析建立。值得注意的是，这些信号相关蛋白可通过直接相互作用或只有一个中间伙伴将7个蛋白质包含在网络中。功能途径分析表明，这些蛋白在蛋白质-蛋白质相互作用网络和多种重要的生理途径的调节。因此，我们的数据将有助于了解对茵陈蒿汤保肝作用的分子机制。 1引言 高通量技术在复杂生物系统中测量蛋白质大规模变化的进展，极大地改变了生物医学研究。整合蛋白质组学的努力与传统中医药（TCM）推动了一个新的药物发现范式的发展[ 1 ]。靶点筛选与分析是中医药研究的挑战。福尔图纳特伊利，蛋白质组学技术已经成为系统生物学发展的关键工具，蛋白质组学技术的使用是理解和发展中医[ 2 ]解释至关重要。蛋白质组学技术是基于大量的分析能力对蛋白质鉴定和定量的现代质谱联用分离技术[ 3 ]提供。蛋白质组学的快速发展提供中医药研究的新工具和潜在的发展现代化和国际化的进程中医[ 4 ]。 中医已经并将继续作为生物探针给他们天生的能力与生物目标的高亲和力和选择性相互作用中发挥着重要的作用。关于目标的知识药物相互作用蛋白和蛋白–中医关键是行动的常备药模式下，疗效与中医[5,6]活动。识别他们的目标是必需的合作m-prehensive了解其药理作用和解开它们的作用[ 7 ]机构。最近开发的蛋白质组技术的高通量并行分析的所有功能蛋白质的表达，从而打开的可能性提供详细的分子机制，在全球范围内[ 8 ]。新兴的基于质谱的蛋白质组学有选择性地目的蛋白，以改善不希望的表型提供了一个强大的工具，在目标发现中医[ 9 ]。结合基因组学和网络分析将使公共关系的发展edictive疗效模型和目标蛋白的鉴定（S）中医药作用。 蛋白质组学分析已成功地应用于研究药物的分子效应，并获得有关其作用方式和治疗机制的信息[ 10 ]。茵陈蒿汤，一个众所周知的方剂，由青蒿、栀子、埃利斯、大黄，是其中最重要和最广泛使用的中药在临床实践中对黄疸和肝障碍处理[ 11 ]。它原是中国汉代的“伤寒论”（150–公元215年），并被正式列入中国药典[ 12 ]。值得注意的是，在文献中，各种各样的茵陈蒿汤的生物学效应已被描述，如治疗胆汁淤积，肝纤维化、肝炎、胆汁性肝硬化和胆汁淤积肝病[13,14]。虽然这样的中药具有不同的药理作用，其保肝作用机制仍不清楚。因此，在本研究中，我们将使用蛋白质组学，以及探索目标研究茵陈蒿汤和影响的机制的计算方法，作为一个案例研究。利用双向电泳进行差异表达蛋白检测，然后MALDI-TOF/TOF-MS被确定，最后，利用生物信息学分析程序，验证茵陈蒿汤可能作用的直接目标。 2，材料和方法 2.1。化学试剂 聚丙烯酰胺凝胶制备的超纯试剂，得到从生物RAD。18厘米的固相pH梯度（IPG）条（条），IPG缓冲区和干燥的带盖液PUR追从Pharmacia公司（乌普萨拉，瑞典）。二硫苏糖醇（DTT），PMSF，碘乙酰胺，尿素，硫脲，- cyano-4-hydroxycinnaic酸（CCA），和胰蛋白酶来自Sigma购买（圣路易斯，穆村，美国）。3 - [（3 -胆酰胺丙基）-丙磺酸钠溶]（CHAPS）、甘氨酸、过硫酸铵（APS），三氟乙酸为O获得可溶性（梭伦，哦，美国）。在2-DE中使用的其他试剂从生物RAD购买。 2.2。茵陈蒿汤的制备 植物原料来自于哈尔滨同仁堂药店购买（哈尔滨，中国）。所有药材的生药学研究室习俊望教授鉴定，黑龙江中医药大学。茵陈蒿汤的制备如我们先前的研究[ 14 ]。简而言之，茵陈蒿汤提取物由以下三提取的成分混合以下比EE药用草本植物：阿尔泰米夏、Gardenia jasminoides Ellis、和毛细血管，Rheum officinale Baill，18:9:6（重量）。根据原构图和前记录在<<伤寒论>>茵陈蒿汤茵陈蒿汤的制备方法，是在下面的程序编写。Flos Artemisiae（18克）煮1400毫升蒸馏水直到水的体积减少到约400毫升，9克栀子jasminoidis和6克大黄进行补充，并保持沸腾10分钟。提取液经5层纱布，浓度为1克每毫升粗药，最后溶液冷冻干燥。 2.3。动物处理和样品制备 雄性Wistar大鼠（体重200±20 g）由黑龙江中医药大学GLP中心提供（哈尔滨，中国）。房间温度真正的调节在25±1◦C 50±湿度5%。一个12小时的光/暗周期是固定的，免费的标准饮食和水。肝损伤产生的四氯化碳，正如我们以前所描述的[ 11 ]。动物随机分为对照、模型和茵陈蒿汤组每组8只。茵陈蒿汤用蒸馏水溶解，每天给药（250毫克/公斤口服）9天。收集血液从肝门静脉，并通过离心分离血清在4500转5分钟在4◦C，Flash液氮冷冻和储存在80◦C直到使用。 2.4。双向聚丙烯酰胺凝胶电泳（2-DE）。 血清中含30 mM Tris-HCl缓冲了同质化，7 M尿素硫脲，2米，4%人，和40 mM DTT，在这之后的裂解液于12000 rpm离心60 min 4◦C.上清液沉淀用TCA沉淀法回收总蛋白，与干扰组分使用2-D清洁套件移除（GE医疗、Piscataway、NJ）。每个样品的蛋白质浓度测定使用布拉德福德方法。总共有350毫克的蛋白质被加载到一个18厘米的线性IPG胶条（pH 3–Amersham Biosciences公司，10，Piscataway，NJ）为第一向等电聚焦（IEF）。这条被放置到一个双向电泳细胞（Bio-Rad）和复水50 V 12 h后的蛋白进行分离，基于PI根据以下：250 V的线性爬60分钟，1000 V快速爬了60分钟，10000伏线路AR爬5小时，和10000 V快速爬升到60000的水平力。在IEF，IPG胶条进行平衡15分钟，在缓冲液中含有50 mM Tris-HCl，pH值8.8，30%甘油控制，7 M尿素，2% SDS和DTT，1%；他们的毛皮类似缓冲疗法治疗（含4%乙）15 min，直接应用到12%个均匀的SDS-PAGE凝胶电泳6 h电泳使用千变万化的二西细胞系统（Bio-Rad）。每个实验一式三份。 2.5。图像分析 凝胶，然后银染使用生物银银染色加试剂盒（生物弧度）根据制造商的指示。银染色的凝胶进行扫描，利用G GS-800密度计（Bio-Rad）然后分析了使用pdquesttm软件（Bio-Rad）。LabScan软件（应用生物系统公司、福斯特城、CA）进行图像分析，包括背景摘要衍射光斑强度标定，现场检测，匹配。每个斑点的强度进行量化，通过计算后的凝胶图像的点体积已被归一化。每个样品是亲处理一式三份，以确保可重复性，与学生的t检验被用来评价蛋白质丰度对应每个靶点在凝胶的平均变化。蛋白质斑点超过一倍密度显著变化（P＜0.05）被认为是差异表达的和被选定为使用MALDI-TOF质谱鉴定 2.6。MALDI-TOF-MS和数据库搜索的蛋白质鉴定 差异表达的蛋白点进行水平的兴趣从2-D凝胶与ExQuest点刀切除（bio-r广告），洗3次蒸馏水，脱色15毫米铁氰化钾在50毫米硫代硫酸钠在室温为2分钟，在离心脱水在乙腈和最后干燥状态，汽化器。孵育30分钟后，凝胶消化超过12小时，在37◦C肽提取两次用0.1% TFA（三氟乙酸）50%可以干下氮气保护。对于MALDI-TOF/TOF MS，肽混合0.5升的MALDI基质（5毫克/毫升-氰基-4 -羟基肉桂酸稀释0.1% TFA和50%乙腈）和在MALDI样品板的斑点美国MS测量上具有延迟离子提取蛋白质分析仪进行（Applied Biosystems）。质谱分析的参数设置如下：加速电压20 kV电网V；电压64.5%；延迟100纳秒；和激光脉冲数的50。MS / MS精度校准ibrated对m/z的MS / MS的片段，这是一个高峰，在肌红蛋白肽马产生指纹（PMF）。