HPLC法测定人血浆中维拉帕米浓度

HPLC法测定人血浆中维拉帕米浓度 5,l为流动柑,紫外232nn_处测定.采用外标法峰高定量.血药i磕度在2.5,4000ng/m]线 关采岛奸09996=最低世浓度为2.0ng/ml回收率达95.il,l[)1.?r日内,日间 舟别为3.76,6.45和6.O6,746 关键词维拉帕水;血药浓度;HPLC 盐酸维拉帕米(verapamilhydrochloride) 为第一代钙通道阻滞剂,临床上用于心律失 常,心绞痛及高血压的治疗一].用高效液相 色潜法测定人血浆中维拉帕米浓度的方法很 多,大多采用荧光检测法一,亦有用紫外 检测法,但其固定相使用C一或(:.0,洋品 处理繁琐,费时.本文建立了以ZorbaxSilica 为固定相,高效液相紫外检删法测定人血浆 中维拉帕米浓度的方法 1实验部分 1.1仪器,样品及试剂 Varian5060高效液相色谱仪}Varian UV100型紫外检测器;Rheodyne7125型手 动进洋阀,50定量管;ttP3390A积分仪: GL20全自动高速冷冻离心机(湘西仪器仪 表总厂机械仪器厂), 盐酸维拉帕米标准品(美国USPClnc.); 盐酸维拉帕米缓释片(240mg/片,美国Knoll 公司.批号21g00154);乙腈,甲醇(色谱纯, 江苏省淮阴精细化工研究所);其余试剂均为 市售分析纯. 1.2色谱条件 色谱柱为ZorbaxSilica,250mm×4.6 嘘稿日期1995嗨12 mmID,jtim(Dupont公司),流动相由0.05 mol/L磷酸二氢铵乙腈一甲醇一三乙胺(50: 25:25:0.25,,)组成.用85磷酸调pH 至6.0.紫外检测波长232nm.吸收量程 0.005AUFS.流动相流速0.7ml/min,柱温 40c.在该色谱条件下,维拉帕米能达到基线 分离,保留时间约65min.色谱图见图1. FigI-Chrolr,litogramsfromhumanplasmaextrac:(A)black pl~ma{[B)sl,~ndardcoatainingverapaml】8Ong/mll(c) piefrom?Iu?r2hafter240mg0Taldose1meta~lite 2.met~lite,3.veramIIhI一573mit1.”:一B04mln. 6?min 1.3血浆样品预处理 取健康志愿者肝素化血浆1.0ml,加乙 348中国药科大学26卷 醚一正己烷(1:1,l,/I.)混台液6.0ml,在漩涡 混合器上混旋2min,3500r/rain离心5 rain,取上清液(有机相)5.0ml转移至另一试 管中.置35C恒温水浴上用氮气流吹干.残 留物用流动相l50.0ul溶解,振荡3.0rain, 高速离心(15OOOr/rain,10min)后进样分 析. 1.4方法论证 1.4.1线性关系取健康志愿者肝索化血 浆1.0m1.精密加入不同量的维拉帕米标准 品,使血浆中药物浓度分别为2.5,5.0, 10.0.20.0,40.0,80.0,120.0,160.0.240.0, 320.0,400.0ng/ml,用上述方法进行提取和 测定,得浓度C对峰高的回归方程:一 32.0C+53.0,=0.9996一6]. 1.4.2方法回收率取健康受试者空白肝 索化血浆1.0ml,精密加入不同量的维拉帕 米标准品,使最终浓度分别为10.0,80.0, 320.0ng/m1.充分混匀后,按前述方法进行 提取,所得峰高与标准品直接进样的峰高比 较,计算回收率结果见表1. Tab1R鸳oVeryofverapamflJnplasma7) 1.4.3方法精密度及检测限配制一定浓 度的维拉帕米标准品,加入健康受试者空白 肝素化血浆中,按前述方法进行处理.在一天 内测定七次,计算日内精密度;每天测定一 次,共测七天,计算日间精密度.结果见表2. 方法最低检出血浆中维拉帕米浓度为2.0 ng/ml(S/N?3计). Tab2-Preeisioaofthemethod(peakhdBll’.7) Cone-,Int=r—daylnt~a—day r~/ral士 103{l?22 8036士l{9 32099dl士374 . 6{5 6.12 3.76 335士25 2{50士】65 1009l士6l2 , 7{6 5.73 6.06 1.5方法应田 12名健康志愿受试者,年龄22.3士0.6 岁,体重59.8士4.3kg,经体检心脏,肝脏,肾 脏功能正常.清晨空腹口服盐酸维拉帕米缓 释片240mg(1片),温开水200ml送服.服 药3h后可进食.实验期间统一饮食.于服药 后2,4,6,8,10,12,15,24,28,34,48h由肘 静脉取血于肝素化试管中,离心取血浆1.0 ml.经处理后,用高效液相色谱仪测定维拉帕 米的含量.结果见图2所示.血药浓度一时闻 数据采用矩量法计算相关的药代动力学参 数.结果表明,该片剂的‰为6.35士2.03 h,.为123.11士39.82ng/nd,tj,2为8.85士 2.16h,朋船’为l6.35士3.56h,AUC为 1896.O士821.6ng?h/ml Fig2-MeanvmpamUplasmaconcentration-timeprofilemvol ur=to~18(i~12)afteroraladmlnlstra~cn0f240mgver丑p舯il hr? 2讨论 本法用正己烷/乙醚处理血浆样品,以 Silica为固定相,样品处理简便,快速.实验结 果表明,本法线性关系好,回收率高,相对标 准偏差小,色谱图可见无杂质峰干扰,其专一 性较高.故本法符合生物样品的测试要求,适 用于维拉帕米临床血药浓度的监测及其药代 动力学研究, 文献报道维拉帕米的主要代谢产物有二 个,即norverapam;l和gallopamilE].从本 6期谢林等:HPLC法涮定人血浆中维拉帕米浓度349 文的图1一C可见,与空白样品色谱图比较,在 5.73rain和6.04rain有二个色谱峰存在,可 能即为norverapamil和gallol~amil.限于实验 条件,未能找到合适的标准品加以鉴定. 郭建兰等人研究了健康志愿受试者单 剂量口服240mgKnoll公司生产的盐酸维拉 帕米缓释片后,所得的主要药代动力学参数 …为6.71士1.25h,(‘…175.8?90,8ns/ ml,f.,28.27h,Mffll1.24h,AOC1739ng?h/ ml,与本文的研究结果基本一致. 参考文献 l郭建兰,曹德善,李瑶舯等,盐酸雏拉帕米埋释片体外 溶出及生物利用度的研究中国药科大学,1992, 2S88 2ShlbukawaA.WairierlWSimult,aaeousdirectdetermination ofeenantiomersof~ra0ami]andneeveral~mtltnplasma usingaderlvatlzodamy]osehigh—perf~mane~liquidchro_ matograph~chiralstati~ypha.J0硼自’,1992. 57’.85 3Hara~tSR,Ka慨RE娜dhighliqu_dehtorn~tm graphicanaly*isofv~mpamiltnbloodandpl,~ma.JC/n,~ .1979,170{385 4KaeprowlczAT,Fulllnf~wROtBuryRW.HIgll-performanee liquidehromatogrn#demtofverapamiltnplasma usingadio[colamnJ0.1985,gS7;412 8JaouniTM.LeonMB.Ro~in8DR.”.Analysisof l:~milinplasmabyliquidehrerrmtograplly-JC咖t 1980,182:73 6LCKRideoutJM.SheldomJWS.Determinatio~nof I~mitandno~era0ami]ins目mbyhigh—performanceliquid chr0m砒.a口hyd”彻md,1983_e|887 7Fi~serH.BlasehkeGDirectdetermlnatlcaoftheenan~omer— ratioofvetalxamiltitsm*ljotmetabolitenorverapamiland 8alto~milinplasmabyehira]htgh—perfcemanceliquidchI matography-Jr,l998,575}255 8HarapatSR,Kate~RE-High?rf??liquidchr.ma【 gr,a~canalysisofverapmai].Jdm,l980,181:484 9ColeSCJtF[ar~aganRJ,JohnstonA,.RadhigllI~rforr moeliquidehromatograDhicmethodforthemcm-钉e?”nt ofvotai~amllandttotveralmmlliab[oo4bJ m.,1981,218:82l l0KoppelC.WasemannAPlasma]eve]monJtolSngof0.L_ver apamilandthreeoflmembolitesbyrsed—phasehigh— performanceliquidchromatography.J姆t1991, 570{229 IlKuwadaM,TateyamaT.Tsul~umiJSlmuttan~usdetermina— tionofverapaml[andits…metaboltt=sbyhigh—perfor- liquidehmmatosraphyJdn.1981,222:507 12RustumAM-M埔岫I【ofveralxaml[inhumanplasmabv 伸vers.d—phSs*high—pe竹0r咖oellqu?C’~3[cSl”aph峥 tn8Bshortdoetylcolumn.Jm,1990t528}480 l3朱兆恩.胡冠时.反相高效液相色谱法谢定人血浆中盐 酸维拉帕米的研究.中茸药学杂志.1992,27:280 HPLCMeasurementofVerapamilinHumanPlasma UsingaSilicaColumn XieLin,LiuXiaodong,ZhouYunshu,WangJin,LiuGuoqing Del~rtmentofr?r删,ChinaPtmrmace~walUngersity,?积j210009 AbstractAHPLCmethodwasdevelopedforthedeterminationofveraparnflinhumanplasma.Vera- pm’nilwasextractedfromplasmausingmixtureofetherand—h~xane(1:1). AZorbaxSiHeacolum/1 (250mm×4.6mmID,5m)wasusedandauvdetectorwassetat232/lm.ThemobileDhasecon— sistedof0.05mol/LNH?H2PO{,acetonltrile,methanolandtricthylamineatratioof50:25:25: 0-25(adjustedtopH6.0withphosphoricacid).Therewasnointerferencewithitsmetabolitesandefl— dogefloL1scomponentslnplasma.T’hestandardcorvewaslinearovertheco ncentratonrangeof2.5, 400-0ng/ml—0-9996).Therecoverieswere95.?, l01.99andtheminimumdetectionc0n— centrationofverapami】inplasmawas2ng/m1.Analysisofplasmasampl髂 collettedfromhealthysub- Jectsdemonstratedthatthisassaywasapplicabletoclinicalandpharmacokin eticstudies KeywordsVerapamil;Plasmaconcentration:HPLC