山羊痘病毒、羊传染性脓疮病毒的检测

山羊痘病毒、羊传染性脓疮病毒的检测 ICS 11.220 B41 DB45 广西壮族自治区地方标准 DB 45/T XXXXX—2011 山羊痘病毒、羊传染性脓疮病毒的检测 山羊痘病毒、羊传染性脓疮病毒的检测 二重聚合酶链反应法 Detection of goatpox virus and Orf virus by duplex PCR 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 (征求意见稿) (本稿完成日期:2010年12月7日) 2011 - XX - XX发布 2011 - XX - XX实施 发布广西壮族自治区质量技术监督局 DB45/T XXXXX—2011 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 术语和定义 ........................................................................ 1 3 试验材料 .......................................................................... 2 3.1 用于GTPV和ORFV鉴别检测的特异性引物 .......................................... 2 3.2 试剂 .......................................................................... 2 3.3 仪器设备及耗材 ................................................................ 3 4 操作 .......................................................................... 3 4.1 待检样品的准备 ................................................................ 3 4.2 待检样品总DNA抽提 ............................................................ 4 4.3 PCR扩增 ....................................................................... 4 5 PCR检测结果判断 ................................................................... 4 5.1 电泳 .......................................................................... 4 5.2 结果判定 ...................................................................... 5 附录A(资料性附录) 试剂盒 .......................................................... 6 附录B(规范性附录) 溶液的配制 ...................................................... 7 附录C(资料性附录) 溴化乙锭溶液的净化处理注意事项 ................................. 10 附录D(规范性附录) 溴化乙锭溶液的净化处理 ......................................... 11 附录E(规范性附录) 1,琼脂糖凝胶的制备 ............................................ 12 附录F(规范性附录) 检测结果凝胶电泳图示 ........................................... 13 I DB45/T XXXXX—2011 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由广西壮族自治区水产畜牧兽医局提出。 本标准起草单位:广西壮族自治区动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人:郑敏、施开创、胡杰、刘棋、李军、陈义祥、陆文俊、莫胜兰、梁媛、屈素洁。 本标准为首次发布。 II DB45/T XXXXX—2011 标准名称 1 范围 本标准规定了应用二重聚合酶链式反应技术检测山羊痘病毒和羊传染性脓疮病毒的材料准备、操作方法及结果判定方法。 本标准适用于山羊痘和羊传染性脓疮的快速鉴别诊断，可对病羊临床组织样品及病毒细胞分离培养物进行检测。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 2.1 山羊痘 goat pox 是由山羊痘病毒(Goatpox virus, GTPV)引起山羊的一种高度接触性传染病，以发热、全身痘疮、结节和死亡为特征。由于该病可造成严重的经济损失、阻碍国际贸易，被世界动物卫生组织(OIE)列为需报告的传染病，我国农业部将其列为一类动物疫病。 山羊痘病毒(GTPV)是痘病毒科(Poxviridae)羊痘病毒属(Capripoxvirus)成员，是一种有囊膜的DNA病毒。 2.2 羊传染性脓疮 contagious ecthyma 俗称羊口疮，是由羊传染性脓疮病毒(Orf virus, ORFV)引起的一种高度接触性传染病，侵害绵羊、山羊和野生反刍兽，表现为口唇等处皮肤和粘膜形成丘疹、脓疮、溃疡和结成疣状厚痂，主要通过圈舍、用具或皮肤擦伤传播，呈群发性。该病呈全世界广泛流行，我国农业部将其列为三类动物疫病。 羊传染性脓疮病毒(ORFV)是痘病毒科(Poxviridae)副痘病毒属(Parapoxvirus)成员，是一种有囊膜的DNA病毒。 2.3 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction, PCR PCR技术是一种在体外快速扩增特定DNA片段的方法。由热变性?复性?延伸三步反应组成一个 PCR循环，经过多次循环反应，使目的DNA得以大量扩增。 2.4 二重聚合酶链式反应 duplex polymerase chain reaction 1 DB45/T XXXXX—2011 是在常规PCR基础上改进并发展起来的一种新型DNA扩增技术，在同一反应体系中同时加入两对 引物扩增两条目的基因。采用这一技术可同时检测两种病原微生物。 2.5 引物 primer 与待扩增DNA片段两端互补的一段寡核苷酸。 2.6 特异性引物 specific primer 针对特定模板 DNA 片段设计的一段互补寡核苷酸，在 PCR 反应中与模板 DNA 特异性结合。 3 试验材料 3.1 用于GTPV和ORFV鉴别检测的特异性引物 根据GTPV和ORFV的基因组特性和差异，在GTPV的A29L基因保守序列设计合成了1对寡核苷酸引物 GTPV1/GTPV2，在ORFV的H3L基因保守序列设计合成了1对寡核苷酸引物ORFV1/ORFV2，扩增片段大小分别 为413bp和708bp，两对引物的使用浓度均为25mmol/L。 3.2 试剂 3.2.1 抽提试剂 DNA抽提试剂如下: ——DNA抽提试剂:平衡酚:氯仿:异戊醇按体积分数分别为25:24:1比例混合; ——10,SDS; ——20mg/mL蛋白酶K; ——异丙醇; ——75,乙醇。 注:商品信息见附录A。 3.2.2 PCR试剂 PCR试剂如下: ——Taq DNA聚合酶; ——dNTPs混合物:包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP; ——MgCl; 2 ——PCR缓冲液。 注:商品信息见附录A。 3.2.3 电泳试剂 电泳试剂如下: ——1,琼脂糖; ——10 mg/mL溴化乙锭; ——凝胶加样缓冲液; 2 DB45/T XXXXX—2011 ——1倍Tris-硼酸电泳缓冲液。 注:试剂的配制见附录B。 3.2.4 其他试剂 其他试剂如下: ——灭菌双蒸水; ——灭菌PBS，pH7.2; ——TE缓冲液。 注:试剂的配制见附录B。 3.3 仪器设备及耗材 3.3.1 仪器设备 本方法使用下列仪器设备: ——生物安全柜; ——PCR仪; ——电泳仪; ——紫外投射仪或凝胶成像系统; ——小型台式高速离心机; ——水浴锅; ——漩涡振荡器; ——乳钵或玻璃研磨器; ——微量加样器:200µL,1 000µL、40µL,200µL、5µL,40µL、0.5µL,10µL等多种规格。 3.3.2 一次性耗材 本方法使用下列一次性耗材: ——离心管:1.5mL和0.5mL; ——PCR反应管; ——吸头:200µL,1 000µL、40µL,200µL、5µL,40µL、0.5µL,10µL等多种规格。 4 操作方法 4.1 待检样品的准备 根据具体情况，选择以下一种或多种方法。 4.1.1 临床组织病料的采集及预处理 无菌采取1 g待检羊的皮肤、淋巴结、脾、肝及肺，置于乳钵或玻璃研磨器中，加入少量灭菌石英砂和5 mL灭菌的PBS充分研磨，使其成为匀浆，收集组织悬液，反复冻融3次。以3 000×g离心5 min，收集上清液。上清液供总DNA抽提，或者-20 ?保存备用。 4.1.2 病毒分离培养物的收获及处理 收获疑感染GTPV或者ORFV的单层细胞培养物，反复冻融3次。以1 000×g离心5 min，收集上清液，供总DNA抽提，或者-20 ?保存备用。 3 DB45/T XXXXX—2011 4.2 待检样品总DNA抽提 在已预处理的650µL待检样品中加入65µL的10, SDS和10µL的20 mg/mL蛋白酶K，振荡混合，37 ?水浴1 h。加入等体积的DNA抽提试剂，振荡混合，室温作用5 min。于4 ? 10 000×g离心10 min。收集上清液，加入等体积的冷异丙醇，颠倒混合均匀，室温作用20 min或者-20 ?作用过夜。4 ? 12 000×g离心10 min，倒去上清液，重新加入1.5 mL75,的冷乙醇。10 000×g离心10 min，倒去乙醇，将离心 管倒置于在干净的吸水纸上15 min，风干粘附于管底的总DNA沉淀物。最后加10µL TE缓冲液至总DNA 沉淀中，55 ?水浴15 min，取3µL,5µL总DNA样品进行PCR或者-20 ?保存备用。 4.3 PCR扩增 4.3.1 PCR操作 在冰浴条件下，在PCR反应管中按下列试剂用量分别加入各成份: ——25 mmol/L MgCl: 50µL，终浓度为2.5 mmol/L; 2 ——10倍PCR缓冲液:50µL，终浓度为1倍; ——2.5 mmol/L dNTPs:20µL，终浓度为0.1 mmol/L; ——5 U/μL Taq DNA聚合酶:0.5µL，终浓度为0.05 U/µL; ——GTPV上游引物(GTPV1):0.5µL，终浓度为0.5 pmol/µL; ——GTPV下游引物(GTPV2):0.5µL，终浓度为0.5 pmol/µL; ——ORFV上游引物(ORFV1):0.5µL，终浓度为0.5 pmol/µL; ——ORFV下游引物(ORFV2):0.5µL，终浓度为0.5 pmol/µL; ——DNA模板:3µL; ——灭菌双蒸水:补足至总体积为50µL。 4.3.2 PCR反应程序 加完试剂后瞬时离心混匀。将PCR反应管置于PCR仪内，按下面反应程序进行PCR反应:94 ? 5 min;然后进入94 ? 1 min，55 ? 1 min，72 ? 1 min的循环，共进行10个循环;然后进入94 ? 1 min，53 ? 1 min，72 ? 1 min的循环，共进行20个循环;72 ? 10 min;4 ?结束扩增。PCR产物保存于4 ?以备电泳。 4.3.3 PCR阴性对照及阳性对照 4.3.3.1 阴性对照 用3µL从健康山羊组织抽提的DNA为模板作阴性对照。 4.3.3.2 阳性对照 用GTPV AV41株和ORFV GO-BT株细胞培养物的混合物的DNA 3µL为模板作阳性对照。 注:注意事项见附录C。 5 PCR检测结果判断 5.1 电泳 注:废弃的溴化乙锭或者含溴化乙锭的电泳液、凝胶等要集中回收处理，处理方法见附录D。 4 DB45/T XXXXX—2011 5.1.1 琼脂糖凝胶制备 制备方法见附录E。 5.1.2 加样 将10µL PCR产物与2µL 6倍加样缓冲液混合均匀，加至琼脂糖凝胶样品孔中。同时设置标准DNA分子量对照。 5.1.3 电泳条件 以5 v/cm稳压电泳，直至溴酚蓝指示剂到达琼脂糖凝胶长度的2/3,3/4时停止。 5.2 结果判定 将电泳后的琼脂糖凝胶置于紫外检测仪上观察，与标准DNA分子量、阴性对照及GTPV、ORFV阳性对照比较，结果。用凝胶成像系统拍照保存。 试验成立条件:阴性对照无任何DNA扩增带或者在413 bp或者708 bp位置上未出现DNA扩增带，而GTPV阳性对照在413 bp位置出现DNA扩增带，并且ORFV阳性对照在708 bp位置上出现DNA扩增带。 若被检样品在413 bp位置出现DNA扩增带，判定为GTPV阳性，记为GTPV(+); 若被检样品在413 bp位置未出现DNA扩增带，判定为GTPV阴性，记为GTPV(-); 若被检样品在708 bp位置出现DNA扩增带，判定为ORFV阳性，记为ORFV(+); 若被检样品在708 bp位置未出现DNA扩增带，判定为ORFV阴性，记为ORFV(-)。 注:检测结果凝胶电泳图见附录F。 5 DB45/T XXXXX—2011 附 录 A (资料性附录) 试剂盒 病毒DNA提取试剂盒 A.1 试剂盒包含了提取病毒基因组DNA所必需的各种酶、抽提试剂、洗涤缓冲液和乙醇等试剂，可从商 业生物试剂公司购买。使用时按照试剂盒说明书的要求使用。 A.2 PCR试剂盒 试剂盒包含了PCR扩增所必需的各种酶、dNTPs、MgCl和PCR缓冲液等试剂，可从商业生物试剂公司2购买。使用时按照本规范的要求使用。 6 DB45/T XXXXX—2011 附 录 B (规范性附录) 溶液的配制 PBS(pH7.2)的制备 B.1 PBS(pH7.2)按下列配方进行配制: ——氯化钠: 8.0 g; ——氯化钾: 0.2 g; ——磷酸氢二钠: 1.44 g; ——磷酸二氢钾: 0.24 g; ——双蒸水: 定容至 1 000 mL; 7.2，加双蒸水定容至1 000mL，在800 mL双蒸水中溶解上述各种成份，用1 mol/L盐酸调节溶液的pH至 51.034×10 Pa高压灭菌25 min。室温保存。 B.2 20 mg/mL蛋白酶K的制备 20 mg/mL蛋白酶K按下列配方进行配制: ——蛋白酶K: 100 mg; ——灭菌双蒸水:定容至 5 mL; 称取100 mg蛋白酶K，溶于4 mL灭菌双蒸水，充分溶解后，加灭菌双蒸水定容至5 mL，用0.22μm 微孔滤膜过滤除菌，-20?保存备用。 B.3 75,乙醇的配制 75,乙醇按下列配方进行配制: ——无水乙醇: 750 mL; ——灭菌双蒸水:定容至 1 000 mL; 在750 mL无水乙醇中加入灭菌双蒸水定容至1 000 mL，-20?保存备用。 B.4 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)的配制 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0) 按下列配方进行配制: ——二水乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na?2HO): 186.1 g; 22 ——氢氧化钠: 20.0 g; ——双蒸水: 定容至 1 000 mL; 在800mL双蒸水中加入186.1g EDTA-Na?2HO，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，调节溶液pH值至 8.0，22 5 然后定容至1 000mL，分装后1.034×10Pa高压灭菌30min。室温保存。 B.5 1 mol/L Tris?CL (pH8.0)的配制 7 DB45/T XXXXX—2011 1 mol/L Tris?CL (pH8.0)按下列配方进行配制: ——Tris: 121.1 g; ——浓HCL: 42 mL; ——双蒸水: 定容至 1 000 mL; 在800 mL水中溶解121.1 g Tris，加热至68?助溶，待溶液冷却至室温后用浓HCl调节pH至8.0，加 5 双蒸水定容至1 000 mL，分装后1.034×10Pa高压灭菌30min。室温保存。 B.6 TE缓冲液(pH8.0) TE缓冲液(pH8.0)按下列配方进行配制: ——10 mmol/L mol/L Tris?CL (pH8.0); ——1 mmol/L EDTA(pH8.0); 在980 mL双蒸水中加入10 mL pH8.0的1 mol/L Tris?CL(配制方法见附录B.6)和2 mL pH8.0的 50.5mol/L EDTA(配制方法见附录B.5)，混合均匀，加双蒸水定容至1 000 mL，分装后1.034×10Pa高 压灭菌30min。室温保存。 B.7 10,SDS的配制 10,SDS的配制按下列配方进行: ——十二烷基硫酸钠(SDS): 100.0 g; ——双蒸水: 定容至 1 000 mL; 在900 mL双蒸水中溶解100.0g电泳级SDS，加热至68?助溶，用浓盐酸调节溶液的pH值至7.2，加双蒸水定容至1 000 mL，分装备用。室温保存。 B.8 凝胶加样缓冲液的配制 凝胶加样缓冲液按下列配方进行配制: ——蔗糖: 40.0 g; ——0.5 mol/L EDTA(pH 8.0):20 mL; ——10,SDS: 5 mL; ——溴酚蓝: 50.0 mg; ——双蒸水: 定容至 100 mL; 先将蔗糖完全溶解于双蒸水，然后按顺序加入其余各成份，待所有成份溶解混合均匀后，加双蒸水定容至100 mL，用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，4?保存。 B.9 10 mg/mL溴化乙锭的配制 10mg/mL溴化乙锭按下列方法进行配制: ——溴化乙锭(EB): 1.0 g; ——双蒸水: 100 mL; 在90 mL双蒸水中加入1.0 g溴化乙锭，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，加双蒸水定容至100 mL，然后用铝箔包裹容器或移至棕色瓶中，保存于室温。 注:溴化乙锭是强诱变剂并带有毒性，使用含有这种染料的溶液时应戴上手套，称量时要戴面罩。废弃溴化乙锭或8 DB45/T XXXXX—2011 含溴化乙锭的电泳液、凝胶等要集中回收处理，处理方法见附录D。也可使用其他商业化的非致癌性染料。 B.10 Tris-硼酸电泳缓冲液的配制 B.10.1 5倍Tris-硼酸电泳缓冲液的配制 5倍Tris-硼酸电泳缓冲液按下列配方进行配制: ——Tris: 54.0 g; ——硼酸: 27.5 g; ——0.5 mol/L EDTA(pH 8.0):20 mL; ——双蒸水: 定容至 1 000 mL B.10.2 1倍Tris-硼酸电泳缓冲液的配制 1倍Tris-硼酸电泳缓冲液按下列配方进行配制: ——5倍Tris-电泳硼酸缓冲液:100 mL; ——双蒸水: 400 mL 注:*所用试剂应为分析纯(AR)或优质纯(GR)。 9 DB45/T XXXXX—2011 附 录 C (资料性附录) 溴化乙锭溶液的净化处理注意事项 C.1 操作环境 由于山羊痘病毒为二级动物病原微生物，对其检测应当在符合要求的生物安全实验室中进行，且必须严格遵循有关生物安全操作标准。整个操作过程应在生物安全柜中进行，并使用一次性手套。 C.2 玻璃器皿的准备 5 玻璃器皿常规洗净后，用灭菌双蒸水漂洗几次。1.034×10Pa高压灭菌30min后，再用50?烘烤 4h以上或 100?干烤15min。 C.3 一次性耗材的准备 5离心管、PCR反应管、加样吸头应使用一次性塑料制品，使用前经1.034×10 Pa高压灭菌30 min。 C.4 疑似山羊痘感染材料的处理 5 检测过程中的器皿和废弃物，应收集后经1.034×10 Pa高压灭菌30 min。 10 DB45/T XXXXX—2011 附 录 D (规范性附录) 溴化乙锭溶液的净化处理 D.1 浓度大于0.5mg/mL的溴化乙锭溶液的净化处理 加入足量的水使溴化乙锭溶液降低至0.5 mg/mL以下，在此溶液中加入0.2倍体积新配制的5,次磷 酸和0.12倍体积新配制的0.5 mol/L亚硝酸钠，调节该溶液的pH至3.0以下，小心混匀。在室温作用24h， 加入5倍量的1mol/L 碳酸氢钠溶液，混合均匀，倒去溶液。 含有0.5µg/mL溴化乙锭电泳缓冲液的净化处理 D.2 每1000mL溶液中加入100 mg粉状活性炭，在室温作用1h，不时摇动，用滤纸过滤溶液，丢弃溶 液，另用塑料袋封装滤纸和活性炭焚化处理。 11 DB45/T XXXXX—2011 附 录 E (规范性附录) 1,琼脂糖凝胶的制备 制胶板的准备 E.1 将凝胶托架水平放置在工作台上，放上梳子，使梳齿下沿距离托架底板0.5mm,1.0mm。 E.2 1,琼脂糖凝胶的制备 称取1.0g琼脂糖于三角烧瓶中，加入100 mL 1倍Tris-硼酸电泳缓冲液，加热溶解琼脂糖，待琼脂 糖溶液冷却至约50?时，加入10mg/mL溴化乙锭溶液5µL，使其终浓度为0.5µg/mL，充分混合，避免起 泡。倒入凝胶托架，把凝胶厚度控制在3mm,5mm之间。将凝胶连同托架一起放入电泳槽中，加入 硼酸电泳缓冲液，使之没过凝胶表面约2mm，轻轻拔出梳子，以备加样电泳。 1倍Tris- 注:如使用商业化的非致癌性染料则根据其说明书进行制备。 12 DB45/T XXXXX—2011 附 录 F (规范性附录) 检测结果凝胶电泳图示 F.1 检测结果凝胶电泳图见图F.1。 1、标准DNA分子量(DL 2000 bp ladder DNA marker); 2、阳性对照(，); 3、阴性对照(—); 4、从病猪肺脏分离到的菌株(，); 5、病猪肺脏组织(，); 6、病猪心脏组织(，); 7、病猪脑组织(，); “，”表示检测结果为阳性;“—”表示检测结果为阴性。 图F.1 HPSPCR检测结果琼脂糖凝胶电泳图 _________________________________ 13