【doc】激光辐射奶牛冷冻精液对精子诱变效应的研究

【doc】激光辐射奶牛冷冻精液对精子诱变效应的研究 激光辐射奶牛冷冻精液对精子诱变效应的 研究 >,一-7;7,7 第4卷第4期 1995年12月 激光生物学 LASERB1oLoGY VOJ.4NO.4 Dec.1995 激光辐射奶牛冷冻精液 对精子诱变效应的研究 芝童墨苎58上?岁,7L (内蒙古农牧学院动物科学系.砰和浩特.010018)f,,,2 二=)l二7 摘要为了探索激光辐射精子的诱变效应,本试验采用TST(TripleStainTechnique,即精子 三重染色法),SPA(SpermPenetraifionAssay,即精子穿透法)和CAS(ChromosomalAneu- ploidyinSpermatozoa,即精子单倍染色体制备技术)三项有关精子的现代分析技术,对激光辐射精 子的受精学,遗传学效应进行了研究.结果表明:He—Ne激光辐射奶牛冷冻精液,可提高精子存活 率,促进精子悻外获能,发生顶体反应和穿透卵黄膜;具有明显加速雄性原核形成和诱导精子染色 体发生畸变的作用.在本试验条件下,经多次预试验确定的辐射时间中,各指标综合效应最佳剂量 组为4分组.该组精子顶悻反应率,活精子耱能率,卵黄膜穿透率,音原棱卵子百丹 率和染色体畸 变率比对照组分别增加了9.45 【P<o.01),6.89(P<0.01),12.47(P>0.05),17.64(P< 0.05)和46.03%(P<0.05). 关键词苎塑塾l堡堡蔓!竺!竺塑?染色悻畸变斗,,'.穆 EFFECTSoFHe—NeLASERtRRADIA?ONoN HoLSTEINBULLSSI,ERMAToZoAIN—VITRo FERTILIZATIONANDCHRoMoSoMALABNoRMALITIES nJinquan,Gd0Af.in (DepartmentofAnimalScience,InnerMongolia (CollegeofAgricultureandAnimalHusbandry,Huhehaote,010018) AbstractInordertostudytheeffeCtSofHe——NeLaserIrradiationonHolsteinbullssperm fertilizalogyandgenetics,frozensemensamplesfiveHolsteinbullsweretestedbyusingTST (TriplestainTechnique),SPA(SpermPenetrationAssay),CAS(ChromosomalAneuploidy inSpermatozoa).0urresultsindicatedthatHe—NeLaserIrradiationisabletOincreasethe rateofsurvivalspermatozoa,andtopromotespermatozoain—vitr0capaciation,acrosomere — action,percentageofvltellipenetrated,espesiallythedevelopmentofmalepronucleiandIre— quencyofspermatozoachromosomalabnormalities.Therateoftrueacrosomereaction,sur— viralspermatozoacapaeiation,vitelliwithmaiepronucleiandspermatozoachromosomalab— normalitiesof4minutesgrouphaveincreasedby9.45,6.89,12.47,17.64and46. O30rthecontDoIgrouprespectively. -收盍哲蟊皇曼季I2基盒资助 734激光生物学第4卷 KeyWordsLaserIrradiation;Frozensemen;In--vitrofertilization;Chromosomalabhor- mallties 0引言? 激光辐射家畜精液,以探索诱变育种可能性的研究已有过很多报道,研究对象有猪…,绵 羊,山羊【,奶牛,家兔.,作者分别对激光辐射精液的精子活力,精子形态,精子内 外酶活性,精子代谢,体外受精过程等生物学效应进行了研究,得到了一些有益的结论.本文在 前人研究的基础上,取材于奶牛繁殖中普遍采用的冷冻精液,并以汀染色,SPA试验及 CAS技术为测定指标,对激光辐射精子的体外受精过程和染色体畸变率进行了研究.不仅证 明,激光可促进精子体外受精过程,加速雄原核形成,并首次得出了激光可诱导精子单倍染色 体发生畸变的结论,将激光辐射家畜离体精液的研究向前推进了一步. 1材料和 1.1精液来源与控查 本试验所用冷冻精液为内蒙古自治区家畜改良站5头荷斯坦牛的混合冻精.用特定培养 液"37?快速解冻后混合均匀,经检查活力在0.35以上者用于试验. 1.2精液的分组与处理 将混匀的5ml(5粒)冻精,分装于5只直径为14ram的无毒塑料管中,按表1所确定时间 进行激光辐射(散焦直接照射于精液上面),液面距扩束镜高度为13.0em. 表1试样分组及照射剂量一 照射结束后,放回37?水浴锅中并每管中再加入lml特定培养液,待试. 1.3精子获能测定 本试验对孵育(37X2恒温水浴)O.5小时的样本作体外获能(380毫渗量/公斤,高渗获能) 后的TSTIts,3染色,每个样本制片两张,在1000倍油镜下观察2×100个精子,分别 记录获能活 精子(真顶体反应精子),获能死精子(假顶体反应精子),未获能活精子和未获能死精子四顶指 标,并计算其百分率. 1.4精子穿透卵黄膜试验 将体外获能的精液浓度调至IOX10'/ml左右,用于SPA试验,授精处理6小时后,吸 出卵子压片,在相差显微镜下检查并记录如下指标:' (1)表面附着精子,而未被穿透的卵子数; 第4期李金泉等:激光辐射奶牛冷冻精液对精子诱变效应的研究735 (2)被穿透而未形成原核的卵子数; (3)具有雄性原核的卵子数. 并分别计算下列参数: a.与精子作用卵子(包括以上三种卵子总和)占总卵子数的百分率; b.含原核的卵子占总子数的百分率; c.被精子穿透的卵子(包括具原核的卵子)占总卵子效的百分率. 1.5精子单倍染色体畸变率测定 将培养15—18小时的受精卵培养液加入乙酰甲基秋水仙碱(Colcemid)0.5pg/ml,5 小 时后取出受精卵放入双蒸馏水中低渗处理10分钟左右,在双筒解剖镜下仔细观察,待发现受 精卵极度膨胀,胞膜欲破时,迅速将受精卵吸至干净的载玻片上(一般每张片受精卵数目为1O 个左右),然后用滴管吸取甲醇一冰醋酸(3t1)溶液,在距载玻片约lO一20cm高处垂直滴下, 直至受精卵胀破和染色体完全铺展开来. 标本干燥后,用5Giemsa溶液染色.每个试验组观察200个滴片成功的受精卵,分别记 录其中正常和带有染色体畸变的受精卵数.差异显着性测定按Kastenbaum法计算E"]. 3结果与讨论 3.1激光辐射对体外获能后顶体反应的影响 对激光辐照孵育0.5小时的精子,经体外获能处理后,TsT染色观察结果见表2. 表2激光辐射对精子项体反应的影响() 9次重复试验的台计 本测定结果表明,激光辐照奶牛冷冻精液,经高渗获能处理,试验组获能活精子率均高于 对照组,其中2分,4分组显着高于对照组(P<O.05).这说明适当剂量激光辐射,不会造成精 子获能障碍,而且具有促进精子体外获能,提高真顶体反应率的作用,该指标在所测四种精子 中所占比例为最高,它又是唯一可以使卵子受精的精子,所以,这对改善精子的受精能力将起 到有益的作用.. 对精子总顶体反应率,活精子获能率和存活率分别统计结果见表3.由表可以看出,总顶 体反应率,活精子获能率,试验组均高于对照组,其中总顶体反应率,2分,4分,8分组与对照 组差异极显着(P<O.01).除16分组外,其它各组对精子存活率均有改善作用. 激光可使细胞膜去极化,改变膜的通透性,是产生以上结果的基础.哺乳类动物精子的顶 体反应,依赖于细胞外ca一的存在,改变ca"通透性是引起顶体反应的早期过程激光对膜 通透性的改变,必然会对此产生影响.而且,激光可激活顶体内和精清中顶体酶类的活性,都 736激光生物学第4卷 会对顶体反应产生促进作用,因为顶体反应正是酶原被激活,顶体基质膨胀,破裂,基质内容物 被释出的过程. 表3激光对总顶体反应率,活精子获能率及存活率的影响 (m盯)(梅)()()() *8次重复试验的合计 经授精处理6小时后,SPA试验各参数结果见表4.与精子作用数所占百分比和被穿透卵 子所占百分比两项指标在试验中均呈现较大的变异程度,规律不明显,方差分析差异不显着 (P>O.05),而含原核卵子所占百分数该项指标重复试验结果比较稳定,2分组和4分组均显 着地高于对照组和16分组(P<O.05).明显地表现出了激光辐射对形成雄性原核的促进作 用,这与在家兔精子所做的试验结果是一致的.这对适当剂量的激光辐射促进生命活动的 说法也是一个证明.有试验者认为,激光刺激后再行受精的卵子,其内部发生的两性原核的形 成,结合,遗传物质的转录等生理功能均得到了催化,这是由于吸收了激光能量,使成套具有分 化机能的蛋白质产生光解效应,激活并活化了胚胎的基态分子.该试验也同样表明了激光 刺激加速了雄原核的形成,但对于能否穿透卵黄膜,引起受精卵子数目增加,没有明显的作用. 3.3激光辐射与精子染色体畸变率 激光辐射精子单倍染色体培养结果见表5. 实验结果表明,激光辐射牛冷冻精液,可引起染色体畸变增加,而且精子单倍染色体畸变 率随照射剂量的堠加而增高,2分组和4分组显着地高于对照组(P<O.05),8分组 和16分组 扳显着地高于对照组(P<001).有试验证实氮分子激光可引起作物,小家鼠和人类 生殖细胞染色体畸变,本次研究首次得到了激光直接照射哺乳动物精液,能引起精子染色体畸 变的试验结果.产生这种结果的原因可能是激光的发射光谱与DNA吸收光谱相接近时,为 DNA分子所吸收,这种光化反应过程会造成细胞的遗传损伤.另外,激光电磁波的直接作用, 同样可引起DNA分子中氢键的断裂,以致在形成原核时产生染色体畸变. ? 1 2 一 , l 第4期李金泉等:激光辐射奶牛冷冻精液对精子诱变效应的研究737 *5次重复试验合计 各种哺乳动物对电离辐射的效应在剂量上有差异,即使是生殖细胞,其发育的不同阶段, 对诱变固子的敏感性也不相同,而其中精子遗传物质的改变尤其具有意义,因为它有着直接的 遗传学效果会影响后代.染色体产生结构的变化,不仅造成染色体畸变率的增加,也会有一部 分可能在后代中表现为遗传危害,而同时也存在着产生有益遗传变异的可能性,在植物,低等 动物和微生物诱变育种中所取得的成就即是很好的例证. 4结论 He—Ne激光辐射奶牛冷冻精液,可提高精子存活率,促进精子体外获能,发生顶体反应 和穿透卵黄膜.具有明显加速雄性原核形成和诱导精子染色体畸变的作用.经反复预试验认 为,本试验条件下,各指标综合效应最佳剂量为4分组,精子顶体反应率,活精子获能率,卵黄 膜穿透率,含原核卵子百分率和染色体畸变率比对照组分别增加9.45(P<0.01),6.89(P <O.01),12.47(P>O.05),17.64(P<0.05)和46.03螺(P<0.05).一 本文只对激光辐照奶牛冷冻精液的异种精卵体外受精及精子单倍染色体畸变进行了初步 研究,激光辐射能否对实际受精能力和诱变产生有益的性状尚待进一步深入探讨. 致谢本文试验过程中.受到了内蒙古家畜改良站乌兰巴特尔高级畜牧师,顾铁光高级畜牧师,内蒙古电 力学院李雨润讲师等的大力支持.在此深表谢意! 参考文献 1IlinaTA.AnimalBreedingAbst.,1977-48(5):277. 2朱九明.应用激光,19g9f9(2):77. 3朱九明.中国激光,1988{15(6):382. 4岳丈斌.应用礅光,198949(4):181. 5岳文斌.激光杂志,1989410(6):259. 6岳丈斌.中国礅光.[99Gl17(10)637.. 7安玉君.中国激光.1988;15(2):127. 8谈眷季等.应用激光,1988f8(5):229. 9张垒有.内蒙古农牧学院研究生毕业论文摘要汇编([981--198fi届),1986-(1):84. 10李金泉,应用激光+l989F9(3){132. 11李金泉.中国养兔杂志.1990-98(i){25. 12李金泉.中国激光,1930~17(9)}572. 13Benjamlneta1.BiologyofReproduction.1975f12{260. 14Didion.BAeta1.J.Ahim.Sc1.,l986462:1029.(下转摹759万) 第4期吴集斌:关于连鬓胡子遗传方式的探讨759 一——0 口T0.To司_--T. ']O占_f一一口0?口00口00一由00一o 3讨论 从前表和前面的系谱可以看出,连鬓胡子家系有如下特点t 1)一部分连鬓胡子个体的父亲有连鬓胡子; 2)有一部分连鬓胡子个体的父亲无连鬓胡子; 3)还有一部分连鬓胡子个傩(其女婿无连鬓胡子)的外孙儿有连鬓胡子; 4)在有连鬓胡子个体的成年儿子中有连鬓胡子的占嚣,即约占吉,(嚣与吉无显着性差 别,P>O.5),父亲无连鬓胡子的家系,儿子有连鬓胡子的在成年兄弟中占4O, 也约占I(4O与 ?无显着性差别,P>O.3),因母亲是连鬓胡子携带者,如未生下连鬓胡子的儿子,则这样的家' 1 系无法调查统计,所以连鬓胡子在兄弟中占的比倒可略高于?. 5)连鬓胡子是男性才可能的性状,且是较少有的性状,连鬓胡子一般为杂合体. 从连鬓胡子系谱上述特点中可以看出:父亲把连鬓胡子基因传给儿子则表现,传给女儿不 表现,女性也可把连鬓胡子基因传给儿子(则表现)和女儿.这些特点符合限遗传的特点,连 鬓胡子上述特点中的第l点,第4点也符合c.斯特恩描述的常染色体显性性状的特点".所 以可以认为连鬓胡子是常染色体上显性基因控制的限性遗传性状. 参考文献 l周德华主编,医学遗传学.长沙:毒i南科技出版杜,1993I55, 2C.斯特恩.人类遗传学原理(吴昱译).北京:科技出版社,197gI93. (上接第737页) 15Boas~tuetD.etal_The~,ogeno|ogy,1982ll7(2);l99 l6,KastenbaumMA.eta1.Mutation,Res.,1970f9(5)t527. 17敖秀珠等.中国激光t1987F14(2):116— 18南开大学生物系遗传专业激光育种组,遗传与育种,1977I(6):23 l9粱宏等.遗传,l980I2(2):27. 2Q黄天花.遗传与疾病,1985;2(4),251.