血清谷丙转氨酶活力测定.doc

血清谷丙转氨酶活力测定.doc 血清谷丙转氨酶活力测定 目的和要求 了解转氨酶的性质及临床意义。掌握用测定试剂盒测定谷丙转氨酶(GPT或ALT)活力。 原理 在氨基酸分解代谢中，联合脱氨基作用是大多数氨基酸的主要代谢方式，通过转氨基作用与谷氨酸氧化脱氨基作用偶联而完成。此过程可用下式表示: 本实验以丙氨酸的氧化脱氨为例，测定谷丙转氨酶活性。 在谷丙转氨酶的催化下，丙氨酸和α–酮戊二酸作用生成丙酮酸和谷氨酸。此反应可逆，平衡点近于1。无论正向或逆向反应皆可用于测定此酶的活性，既可测定所产生的氨基酸，也可测定生成的α–酮酸，因此可有多种测定方法。 本实验以丙氨酸及α–酮戊二酸作为谷丙转氨酶(GPT或ALT)作用的底物，利用内源性磷酸吡哆醛作辅酶，在一定条件及时间作用后测定所生成的丙酮酸的量来确定其酶活力。丙酮酸能与2，4二硝基苯肼结合，生成丙酮酸–2，4–二硝基苯腙，后者在碱性溶液中呈现棕色，其吸收光谱的峰为439,530nm，可用于测定丙酮酸含量。 α–酮戊二酸也能与2，4二硝基苯肼结合，生成相应的苯腙，但后者在碱性溶液中吸收光谱与丙酮酸二硝基苯稍有差别，在520nm波长比色时，α–酮戊二酸二硝基苯腙的吸光度远较丙酮酸二硝基苯腙为低(约相差3倍)。经转氨酶作用后，α–酮戊二酸减少而丙酮酸增加，因此在波长520nm处吸光度增加的程度与反应体系中丙酮酸与α–酮戊二酸的摩尔比基本上呈线性关系，故可以籍以测定谷丙转氨酶的活力。 但是，由于在实验中不宜有过多的α–酮戊二酸以降低其对显色的干扰，因此，对于作为底物的α–酮戊二酸浓度作了一定的限制，从而不能保证酶反应充分进行，以致丙酮酸产量与酶之间的关系并不始终成一直线关系。当酶量增大时，曲线斜率减小。因此在测定时，如酶活力较大(大于100单位)，应将样品稀释后再进行测定。 另外，2，4二硝基苯肼对此显色反应也有一定的干扰，因此，在制作丙酮酸标准曲线时，虽没有加α–酮戊二酸，但是丙酮酸二硝基苯腙的吸光度与丙酮酸含量之间的关系也并不始终呈一直线关系，丙酮酸含量增大时，曲线斜率降低，因此，必须采用标准曲线中呈现出直线关系的部分来测定丙酮酸的生成量。 试剂和器材 一、试剂 1. 谷丙转氨酶基质液(pH7.4):100ml×1瓶。 2. 2，4–二硝基苯肼液:100 ml×1瓶。 3.4mol/LnaOH:100ml×1，用时加蒸馏水至1 000ml。 4. 2μmol/L丙酮酸钠标准液1支。 5. 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.1)一瓶。 二、器材 1. 试管1.5cm×15cm(×10).。 2. 移液器。 3. 恒温水浴锅。 4.722型分光光度计。 操作步骤 1.取试管6支，按下表进行操作。 0 1 2 3 4 5 管号 试剂 0.10.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.1mol/L磷酸缓冲液/ml 0 0.0 0.05 0.10 0.15 0.25 2μmol/L丙酮酸标准液/ml 0.20.50 0.45 0.40 0.35 0.25 基质缓冲液/ml 0 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 2，4—二硝基苯肼液/ml 0.3 0 28 57 97 200 相当于酶活力卡门氏单位 0 0.5 0 15 0 混匀后，37?水浴20min 0.4mol/LnaOH/ml 5 5 5 5 5 5 室温放置10min，在505nm比色，以蒸馏水调零，测各管吸光度。以各管吸光度减去零管吸光度，所得差值为纵坐标，相应的卡门氏单位为横坐标，作标准曲线图。 另取2支试管，按下表进行操作。 测定管 对照管 0.1 血清/ml 0.5 0.5 基质液/ml，37?预温5min 混匀后，37?水浴30min 0.5 0.5 2，4‐二硝基苯肼液/ml 0.1 血清/ml 混匀后，37?水浴20min 0.4mol/LNaOH 5 5 室温放置10min,在505nm比色，以蒸馏水调零，测各管吸光度。以各管吸光度减去零管吸光度之差值，查标准曲线，求得相应的GPT活力单位。