MS法同时测定水产品中氯霉素、氟甲砜霉素及甲砜霉素残留量

MS法同时测定水产品中氯霉素、氟甲砜霉素及甲砜霉素残留量 MS法同时测定水产品中氯霉素、氟甲砜霉 素及甲砜霉素残留量 第28卷第5期 2007年10月 海洋水产研究 MARINEFISHERIESRESEARCH Vo1.28,NO.5 Oct.,2007 GC/MS法同时测定水产品中氯霉素,氟甲砜霉素 及甲砜霉素残留量 冷凯良孙伟红王志杰王建华邢丽红. (中国水产科学研究院黄海水产研究所,青岛266071) (山东省出入境检验检疫局,青岛266002) (.中国海洋大学,青岛266003) 摘要建立了气相色谱一负离子化学电离源质谱同时测定水产品中氯霉素(CAP),氟甲砜霉素 (FF)和甲砜霉素(TAP)残留量的.通过优化色谱条件,实现了氯霉素,甲砜霉素及氟甲砜霉素 三甲基硅(TMS)衍生物的良好分离,检测模式采用选择离子检测(sIM),监测离子为:氯霉素(m/z 376,378,466,468),氟甲砜霉素(m/z339,341,429,431)及甲砜霉素(m/z409,4l1,499,501),分别 选择466,339,409作为定量离子.方法建立的基质添加曲线,有效地消除了基体效应的影响,其 衍生物的峰面积与其浓度在CAP为2.0,200.0ng/ml,FF和TAP在5.0,200.0ng/ml时呈良好 线形关系,线性相关系数均大于0.998.基质加标实验表明,方法的准确度和精密度 满足水产品中药 残检测的要求.CAP的测定低限为0.3/,g/kg,FF和TAP的测定低限为1.0/,g/kg. 关键词气相色谱一质谱氯霉素氟甲砜霉素甲砜霉素水产品 中图分类号TS254.7文献识别码A文章编号1000—7075(2007)05—0095—05 Simultaneousdeterminationofchloramphenicol,florfenicoland thiamphenicolresiduesinaquaticproductswithgas chromatography/massspectrometry LENGKai—liangSUNWei—hongWANGZhi—jie WANGJian—huaXINGLi—hong. (YellowSeaFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Qingdao266071) (ShandongEntryExitInspectionandQuarantineBureau,Qingdao266002) (.OceanUniversityofChina,Qingdao266003) ABSTRACTAmethodusedforsimultaneous fenicol(FF)andthiamphenicol(TAP)residues determinationofchloramphenicol(CAP),flor— inaquaticproductswasdevelopedbyusinggas chromatogramphy/massspectrometry(GC/MS)withchemicalionizationsourceinnegative mode.TMSderivativesofCAP,FFandTAPwereseparatedthroughoptimizingspectrometric conditions.Theselectedionmonitoringmode(SIM)wasadoptedasexaminationmode,with monitoringionatm/z376,378,466and468forCAP,atm/z339,341,429and431forFF, atm/z409,411,499and501forTAP,andthequantitativeionsbeing466,339and409,re一 农业部标准项目(2006—64—160)资助 收稿日期:2006—12-28;接受日期:2007—03—16 作者简介;冷凯良(1966一),男,高工,主要从事水产品质量检测研 究.E-mail:lengkl@ysfri.ac.cn,Tel:(0532)85836348 海洋水产研究第28卷 spectively.Thestandardcurveofspikedmatrixcouldeliminateavailablytheeffectofsample. Thereexistedagoodlinearcorrelationbetweenthepeakareasandconcentrationsofthederiva— tiveswhenCAPwasintherangeof2.0~200ng/ml,andFFandTAPwereintherangeof5.0 , 200.0ng/ml,withallcorrelationcoefficients>0.998.Theresultsofspikedsampletest showedthatthemethodwasapplicablefordetectingtheresiduesinaquaticproductsaccurately andprecisely.Thelimitsofquantification(LQ)were0.3~g/kgforCAPand1.0>g/kgforFF andTAP. KEYWORDSGaschromatography/massspectrometry(GC/MS)Chloramphenicol FlorfenicolThiamphenicolAquaticproducts 氯霉素(Chloramphenicol,CAP),甲砜霉素(Thiamphenicol,TAP)和氟甲砜霉素 (Florfenicol,FF)同属 于氯霉素类药物,甲砜霉素和氟甲砜霉素结构与氯霉素类似,药理活性也类似,都 具有广谱抗菌能力.氯霉素 因对人体具有严重毒副作用而被禁止在食用动物源产品上使用,而甲砜霉素和氟 甲砜霉素作为氯霉素的替代 药物,毒性较氯霉素小,但对消费者的危害也逐渐被人们发现.目前,大多数国家对 食品中氯霉素类药物的最 高残留限量做了规定,如欧盟规定氯霉素不得检出,检出限为0.3~g/kg甲砜霉素为 50~g/kg,有鳍鱼类氟甲 砜霉素为1000~g/kg.氯霉素类药物在食品中的残留问题不仅关系到人类健康,对 国际食品贸易也有着巨大 影响.因而,对水产品中氯霉素类药物残留量的检测有较大现实意义.国内外文献 中关于氯霉素类药物在水 产品中的单残留检测方法的报道较多(赵文亚等2003,洪振涛等2006,黄冬梅等 2006,Roberteta1. 1994,Chueeta1.2002),但利用GC—MS同时测定氯霉素类药物多残留检测方法的报道不多(李鹏等 2006,贺利民等2006),特别是水产品中的氯霉素类药物多残留的报道更少(Nagataeta1.1996).本 文建立了用配有负离子化学电离源的GC/MS同时测定水产品中3种氯霉素类药物的多残留检测方法,方法 ,完全可以满足水产品安全检测的需要. 灵敏,可靠 1材料与方法 1.1主要仪器与试剂 AgilentGC6890/MS5975气相色谱/质谱联用仪;无水硫酸钠柱(5g,5m1);衍生化试剂:N,O一双(三甲基 硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA):三甲基氯硅烷(TMCS)(99:1);CAP,FF及TAP标准品(Sigma);乙酸乙酯, 甲醇,甲苯等试剂均为优级纯. 1.2样品处理 鱼,去鳞,去皮,沿脊背取肌肉;虾,去头,去壳,去附肢,取可食肌肉部分;贝类,去壳,取可食部分;蟹,甲鱼 等,取可食肌肉部分.样品切为不大于0.5cm×0.5cm×0.5cm的小块后均质混匀,密封,标明标记,并将试 样于一18?以下冷冻保存. 将样品解冻,称取样品5g,加2Oml乙酸乙酯均质1min,超声30min,3000r/min离心5min,上清液于 4O?水浴中减压旋转蒸发至干.残渣用1ml甲醇溶解,再加入15ml正己烷和25ml4氯化钠溶液,盖塞振 荡混合1min,3000r/min离心2min,除去上层正己烷相,再用1Oml正己烷重复提取一遍.水相中加入15 ml乙酸乙酯,旋涡混合2min,3000r/min离心3min,吸取乙酸乙酯层,经无水硫酸钠柱脱水过滤,用少量乙 酸乙酯淋洗,吹干.加入2ml乙酸乙酯溶解提取物并转移到具塞离心管中,用1ml乙 酸乙酯洗涤鸡心瓶,合 并乙酸乙酯,于50455?的砂浴中吹氮蒸发至近干,再用1ml乙酸乙酯洗涤离心管壁并吹干,待衍生化. 将吹干的提取物置于8O?烘箱中,干燥20min(干燥对衍生化反应非常重要),取出放冷,加入100l衍 生化试剂,旋涡混合,在7O?烘箱中反应30min.加入0.5ml甲苯,再加100l水,旋涡混匀,静置10min, 第5期冷凯良等:GC/MS法同时测定水产品中氯霉素,氟甲砜霉素及甲砜霉素残留量97 4000r/min离心5min,取上层有机相进行气相色谱一质谱分析. 1.3基质标准工作液的衍生化 选择不含被测物的水产品样品,按1.2方法处理,制成空白样品提取物,加入适量标准工作液,在温度50 , 55?的砂浴中,用氮气吹除溶剂至干,进行衍生化. 1.4样品测定 色谱条件:DB一5ms(30m×0.25mm×0.25tam)石英毛细管柱,载气为氦气,纯度?99.999,流量1.0 ml/min,无分流方式进样,进样量:1l.进样口温度260.C,接口温度:280?,柱温:初始柱温150?,保持1 min,15?/min升至260?,保持8min,然后以30?/min升至280?,保持8rain.质谱条件:负化学源,离 子源温度:150?,反应气:甲烷,纯度?99.99,反应气流量:2ml/min. 2结果与讨论 2.1样品预处理 2.1.1样品提取剂的选择 氯霉素类药物可以用甲醇,乙腈,丙酮,乙酸乙酯等有机溶剂提取,试验中选择了乙腈,丙酮,乙酸乙酯3种 溶剂作为提取剂分别进行测定.结果表明,乙腈,丙酮在蒸干时容易冒泡,蒸干时间长,而乙酸乙酯作为提取剂 提取率高,毒性小,而且容易蒸干,回收率稳定.因而,本方法选择了乙酸乙酯作为提取剂. 2.1.2净化条件的优化 由于采用乙酸乙酯作为提取溶剂,有大量脂质及类脂物质同时被提取出来,必须进行脱脂处理.正已烷是 常见的脱脂溶剂,本研究采用正己烷与4NaC1溶液之间进行液一液分配去除脂质及类脂质. 去脂后,采用乙酸乙酯反提取,提取液要经过无水硫酸钠柱脱水过滤于50ml梨形瓶中,无水硫酸钠的作 用是脱除乙酸乙酯提取液中的水分,有利于下一步的样品浓缩及衍生化. 2.1.3衍生化条件的优化 GC/MS测定CAP,TAP,FF需要对检测样品进行衍生化,利用硅烷化试剂将CAP,TAP,FF的羟基硅烷 化衍生成易挥发热稳定的物质.由于衍生化试剂遇水易分解,因此干燥对于衍生化非常重要.本实验中先将 吹干的残留物在80?烘箱中干燥20min,然后再将其置于70?烘箱中加热30rain,实验结果表明,衍生化效 率提高,说明去除水分有利于衍生化反应的进行. 此外本实验中衍生化后加100l水灭活,以终止在进样时衍生化试剂与分析物在进样口的进一步衍生反 应,保证了测定结果的稳定,同时也净化了反应液,有利于色谱峰的分离. 2.1.4定容试剂的选择 本实验比较了分别采用正己烷,甲苯定容对测定结果的影响.结果表明,采用甲苯定容可使cAP,FF, TAP的色谱响应增大,选择高沸点的甲苯对实验重复性好,而且放置一段时间重新进样,测定结果比正己烷稳 定.因此本实验采用衍生化结束后直接加水,甲苯离心后取上清液进样的定容方 式. 2.1.5基质标准工作液的衍生化 基质对样品测定影响较大,实验表明,分析体系中即使微小的活性点对药物的吸附也会严重影响被测物的 响应信号,用标准溶液直接衍生进样绘制标准曲线线性较差,特别是氟甲砜霉素,采用不加空白基质的加标样 品,回收率会超过120.选择不含被测物的水产品样品,按本方法提取和净化,制成空白样品提取物,加入适 量标准工作液,在温度50,55?的砂浴中,用氮气吹除溶剂至干.以下按试样衍生化的操作.该方法采 用基质添加标准溶液建立的标准曲线,有效地消除了分析体系中衬管和色谱柱对药物的吸附,同时也减小了基 体效应对被测物的影响,避免了基质的干扰. 98海洋水产研究第28卷 2.2色谱条件选择 采用气相色谱法测定CAP,FF,TAP,样品基 质会带来许多干扰因素影响色谱测定.为了使标 样峰与试剂及其他干扰因素峰完全分开,需使用程 序升温.经过试验,最终确定升温程序为:初始柱 温150?,保持lmin,15?/min升至260oC,保持 8min,然后以30oC/min升至280oC,保持8min; 实现良好分离,保持出峰时基线稳定,而且峰窄,峰 形好,提高了灵敏度. 参考有关氯霉素类检测文献(赵文亚等 2003;贺利民等2006;NagataP,a1.1996),经 过多次试验,最终确定检测质谱条件为:接口温度: 280oC;负化学源:离子源温度150?;反应气:甲 烷,纯度?99.99;反应气流量:2ml/min. 以上实验条件得到的总离子流见图1,对应 的质谱见图2. 2.3选择离子的确定 氯霉素类药物分子中含有电负性较强的卤素 原子,采用电子轰击离子源,检测限不能满足法规 要求;采用负离子化学电离源检测时灵敏度高,样 品基质干扰小,得到的色谱峰形状良好.方法采 用的离子源温度为150?,四极杆温度106?,温 度较低,得到的质谱图特征明显,分子离子和碎片 离子的丰度都很大,有利于进行质谱确证和定量. 实验中首先采用高浓度的CAP,FF,TAP混 合标准硅烷化衍生溶液进样,进行全扫描分析,每 个被测药物检测4个特征离子的强度,确定它们 的特征离子分别是CAP:m/z376,378,466,468; FF:m/z339,341,429,431;TAP:m/z409,411, 499,501.实验分别选取丰度最强的特征离子作 为3种被测物的定量离子,结果证明,用CAP的 分子离子m/z466的数据绘制标准曲线效果良 好,而FF的基峰m/z339定量离子效果优于分 子离子m/z429,TAP的基峰m/z409作为定量 效果优于分子离子m/z499.因此这3种药物分 别选择466,339,409作为定量离子. Abundance 9000 8000 7OOO 6000 5000 4000 3OOO 2OOO 1OOO Time... CAP 10.0012.0014.O016.OO18.0020.OO22.00 图1氯霉素,氟甲砜霉素,甲砜霉素标准品衍生物总离子流 Fig.1TotalionchromatogramofCAP,FFandTAPderivatives Abundan 2 2 2 l l l 1 l m/ Abundance 16O0 1500 { }688 388 700 6们 500 ?882o0 100 0 m/-??- Abundance 2.4线性范围 选择不含被测物的鳕鱼样品6份,按测定方法提取和净化后,制成空白样品的提取液,分别加入适量标准 液使最终定容溶液中CAP,FF,TAP的浓度为:2.0,5.0,10,50,100和200ng/ml.经硅烷化后,进样测定,以 被测物浓度为横坐标,色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线.该方法建立的基质添加标准曲线,有效地消除了基 第5期冷凯良等:GC/MS法同时测定水产品中氯霉素,氟甲砜霉素及甲砜霉素残留量99 体效应对被测物的影响,CAP衍生物的峰面积与其浓度在2.0,200.0ng/ml范围内呈良好的线形关系,FF 和TAP在5.0~200.0ng/ml范围内均呈良好线形关系,3种药物的相关系数均大于0.998. 2.5方法回收率和检出限 本方法以阴性的鳕鱼为测定样品,采用标准添加法分别进行加标回收率和精密度实验,考察方法的准确度 和重现性.室内回收率试验选择3个不同水平,采用在5g样品中分别添加相当于1.0,5.0,10~g/kg水平的 CAP,FF,TAP标准液,CAP灵敏度较高,增加0.3~g/kg添加水平.加标后,放置30min,使标样充分渗透, CAP,FF,TAP的检测结果见表1. 表1鳕鱼添加CAP,FF及TAP回收率实验("一6) TablelRecoveriesofCAP,FFandTAPfromspikedling("一6) 实验结果表明,方法中CAP在0.3,1.0,5.0,10~g/kg添加水平的平均回收率在81.67,95.089/6之 间,相对标准偏差?10.88;FF和TAP在l_0,5.0,10>g/kg添加水平的平均回收率在82.17,94.40% 之间,相对标准偏差?9.35;结果重复性好,添加回收率高,方法的准确度和精密度可以满足药残检测的要求. 测定检出限是采用添加法进行实测的情况确定的.CAP在阴性鳕鱼样品中添加水平为0.3>g/kg时,本 方法可定量检出,信噪比?5,由此可以确定本方法CAP的测定低限为0.3>g/kg.FF和TAP在阴性鳕鱼样 品中添加水平为1.0>g/kg时,本方法对仍可定量检出,信噪比?12,由此可以确定本方法FF和TAP的测定 低限为1.0/~g/kg. 参考文献 洪振涛,张卫锋,聂建荣,朱孟丽,庄志辉.2006.气相色谱法测定动物组织中氯霉素的残留量.中国兽药杂志,40(2):14,16 贺利民,苏贻娟,曾振灵,黄显会.2006.氯霉素类兽药的三甲基硅衍生物的质谱特征及残留测定.分析测试,25(2):43,46 赵文亚,沈美芳,徐幸莲,吴光红.2003.气相色谱法测定水产品中氯霉素残留.水产,27(3):278,282 黄冬梅,于慧娟,李庆,沈晓盛,王宏.2006.GC—MS测定水产品中氯霉素的残留量.分析科学,22(1):66,67 Chue,V.,Larry,J.,Schmit,T.eta1.2002.Liquidchromatographicdeterminationofflorfenico lintheplasmaofmultiplespeciesoffish.J. Chromatogr,780B:111,117 Nagata,T.,andOka,H.1996.Detectionofresidualchloramphenicol,florphenicol,andthiam phenicolinyellowtailfishmusclesbycapillarygas chromatography—massspectrometry.J.Agric.FoodChem.44:128O,1284 Robert,K.M.,David,C.H,Guy,R.S.eta1.1994.Gaschromatographicdeterminationofchlor amphenicolresiduesinshrimp.J.AOACInt. 77(3):596,6O1