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原代细胞培养.doc 鸡胚原代细胞的培养 [实验目的] 掌握鸡胚原代细胞培养操作的基本程序，观察单层细胞生长情况。 [实验材料] 9 ~10日龄鸡胚，Hank`s液(已含0.5%乳蛋白水解物)，0.25%胰蛋白酶，NaHCO，双抗，3牛犊血清，手术剪，眼科镊，培养皿，细胞瓶，三角瓶，玻璃珠(置于三角瓶内)，漏斗，纱布(置于漏斗中)，30ml注射器，10ml注射器，塞子若干，蛋座，水浴锅。 [实验内容及操作程序] 1、 配液 在Hank`s液中加入青、链霉素，使其含量为青霉素1000IU/ml，链霉素 100ug/ml。胰蛋白酶用含有青链霉素的Hank`s液(简称H液)按1:9比例稀释。用 7.5%NaHCO调整pH至7.2~7.4(玫瑰红色)。 3 2、 取胚及剪碎 将胚蛋气室端向上竖直于蛋座上，用碘酊消毒气室，以镊子击破卵壳并 弃之，注意不能让蛋壳碎屑掉入气势内，撕破卵膜并揭之，继撕破绒尿膜、羊膜， 用镊子夹住或勾住鸡胚脖子部位，取出胚胎于平皿中。剪去头部、翅爪及内脏，用H 3液洗去体血液。用灭菌剪刀剪碎鸡胚，使其成为约1mm大小的碎块，用H液小心 洗涤2次。 3、 消化 将洗涤好的胚胎碎块转移入三角瓶中，尽量不要让组织块沾到平皿壁上，按组 织块量约3~5倍胰酶，加上瓶塞，37?水浴约20min左右，每隔5min轻轻摇动1次。 待液体变混而稍稠，中止消化。 4、 分散 取出三角瓶后静置1min，让组织块下沉后轻轻倒去胰酶，塞好瓶塞，用力振 摇三角瓶，以使细胞分散下来。加入H液，轻轻振荡，待组织块下沉后，通过漏斗 中的纱布将H液过滤于细胞瓶中，小心不让组织块一并倒出。继续用力振摇三角瓶， 加H液过滤，重复两次，最后一次连同组织块一起倒入漏斗。 5、 加入血清 在过滤好的细胞悬液中加入牛犊血清，使血清含量为10%。塞好瓶塞，轻 摇细胞瓶混匀。 6、 分装 将加入血清的细胞悬液分装至各个细胞瓶中，约占细胞瓶容积的10%左右。塞 紧瓶塞，将细胞瓶横卧，瓶上注明组别、日期，置37?温箱培养。4h后细胞可贴附 于瓶壁，每隔24h观察一次，24~36h生长成单层细胞，此时可吸取培养液，更换维 持液，并接种病毒。 1 附:[主要试剂配制] 1、Hank`s液 原液A NaCl 8g ?7HO 2g MgSO42 KCl 8g Mg Cl?6HO 2g 22 2.8%CaCl 100ml 2 双蒸水 加至100ml 先将固体成分加于800ml双蒸水中，加温到50~60?溶解，再加入 CaCl溶液，最2 后加双蒸水补足到1000ml。加氯仿2ml，摇匀后4?贮存。 原液B NaHPO?12HO 1.2g 242 KHPO?2HO 1.2g 242 葡萄糖 20g 0.4%酚红 100ml 双蒸水 加至100ml 将上列各物混合后使其溶解，加氯仿2ml，摇匀后4?贮存。 Hank`s工作液 原液A 1份 原液B 1份 双蒸水 18份 工作液分装到盐水瓶中，115?灭菌10min，使用前以7%NaHCO3调节pH到7.2~7.6。 2、0.4%酚红溶液配制 酚红 0.4g 0.1%NaOH溶液 11.28ml 将酚红置于研钵中，边研磨边缓缓加入NaOH溶液，直到所有颗粒完全溶解，置于 100ml两杯中，最后加双蒸水至100ml，摇匀后，保存于4?冰箱备用。 3、O.5%乳蛋白水解物溶液配制 5g 乳蛋白水解物 2 1000ml Hank`s液 将乳蛋白水解物放入1000mlHank`s液中，待完全溶解后，摇匀分装于100ml的盐水瓶中，每瓶95ml，115?灭菌10min，保存于4?冰箱内备用。 3