【doc】水杨酸作用下东北红豆杉细胞的二维凝胶电泳分析

【doc】水杨酸作用下东北红豆杉细胞的二维凝胶电泳 水杨酸作用下东北红豆杉细胞的二维凝胶 电泳分析 l9卷l期 2003年1月 生物工程 ChineseJournalofBiotechnology V01.19No.1 January2003 水杨酸作用下东北红豆杉细胞的二维凝胶电泳分析 乔建军赵红葛志强元英进曾安平 (天津大学化工学院制药工程系,天津300072) 摘要东北红豆杉悬浮培养体系中加入适量浓度的水杨酸,染色结果明,水杨酸可以增加细胞膜通透性,并可 诱导部分细胞发生核凝集或核碎裂.提取细胞染色体DNA进行琼脂糖凝胶电泳,发现染色体DNA发生了部分降 解.应用蛋白质双向凝胶电泳技术,研究了水杨酸处理后东北红豆杉细胞发生应激反应过程中蛋白质的表达情 况,分析了处理细胞与正常细胞的蛋白质组差异,发现在水杨酸处理48h后的样品中有7个蛋白质差异点,而且有 6个蛋白点仅在对照中检测到.结果表明,外加水杨酸改变了东北红豆杉细胞的基因表达,抑制部分蛋白合成的同 时也合成了部分新蛋白质,这些蛋白可能与水杨酸的作用有关. 关键词水杨酸,东北红豆杉细胞,细胞凋亡,二维凝胶电泳,蛋白质组 中图分类号Q945.Q942文献标识码A文章编号1000—3061(2003)0l一0092—05 水杨酸(Salicylicacid,SA)是植物细胞内普遍 存在的一种酚类化合物,它在植物细胞中具有多种 生理调节作用…,sA及其盐类被认为是一类新的植 物激素J.研究表明,烟草叶片接种烟草花叶病毒 (Tomatomosaicvirus,TMV)后,SA含量会大大增加, 并可进一步诱导病源相关蛋白(Pathogenesis—related proteins,PRs)的积累及植物抗病性的产生.水杨 酸羟化酶(E.C.1.14.13.1)能够降解sA,大量表达 水杨酸羟化酶的转基因烟草植株丧失了积累SA的 能力,同时也丧失了产生抗病能力,说明sA是植物 产生抗病性必需的物质H.另外,外源添加SA同 样能够诱导植物积累PRs并产生抗病反应J. 在基因或蛋白质水平研究SA对于植物细胞的 生理生化作用是目前最为有效的研究手段.通常认 为,蛋白质的表达可以通过基因产物一mRNA的水平 反映出来,然而,最新研究表明,基因的表达水平与 细胞中相应蛋白质的含量并没有严格的一致性. 直接在蛋白质组水平研究SA作用后蛋白质表达的 变化,更有利于阐明SA的作用机理.利用二维凝 胶电泳技术可以对东北红豆杉细胞的蛋白质组进行 分析,研究SA作用后细胞中蛋白表达的变化,为研 究SA的作用机理奠定基础. 1994年澳大利亚的两位学者Wilkins和Williams 首先提出了蛋白质组(Proteome)的概念,即基因组表 达的全部蛋白质,或指细胞,组织或肌体在特定时间 和空间所表达的所有蛋白质.1975年,O'Farrell 等人建立了二维凝胶电泳的方法,此法经逐步改 进后可取得良好的实验效果. 本文研究了外加SA对于东北红豆杉悬浮培养 细胞的影响,结果表明,外源添加SA可以增加细胞 膜的通透性,导致部分染色体DNA发生降解,细胞 发生强烈的应激反应.应用二维凝胶电泳技术研究 东北红豆杉悬浮培养细胞在SA作用下的蛋白表达 变化,找到部分与SA作用可能相关的蛋白点,为研 究细胞发生应激反应的分子机理以及水杨酸的作用 机制奠定了基础. 1材料和方法 1.1细胞株系及细胞悬浮培养 东北红豆杉(Taxuscuspidata)细胞从东北红豆 杉幼茎诱导所得,采用改良的固体培养基继代培 养,每30d接种1次.生长良好的细胞可转入改 良的液体培养基中,在25c【=,110r/min的黑暗条 件下悬浮培养五代以获得生长状态良好的细胞,在 传代第7天时加入适当浓度的SA,备实验所用. 1.2实验设备及试剂 二维凝胶电泳系统购自AmershamPharmacia Biotech公司.pH3,10线性18cmIPG预制胶条,IPG 收稿日期:2002.08.07,修回日期:2002.10.23. 基金项目:国家杰出基金B资助(No.NSFC一20028607). *通讯作者.Tel:86-22?27401149;Fax:86.22.27403888;E-mail:yjyuan@public.tpt.tj.cn 1期乔建军等:水杨酸作用下东北红豆杉细胞的二维凝胶电泳分析93 缓冲液,蛋白质银染试剂盒,二硫苏糖醇(DTF)均购 自AmershamPharmaciaBiotech公司.Propidium—io— dine(PI)andHochest33342购自Sigma公司. 1.3实验方法 1.3.1细胞染色:取1mL细胞培养液,1500r/min 离心10min,然后将沉淀用PBS(0.8%氯化钠, 0.02%氯化钾,0.144%磷酸氢二钠和0.024%磷酸 二氢钾,pH6.8)洗3次,中间需不断吹打,防止细胞 成团.最后将细胞重悬于0.2mLPBS溶液中,加入 PI及Hoechst33342至终浓度50肚g/mL,染色15min 后在荧光显微镜下观察. 1.3.2细胞总DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳:细 胞总DNA的提取参照文献[15],DNA样品经1.2% 的琼脂糖凝胶电泳分离后,用0.5,ug/mL(/V)溴化 乙啶染色,并在紫外透射仪上观察,照相. 1.3.3蛋白样品制备:收集红豆杉凋亡细胞及正常 细胞,用PBS(pH7.4)洗涤3次,直接加液氮研磨至 粉末状,分装于1.5mL的离心管中(每管200mg). 用500ttL裂解缓冲液(8mollL尿素,4%CHAPS, 40mmol/Lriffs)溶解细胞样品,于4?下充分溶解样 品.13000r/min离心20min,取上清300/~L,加入3倍 体积的冷丙酮,一25?放置2h,然后以转速13000r/ min离心20min,去上清,沉淀物用冷冻干燥机冻干. 然后将样品溶于200~L的IPG溶胀液中(8mol/L尿 素,2%CHAPS,0.5%IPG缓冲液,痕量溴酚蓝,用前 加0.3%DTF),测定蛋白质含量后贮存于一25?备 用. 1.3.4IPG干胶条的溶胀与等点聚焦:将含有约 1.0mg蛋白的300/~L溶胀液加于干净的等电聚焦槽 中;撕去IPG干胶条的保护膜,胶面朝下放于槽中; 加1mL矿物油覆盖,加盖后于下列条件等点聚焦: 30V,11h;500V,1h;1000V,1h;8000V,4h. 1.3.5IEF胶条的平衡:等点聚焦结束后,将胶条 用双蒸水冲洗,在平衡缓冲液(50mmol/Lriffs—C1 pH8.8,6mol/L尿素,30%甘油,2%SDS,痕量溴酚 蓝,用前每lOmL加100mgDTF)中平衡20min. 1.3.6SDS一聚丙烯酰胺凝胶的配制:灌制浓度为 12%的SDS一聚丙烯酰胺凝胶,胶厚1.5mm,面积 29cm×19cm.具体步骤及配方见分子克隆?. 1.3.7SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳:将平衡好的胶条 置于SDS一聚丙烯酰胺凝胶上,用低熔点琼脂糖封 胶.将玻璃板插入电泳槽中,在80V电压下进行电 泳,溴酚蓝前沿走至凝胶边缘时停止电泳. 1.3.8凝胶的染色及图像处理:凝胶经考马斯亮蓝 R250染色后进行透射扫描(光学分辨率300DPI). 利用ImageMaster2-DEliteVersion3.1图像分析软件 进行图像处理,经点检测,背景消减,ID校正,匹配 等步骤比较蛋白点的差异. 2实验结果 2.1SA作用后东北红豆杉悬浮培养细胞的形态学 变化 在50mL的东北红豆杉悬浮培养体系中加入SA 至终浓度0.375mmol/L,染色结果如图1所示,在24h 时约有10%的细胞核被PI染成红色,在48h时约有 20%的细胞核被染成红色,而在对照组中仅有约 2%的细胞被染成红色.结果表明,外加水杨酸改变 了东北红豆杉细胞膜的通透性,部分细胞核被染成 红色.另外,如图2所示,SA可诱导部分细胞发生 核碎裂,在48h时,约有5%的细胞核发生核碎裂, 而在对照中未观察到有核碎裂发生. 图lsA处理后东北红豆杉悬浮培养体系中 红核细胞所占比例 Fig.1PercentagesofredcellsinthesystemsinducedbySA (a)Treatedwith0.375mmol/LSA;(b)Control 2.2SA作用后东北红豆杉细胞总DNA电泳图 分别提取添加SA48h后的东北红豆杉悬浮培养 细胞及对照的总DNA,琼脂糖凝胶电泳后染色观 察.结果如图3所示,添加SA48h后东北红豆杉细 胞的染色体DNA发生降解,可看到模糊的DNA条 带,而对照细胞生长良好,未发现有染色体DNA降 解.结果表明,外源添加sA可诱导东北红豆杉悬 浮培养细胞产生应激反应,并有类似细胞凋亡现象 的发生. 2.3二维凝胶电泳图谱分析 提取添加SA48h后的东北红豆杉悬浮培养细 胞的总蛋白并进行二维凝胶电泳,结果如图4所示, T.cuspidata细胞中蛋白质的等电点和分子量分布 较广,蛋白质主要集中在40,80kD之间,等电点主 生物工程l9卷 图2SA处理后东北红豆杉悬浮培养体系中细胞核的变化 Fig.2MorphologicalchangesofnucleiofsuspensionculturesofTaxuscuspidate (1)Control;(2)Treatedwith0.375nunol/LSAat48h 图3东北红豆杉细胞染色体DNA琼脂糖凝胶电泳分析 Fig.3AgarosegelelectrophoresisofnuclearDNAfrom suspensionculturesofTaxuscuspidata 1.DNAfromcontrolculture:2.TntalDNAfronltheSA—treatedcultureat day2;3.LanlbdaDNA/Hind?Markers(23kb,9.4kb,6.6kb, 4.4kb,2.3kb.2.0kb,0.6kb) 要集中在pH4.0,8.0之间,略偏酸性的蛋白较多, 碱性蛋白较少. 利用ImageMaster2-DElite(Version3.1)软件对 图像进行分析,结果表明,SA处理的样品与对照组 的二维凝胶电泳图谱基本相同,但也存在着少量的 特异蛋白点.在SA处理的样品的二维凝胶电泳图 谱中有7个特异蛋白点,同样有6个蛋白点仅存在 于对照中,这些特异点可能与SA的作用有关.这 些特异蛋白点的等电点,分子量及含量见Table1, SA处理后新生成的蛋白质点的放大图谱如图5所 示.另外,还可检测到SA处理后部分蛋白点的表 达量也发生改变,这些蛋白点也应与SA的作用有 关 pHIkDIpH ?—— 97 —— 66 ?—— 45 — 31 — 22 — 14 (a)(b) 图4SA作用下东北红豆杉悬浮培养细胞蛋白的二维凝胶电泳分析 Fig.4Two-dimensionalgelelectrophoresisoftheexpressedproteinsfromsuspensioncultur eofTaxuscuspidatatreatedwithSA (a)Fromcontrolculture;(b)FromtheSA.treatedculture 1期乔建军等:水杨酸作用下东北红豆杉细胞的二维凝胶电泳分析95 图5SA处理后东北红豆杉细胞中蛋白表达特异点 Fig.5SpecialproteinspotsfromTaxu~cuspidatatreatedwithSA A1,F1.Fromthecontrolcultureatday2:A2,F2.FromtheSA—treatedcellsatday2 3讨论 水杨酸是植物细胞产生应激反应过程中非常重 要的信号分子,外源SA处理可以诱导植物细胞发 生相应的生理生化反应,保护植物细胞抵抗外界不 良环境.本文研究了外加SA对于东北红豆杉 悬浮培养细胞的影响,结果表明,外加SA (0.375mmol/L)可以增加细胞膜的通透性,并可诱导 部分细胞发生核碎裂. 利用二维凝胶电泳技术分析了水杨酸作用后东 北红豆杉细胞中蛋白表达变化,结果表明,SA对于 细胞中蛋白的表达有很大影响.比较SA作用后东 建l 北红豆杉细胞的二维凝胶电泳图谱与对照的区别, 可以将蛋白点大概分为三类:1.在SA作用体系中 与对照中的表达量基本相同,此类蛋白应该与细胞 的基础代谢有关,是维持细胞生命活动必不可少的 蛋白,此类蛋白通常由管家基因负责编码;2.SA处 理后表达量下降或者是不再表达的蛋白,此类蛋白 应与细胞的生长及分裂有关;3.SA处理后表达量提 高或者是新表达的蛋白,此类蛋白应该与细胞产生 应激反应及细胞凋亡有关. 由于实验中使用了固相pH梯度胶条,采用高 电压聚焦的方法,大大缩短了聚焦的时间,提高了二 维凝胶电泳的稳定性及分辨率.如希望进一步提高 生物工程l9卷 二维凝胶电泳的分辨率,可利用小范围固相pH梯 度胶条进行等电聚焦,然后进行SDS.聚丙烯酰胺凝 胶电泳,染色后将各pH范围所得的图谱拼在一起, 可得到一张完整的二维凝胶图谱.另外,利用建立 的东北红豆杉蛋白二维凝胶电泳系统,可以分析细 胞培养过程中蛋白的表达变化,比较紫杉醇合成过 程中东北红豆杉细胞蛋白表达的变化,为确定紫杉 醇合成酶系及紫杉醇的生物合成途径奠定基础. 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KeywordsSalicylicacid,Taxuscuspidata,programmedcelldeath,2-dimensionalgelelectro phoresis,proteome Received:08.07.2002 ThisworkwassupportedbyGrantfromtheNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.20028607) *Correspondingauthor.Tel:86-22-27401149;Fax:86-22-27403888;E-mail:yjyuan@public.tpt..an