肿瘤坏死因子单克隆抗体及肝细胞生长多肽对实验性肝坏死的…

肿瘤坏死因子单克隆抗体及肝细胞生长多肽对实验性肝坏死的… 肿瘤坏死因子单克隆抗体及肝细胞生长多 肽对实验性肝坏死的… k7’. 肿瘤坏死因子单克隆抗体及肝细胞生长多肽 对实验性肝坏死的保护 周晓东张定风任红 ? 137? /要为了评估肿瘤坏死因子单抗(mAbTNF)及肝细胞生长多肽(HPK)的抗肝坏死效果,我 们使用太肠杆菌内毒素和鸭乙型肝旋病毒(DHBVj联台诱导建立r鸭急性肝坏死模型实验结果显 示:mAbTNF组及HPN组血清肿瘤坏死因f活性水平明显低干对照 <0.O1),且治疗组肝坏 组(尸 死程度也明显减轻(尸<0.01).此外.实验发现血清肿增坏死因子活性水平的高低与其急性肝坏死 程度成正相关关系(r’s—o.9027.P<O.O1).困此认为,HPN是一种阻止实验性急性肝坏死的话性 多肽,它的早期使用可抑制机体肿瘤坏死因子的释放. 关键询肝细胞生长多肽肿瘤坏死因子鸭乙型肝炎病毒内毒素肝解, 罩I赫簪 PreventionofexperimentalhepaticnecrosisbyhepatopoietinandmonoclonalantlbotoFZhou Xiaodong,Zhangt~’ngfeng,RenHong.ViralHepatitisInstitute,Chongqing MedicalUniversity, Chongqing630010 AbstractThisstudyisdesignedtoevaluatetheefficacyofmonoclonalantibodytoTNF TNF)andhepatopoietin(HPN)inpreventingexperimentallivernec (mAb— rosisinducedbyduck hepatitisBvirus(DHBV)combinedwithI1p0po1ysaccharide(LPS).BoththemAb—TNFandHPN groupsdisplayedsignificantlylowerlevelsofTNFactivityinserumcomparedwiththecontrolgroup <0.O1).Inaddtinn.thedegreeofnecrosisinthetreatedgroupsdecreasedsignificantly(尸<0. 01).Furthermore.theserumTNFactivitywB.sproportionaltolivernecrosis(r’s一0.9027P<0. 01).WeconcludethatHPNisfineffectivepeptideinpreventionofacutelivernecrosisifgivenatap propriatestageofthediseaseandthattheearlyuseofthispeptidemayinhibitreleaseofTNFinvi— V0. KeywordsHepatopoietinTumornecrosisfactorDuckhepatitisBvirus Iipopolysaceharide. 近来,肿瘤坏死因子(TNF)在肝细胞坏 死中的作用引起了普遍的重视.TNF在重型 肝炎及慢性活动型肝炎患者增高已得到证 实,然而TNF与肝细胞坏死究属目果关系 还是伴随关系目前尚无定论.我们对此进行 了系统的研究,发现TNF是造成肝坏死的 重要介质,肝细胞生长多肽(HPN)能抑制 TNF的产生,防止肝坏死. 国家自然科学基金资助 作者单位:630010重庆医科大学病毒性肝炎研究所 材料与方法 一 ,实验动物 重庆麻鸭,鸭龄6,12月,体重1,2kg 按实验要求将20只重庆麻鸭随机分为5组: I.空白对照组(仅注射生理盐水);2.肝坏 死组(预备注射oB内毒素,激发注射 DHBV阳性血清);3.实验对照组(OB内 毒素/生理盐水);4.mAb—TNF保护组( mAb—TNF/OB5内毒素/DHBV阳性血 清);5.HPN保护组(HPN/O琏内毒素/ m期 一 印 , 月 年 卷 杂 扁 恃 华 中 - 138? DHBV阳性血清). 二,急性肝坏死动物模型的建立 实验方法基本与上海第二医科大学李彪 如报道相同_2. 三,HPN及mAb—TNF的保护 HPN的保护,同时经胆道或静脉注射 80t~g/kgOB5内毒素与10mg/kgHPN; mAb—TNF的保护,在注射OB内毒素前2 小时预先静脉注射lmg/kgmAb—TNF. mAb—TNF购自中国军事医学科学院;OB 大肠杆菌内毒素购自上海第二医科大学. 四,TNF活性测定 采用D.A.Flick报道的加放线菌素D 的结晶紫染色法0]. c:(卜藉)><100 CI:TNF细胞毒性指数 五,鸭肝病理学检查 在实验前与第二次注射后72小时解剖 肝脏,取材做病理学切片检查 六,肝细胞生长多肽的制备 采用改良LaBreque法,本所自制. 结果 一 ,DHBV阳性血清和OB大肠杆菌 内毒素的最佳反应剂量 实验鸭肝组织病理变化程度判断参照日 本Mori法.’将急性肝坏死分成六类五级,据 此,固定OB内毒素剂量80t~g/kg,选 不同剂量DHBV阳性血清激发,结果显示 1.5ml/kg为最佳反应剂量.以后实验均选用 这一剂量. 二,鼠抗人mAb—TNF对鸭血清TNF 的交叉免疫实验(ELISA)结果 我们采用mAbTNF作为一抗的间接 酶联免疫法检测了人血清肿瘤坏死因子(H— TNF)及鸭血清肿瘤坏死因子(D—TNF),结 果显示H—TNF的A值为0.555,P<0.01, 而D—TNF的A值为0235,P%0.05,说明 ChinJIMeCtDis,Auus【1996,Vo1.14,No.3 鸭血清中的TNF能与鼠抗人mAb—TNF笈 生交叉免疫反应,人与鸭TNF的抗原性相 似. 三,mAbTNF和HPN对动物血清 TNF活性及肝坏死的影响(见1,2) 表1mAb—TNF殛HPN对动物血清 TNF活性的髟响(Y-t-s) 分组鸭只散CIq 注rcI为TNF细胞毒性指教,mAb-TNF组爰ftPN 组的cI值与LPS/DHBV组相比,q值分别为4.83,4.58, P<O.Ol与空白对照比较:P<0.Ol{一P>0.05 表2mAb-TNF殛HPN对鸭肝坏死的影响 分组鸭只数兰 一士1-t 注:与空白对照比较:.P<0.01;一P>005 实验中,我们同时将大肠杆菌内毒素 O%B580p-g/kg,DHBV阳性血清1.5ml/kg 以及HPNlOmg/kg注入动物体内,结果技 现,HPN治疗组TNF细胞毒性指数较未保 护的肝坏死组明显降低,差异有显着性.这提 示在动物体内HPN可明显抑制内毒素与 DHBV联合诱生TNF的作用.此外,在该动 物实验中我们还发现,如果将鼠抗人mAb— TNFlmg/kg在内毒素注射前预先注射到 动物体内,亦能明显地减少TNF的细胞毒 性指数(见表1),这表明该mAb—TNF具有 明显的抗体内TNF活性的作用. 与此同时,在鸭肝组织学检查中发现,在 内毒索/DHBV阳性血清诱导组的肝坏死程 中华传染病杂志1996年8月第14卷第3期 度最为严重(见表2).镜下呈两叶以上斑块 状坏死,坏死以小叶中央为重.坏死区常超过 小叶范围,并见大量淋巴细胞,中性粒细胞与 巨噬细胞浸润,毛细胆管淤胆,部分可见小胆 管增生.在内毒素/生理盐水组则肝内病变较 轻.可见较多炎性细胞的浸润而在HPN和 mAbTNF治疗的两组中,肝内病变与未经 治疗的肝坏死组相比较明显轻微,肝组织小 叶结构完整,无明显肝细胞坏死,可见大量炎 性细胞的浸润这进一步说明在动物体内,于 适当的时机施加肝细胞生长多肽或肿瘤坏死 园子单抗不仅能有效地抑制血清TNF的活 性,也能阻断TNF对肝细胞的毒性作用. 四,动物血清TNF活性与肝坏死的关系 实验鸭急性肝坏死后的血清TNF活性 变化经等级相关统计分析(Spearman法)处 理,证明其血清TNF活性变化与肝坏死程 度成非常显着正相关关系(r’s=0,9027, P<0,01). 讨论 乙型肝炎患者血清及外周血单个核细胞 (PBM)诱导上清TNF活性水平的测定国内 外均有报道最近,武藤泰敏发现暴发性肝 功能衰竭患者PBM诱生TNF及IL1活性 增高.这提示TNF与病毒性肝炎肝细胞坏 死可能有一定关系.本动物实验中,发现 TNF活性的高低与肝细胞坏死程度的轻重 有着正相关的关系(r’s=0.9027,P<0.01). 且mAb—TNF对TNF的肝细胞坏死有抵抗 作用.提示TNF是造成急性肝细胞坏死的 重要介质,它介导了肝细胞坏死. TNF如何引起肝细胞坏死的机制目前 尚不大清楚播散性血管内凝血及微循环障 碍可能是TNF引起大量肝细胞坏死的原因 之一.现认为TNF是革兰阴性杆菌败血症 所致中毒性休克的重要介质人们利用制备 TNF抗体实验阐明了TNF在败血症休克发 病机制中的重要性.其实验是用多克隆兔抗 ?139? 鼠TNF抗体被动免疫小鼠,然后用致死剂 量的LPS攻击,显着地降低了鼠的死亡率. 在暴发性肝炎常出现类似内毒素休克的循环 障碍及血液流变学改变.另外,TNF也可能 通过再次打击而引起已损的肝细胞坏死在 通常情况下,TNF对正常鸭肝细胞无明显的 致肝坏死作用,然而,当其肝细胞被DHBV 感染时.TNF可通过受体后效应活化 CAMP和溶酶体酶而引起肝细胞膜结构,细 胞器结构的破坏这可能是因为一方面,在正 常情况下肝细胞能合成象PP多肽等物 质,它们可抵抗TNF的细胞毒作用,而在受 染的肝细胞内,DHBV干扰了这类多肽的产 生}另一方面,在DHBV感染的动物体内活 化的巨噬细胞,T淋巴细胞产生的白细胞介 素和干扰素可加强TNF的肝细胞毒性作用. 被动免疫鼠抗人mAb—TNF能保护狒 狒免受活大肠杆菌致命性攻击(2只实验动 物全部存活,6只对照动物无一幸存)已有报 道].在本试验中,鼠抗人mAb—TNF也能明 显降低鸭血清中TNF活性及减轻肝细胞坏 死.这表明TNF的肝细胞毒作用能被mAb— TNF中和, 国内外学者分别从狗,猪,兔,大白鼠等 肝内提取到分子量为12o.0,15000.能促 进肝细胞生长的低分子多肽物质,称其为肝 细胞生长多肽(HPN)在本试验中,这种低 分子多肽有类似mAb—TNF的降低血清 TNF活性和保护肝细胞的作用.实验提示, HPN对肝细胞的保护作用可能是由于它能 抑制内毒素对TNF的诱生.HPN具有器官 特异性而无种属特异性,它可能为临床早期 治疗重型肝炎开辟一条新的途径. 参考文献 1张定凤,任红.郭树华.肿瘤坏死因子在翥毒性肝炎肝坏 死中的作用及其防护.中华医学杂志,1990,70t438 2李标如,童善庆.王健全,等DHBV诱发鸭急性肝坏死 动物模型的建立.上海第二医科太学,1990,10: 189. ? 140? 3FlickDA.GeorgeEGCompa…isoir?il.cei】f?0 toxicassysfortumornecrosis~ctor』[mmunn]. Methods,1984,68:16 4MoriWAcutehepaliccellnecrosisexperis. Lenta[~yp duced5yviralagentsinrahbhsAmJPath.1198].103 :31. 5MutoYEnhancedt?necrosisfacto…dinrr 1996,VOL14.No3 leukln…1fulmmar,thepatic~i]ureLancet.1982.2: 72. 6TraceyKMAnt1cachectln,TNFmonoclonalantibodie preventsepticshockdurignlethalbacteruem[aNature. 1987,330662 【收稿}1995--G3—31修回:1998--05一c4 第五届中华医学会传染病与寄生虫病学会各学组成员名单 (--)病毒性肝炎学组 组长:斯崇文 副组长:邬祥惠皇甫玉珊 组员:林秀玉(兼秘书)徐道振王泰龄 庄辉陶其敏王勤环巫善明 陆志檬挑集鲁姚志强王兆荃 郝连杰牛俊奇骆抗克张定凤 胡国龄 顾问;田庚善汪俊韬 (二)肾综合征出血热学组 组长:于丹萍 副组长:王嘉瑞张成文 组员:白雪帆(兼秘书)王贵强(兼秘书) 宋干杨为松俞永新倪大石 罗端德马亦林陈化新王子骥 孙志坚杨东亮 顾问:崔振宇 (三)抗感染和艾滋病学组 组长:王爱霞 副组长:翁m华盛瑞媛 组员;陈民钧张孔来陈鸿珊郑锡文 曹毅陈增辉栾长汪复 张婴元石尧忠郁福康来仪 何礼贤高健贾辅忠范宗滂 雷秉钧王其南徐秀华 (四)寄生虫病学组 组长;许炽燥 副组长:周明行 组员:陈雅棠(兼秘书)薛燕萍 邵向云甘绍伯乔光彦 贾杰蔡卫民姚一民 黄其通王贵强蒋次鹏 顾问:贺联印 (五)老年感染性疾病,肝病学组 组长:张迈仑 副组长;常德成范宗滂 组员:刁会正(兼秘书)贾辅忠 洗超许昶舒昌杰 乔光彦 顾问:曹立森 (六)小儿肝病及感染病学组 组长:邬祥惠 副组长;朱启镕林厚基 组员:吕晴(兼秘书)董永绥 陈敏王德成阮国涛 郭长劳 顾问:段恕诚 蔡惠芬 欧阳颗 葛凌云 马云辉 王子骥 陈宝龙 张鸿飞 刘惠明 l{,l3 中华传染病杂志1996年8月第14卷第3期?141? 不同人群血项丙型肝炎病毒核心抗体存在状态 J2ff2,6;.歹竺—逊M?MihTh陈国致 ,一L摘要为调查不同人群血清单项丙型肝炎病毒棱心抗体(抗一HCVc)存在状态,应用台成肽酶免 疫分析筛选抗一HCVe,经重组免疫印迹和中和抑制试验鉴定.发现孕妇,供血员,慢性乙型肝炎,非甲 非乙型肝炎,透析患者,原因不明肝硬化和输血后肝炎单项抗HCVc阳性率分刖为0.8(11/ 1436),2.8(15/541),3.1(15/484),13.6(9/66),11.5%(10/87),28.6(4/14)和30(3/’ 10).单项抗一HCV阳性的孕妇和供血员血清仅26.7%,27.3捡出HCVRNA,透析和各种肝病患 者检出率高达55.6--100.8倒单项抗一HCVc阳性肝炎患者病理检查显示不尉程度的肝损害结 果提示:不同人群单项抗一HCVc阳性的意义有差别,检测HCVRNA对区剐抗一HCVc存在属既往或 现症感染十分重要. 关键词丙型肝炎丙型肝炎病毒抗体反应 PrevalenceandsignificanceofsingleserumantbodyresponsetohepatitisCvi ruscoreantigen amongvariouspopulationsHaoFei,1,iMengdong,M.MichaelTkater?”a1.T heSouthwestHospi tal,ThirdMilitaryAfedicalUniversity,Ch0?gq”嘻630038 Ab~lraetThisstudywasdesignedtoinvestigatetheprevalenceofsingleserumantibodyre sponsetohepatitisCviruscoreantigen(antiHCVc)amongvariouspopulations.Serumanti’HCVc wasscreenedbyanenzyme—linkedimmunosorbentassaybasedonsyntheti cpeptidefragmentsand confirmedbysecondgenerationrecombinantimmunoblotassay(RIBA)andneutualizinginhibition tests.ItwasfoundthatthepositiveratesofsingleserumantiHCVcinpregnantwomen,blood donors,chronichepatitisB.non—A./Ion—Bhepatitis,hemodialysispatient s,patientswithunknownliv— ercirrhosisandpatientswithposttransfusbnhepatitisvcere0.8(]】 /1436).2.8(15/5413,3.1 (】5/484),13.6(9/66),11.5(】 0./87),28.6(4./14)and30(3/10)respectively.Only26.7 to273ofseraposititveforsingleanti—HCVcfrompregnantwolxtenandbloo ddonorswereHCV RNA-positive.comparedwith55.6to100ofserafrombemodialysispatientsandpatientswith differentclinicaltypesofhepatitis.Variousdegreesofliverlesionsweredemo nstratedin8casesof patientswithsingleanti—HCVcItissuggestedthatthereisdifferentsignificanceamongvariouspop— ulationswithsingleserumanti—HCVc.Therefore,itisveryimportanttodetectserumHCVRNAby reversetranscriptionpolymerasechainreaction(RTPCR)todistinguishpres entinfectionfrompast infectionofHCVamongvariouspopulationswithsingle$~rumanti—HCVc. KeywordsHepatitisCHepatitisCvirusAntibodyresponse 丙型肝炎病毒抗体(抗一HCV)阳性的供 血员,经重组免疫印迹法(RIBA)鉴定,发现 9.6,3O.O%呈单项丙型肝炎病毒核心抗 国家自然科学基金资助课题 作者单位;630038重庆第三军医大学西南医院(郝 飞,李梦术陈国致);美国加里福利亚太学医学院(M MichaelThatet) 体(抗一HCVc)阳性.但对萁存在的意义持不 同的观点,其它人群中单项抗一HCVc存在的 状态尚不清楚一”.我们用合成肽酶免疫分析 法(EIA)对多种人群血清作抗一HCV检测, 阳性血清经RIBA鉴定,以探讨不同人群血 清单项抗HCVc的存在状态及其意义