【doc】兔抗人外周血单核细胞、兔抗猴脾脏淋巴细胞免疫血清的制备及其在分离人和猕猴胚胎内细胞团中的应用

【doc】兔抗人外周血单核细胞、兔抗猴脾脏淋巴细胞免疫血清的制备及其在分离人和猕猴胚胎内细胞团中的应用 兔抗人外周血单核细胞、兔抗猴脾脏淋巴细胞免疫血清的制备及其在分离人和猕猴胚 胎内细胞团中的应用 动物学研究2006,Feb.27(1):48—53 ZoologicalResearch CN53一lO4O/QISSNO254—5853 兔抗人外周血单核细胞,兔抗猴脾脏淋巴 细胞免疫血清的制备及其在分离人和 猕猴胚胎内细胞团中的应用 张秀珍,采克俊,王淑芬l,,胡智兴,裴轶劲,季维智l' (1.中国科学院昆明动物研究所,云南昆明650223;2.中国科学院研究生院,北京100039) 摘要:采用梯度离心的方法用淋巴细胞分离液从浓缩的人白细胞悬液中分离人外周血单核细胞,从猕猴新 鲜脾脏中研磨分离猕猴脾脏淋巴细胞;分别将人外周血单核细胞和猕猴脾脏淋巴细胞作为免疫原,每次通过耳 缘静脉注射4×108个细胞免疫日本大耳白兔,每周免疫一次,共免疫3次,制备兔抗人外周血单核细胞和兔抗 猕猴脾脏淋巴细胞免疫血清.体外培养人和猕猴胚胎至囊胚,采用制备的免疫血清,分离人和猕猴囊胚内细胞 团,用于建立人和猕猴胚胎干细胞系.结果如下:(1)用半微量细胞毒实验法测得兔抗人外周血单核细胞免疫 血清和兔抗猕猴脾脏淋巴细胞免疫血清的效价分别为1:320和1:640;(2)两种免疫血清成功地裂解了15个人 囊胚和33个猕猴囊胚的滋养层细胞,分离出了内细胞团,明免疫血清的制备取得了成功,为建立人和猕猴 胚胎干细胞系奠定了基础. 关键词:免疫外科手术法;免疫血清;分离内细胞团;人囊胚;猕猴囊胚;胚胎干细胞 中图分类号:Q492文献标识码:A文章编号:0254—5853(2006)01—0048—06 PreparationofRabbitAnti?HumanPBMCAntiserum andRabbitAnti?RhesusMonkey(Macacamulatta) SpleenCellAntiserumandTheirApplicationin IsolatingHumanandMonkeyInnerCellMasses ZHANGXiu—zhenl一,CAIKe—junl,WANGShu—fenl一, HUZhi—xing一,PEIYi—jing,JIWei—zhj, f1.KunmingInstituteofZoology,theChineseAcademyo厂 Sciences,Kunming,Yunnan650223,China; 2.GraduateSchooloftheChineseAcademySciences,Beijing100039,China) Abstract:Humanperipheralbloodmononuclearcells(PBMC)wereseparatedfrombloodbyficoll?hypaquedensity gradientcentrifugationandrhesusmonkeyspleencellswereisolatedfromfreshspleens.Toisolateinnercellmasses (ICMs)byimmunosurgeryfromhumanorrhesusmonkeyembryosandestablishembryonicstemcell(EScel1)lines,anti. serumswerepreparedbyinjectingrabbitswithhumanPBMCorrhesusmonkeyspleencells,with4X10cellseverytime, onceaweekandthreetimesinall,respectively.Ourresul~werelistedasbelow:1)Rabbitanti-humanPBMCantiserum hasatiteraround1:320andrabbitanti.rhesusspleencellantiserumhasatiteraround1:640:2)Thetrophectoderrflwere lysedbyimmunosurgeryusingtherabbitanti?-humanPBMCoranti?-rhesusspleencellantiserumfollowedbyexposureto guineapigcomplement.ICMsweresuccessfullyisolatedfrom15humanblastocystsand33monkeyblastocysts.Thesere— suitsindicatedthatourantiserumscouldbeusedforcollectinghumanormonkeyICMcellsandtheywouldplayimportant rolesinisolatingnewhumanorrhesusmonkeyEScellsinthefuture. 收稿日期:2005—10一l1;接受日期:2005—12—19 基金项目:云南省自然科学基金重点项目(2001C00(DZ) 通讯作者(Correspondingauthor).E-mail:wji@mail.kiz.ac.cn 第一作者简介:张秀珍,女,博士研究生,主要从事胚胎干细胞培养和分化研究,现工作于山东理工大学生命科学学院. 1期张秀珍等:兔抗人外周血单核细胞,兔抗猴脾脏淋巴细胞免疫血清的制备及其在分离人和猕猴胚胎内细胞团中的应用49 KeywOrds:Antiserum;Embryonicstemcell;Immunosurgery;Innercellmass;Humanblast ocyst;Rhesusmonkey blastocyst 胚胎干细胞(embryonicstemcells,EScells) 是从囊胚内细胞团(innercellmass,ICM)分离出 来的,能在体外无限增殖,高度未分化的全能性细 胞,可用于研究胚胎发育,细胞分化,人类遗传疾 病的调控机理,为器官移植提供原材料,具有广阔 的应用前景,因而成为生物医学研究的热点.分离 培养胚胎干细胞是胚胎干细胞研究和应用的基础和 前提,分离胚胎干细胞的首要步骤是分离内细胞 团,主要有两种方法:机械法和免疫外科手术法. 机械法复杂费时,难以彻底去除滋养层细胞,残留 的滋养层细胞在后续培养中容易导致胚胎干细胞分 化(Picketing,2003),因此越来越多的学者采用 免疫外科手术法.免疫外科手术法是基于P$-~L动物 囊胚滋养层细胞间的紧密连接对免疫球蛋白等大分 子物质具有非特异性屏障作用,使抗体只能结合在 滋养层细胞上,不能透过滋养层结合到内细胞团上 (Handyside&Barton,1977).免疫血清先与囊胚孵 育,洗去多余免疫血清,再与补体孵育,通过补体 介导的细胞毒作用裂解滋养层细胞,有效分离出内 细胞团(Hogan&Tilly,1978a,b;Soher& Knowles,1975;Spielmannetal,1980). 免疫外科手术法首先在小鼠胚胎上取得成功, 小鼠脾淋巴细胞与小鼠胚胎滋养层细胞有相同的抗 原决定簇,兔抗鼠脾细胞免疫血清可以与滋养层细 胞结合,裂解滋养层细胞(Soher&Knowles, 1975).由于缺少针对灵长类囊胚的免疫血清,各 国学者在分离人胚胎干细胞时分别尝试了多种免疫 血清:如兔抗人滋养层细胞系BeWo细胞的免疫血 清(Thomsonetal,1998;Lanzendorfetal,2001); 兔抗人全血免疫血清(Hwangetal,2004;Parket al,2003;Picketingetal,2003;Reubinoffetal, 2000;Stojkovicetal,20o4);兔抗人红细胞免疫血 清(Cowanetal,2004;Klimanskayaetal,2005); 兔抗绒猴脾脏细胞免疫血清(Thomsonetal, 1996).由于受免疫血清的限制(国外实验室一般 自行制备,无成熟产品),国内还没有建立分离猕 猴内细胞团的免疫外科手术法,采用同种方法分离 人内细胞团的研究也比较少,影响了我国灵长类胚 胎干细胞的研究进展. 为了分离人和猕猴的胚胎干细胞,本实验室采 用猕猴脾淋巴细胞作为免疫原制备兔抗猕猴血清. 人的脾脏难以获取,鉴于脾细胞主要是淋巴细胞, 所以从人外周血中分离单核细胞(其中主要是淋巴 细胞)作为免疫原制备兔抗人外周血单核细胞免疫 血清.并进一步考察了这两种免疫血清是否能够用 于分离人和猕猴囊胚内细胞团. 1材料与方法 1.1实验动物 健康日本大耳白兔6只,购自中国医科院昆明 医学生物研究所,体重2.5,3kg,分两组,每组3 只,分别用其制备兔抗人外周血单核细胞免疫血清 和兔抗猕猴脾脏淋巴细胞免疫血清.采用细胞毒实 验法检测免疫前兔血清,发现无天然毒性.5只健 康豚鼠,体重200,250g,购自昆明医学院动物 科,用于制备补体. 1.2试剂 RPMI一1640,DMEM,mCNRL一1066,G2培养 基购自Gibco公司.淋巴细胞分离液购自TBD生物 技术发展中心[比重(1.077?0.001)g/L]. 1.3制备免疫原 1.3.1分离人外周血单核细胞浓缩白细胞购自 云南省昆明市中心血站,用RPMI一1640培养基将细 胞稀释1倍,按2:1添加到淋巴细胞分离液之上, 于18,20oC,2000r/rain离心20min.离心后, 液体分为4层,由上至下依次为血浆,单核细胞, 淋巴细胞分离液,红细胞和粒细胞.单核细胞层较 薄,呈灰白色,用毛细吸管轻轻吸出转移到新的离 心管中,用5倍体积的RPMI一1640依次以2000和 1500r/min离心10min,洗涤两次,去除混杂的血 小板(Feng,1998).重悬细胞,浓度为1×lOs细 胞/mL.台盼兰染色检查细胞活性,活细胞比率在 95%以上用于实验. 1.3.2分离猕猴脾脏淋巴细胞新鲜脾脏取自用 于制药工业的健康猕猴,去除结缔组织和脂肪,用 冷的PBS洗去血液和夹杂物,剪碎脾脏,用毛玻片 研磨,经孔径为80tim不锈钢丝网过滤,收集单核 细胞悬液,1200r/min离心10min,低渗溶血去除 红细胞,用RPMI一1640培养基反复离心洗涤,至细 胞团呈乳白色.重悬细胞,调整浓度为1×lO8细 动物学研究27卷 胞/mL.以上操作细胞均置于0,4oC冰浴中.台 盼兰染色,活细胞比率95%以上用于实验. 1.4免疫兔子 第1组兔子每只耳缘静脉缓慢注射4×10个 人外周血单核细胞,第2组兔子每只耳缘静脉缓慢 注射4X10个猕猴脾淋巴细胞.每7天免疫1次, 连续免疫3次(Jian&Chang,1994;Hoganetal, 1994). 1.5制备补体 5只健康豚鼠,心脏穿刺取血,置4?冰箱1 h,收集析出的血清,混合,每管50分装,一 70?保存. 1.6测定抗体效价 第3次免疫后7d,取少量兔血,采用半微量 细胞毒试验法(Jianetal,1994;Feng,1998)测 定抗体效价.以兔抗人外周血单核细胞免疫血清为 例,检测步骤如下:在96孔板中,每孔加入10L 二倍系列稀释的兔抗人外周血单核细胞免疫血清, .每孔加入10L人外周 每个稀释度做12孔重复 血单核细胞(2×106细胞/mL),振荡混匀.覆盖 石蜡油,以防挥发,于37?培养箱(5%CO2,下 同)中孵育10rain,再加入不同稀释度的补体: 1:10,1:20,1:30和1:40,每孔40L,每个稀释 度3孔重复.同时设3组对照:a.只加人外周血 单核细胞,不加抗体和补体;b.加人外周血单核 细胞,加抗血清,不加补体;C.加人外周血单核 细胞,不加抗血清,加补体,以检测抗血清和补体 有无非特异性毒作用.在37?孵育30min后,每 孔加入20L5%曙红Y孵育10min染色,区分死 细胞和活细胞.每孔加30/zL10%中性福尔马林固 定4h后,Nikon倒置显微镜下观察,死细胞呈暗 红色,无折光性,体积变大;活细胞不着色,折光 性强,大小正常.进行细胞计数,每孔死细胞和活 细胞共计数200个,重复孔取平均值,计算细胞的 死亡率,减去对照a中细胞的自然死亡率,得到相 应抗体一补体毒作用的细胞死亡率.以引起50% 细胞死亡的最大抗血清稀释度作为效价. 同样,从猕猴外周血中分离单核细胞作为靶细 胞检测兔抗猕猴脾脏淋巴细胞免疫血清的效价. 实验重复3次,每次每个浓度做3孔重复. 1.7冻存抗血清 检测效价后发现免疫血清可以裂解细胞,将被 免疫的兔子心脏穿刺取血,分离血清,56?灭活 30min,每管50L分装,一20?冻存. 1.8免疫外科手术法分离人和猕猴胚胎内细胞团 1.8.1胚胎培养34枚临床上淘汰的人类4,8细 胞期胚胎,在G2培养基中培养至囊胚.用激素刺 激猕猴超数排卵,采集体内成熟卵母细胞,或从未 经激素刺激的猕猴卵巢中剥离出卵母细胞,体外培 养成熟;体外受精后,在含20%新生牛血清 (NCS)的mCNRL一1066培养基中发育到囊胚 (Zhengetal,2001a,b,C). 1.8.2裂解滋养层细胞,分离内细胞团19枚人 囊胚和39枚猕猴囊胚,用0.5%protease蛋白酶消 化2,3min后,在预先平衡的DMEM+10%NCS 中洗3次,转到1:20稀释的兔抗人外周血单核细 胞或兔抗猴脾脏淋巴细胞免疫血清中,于37?孵 育30min.在DMEM+10%NCS中充分洗3,5次, 每次5min,转移到1:20稀释的补体中,37?孵 育,5,10min观察一次.统计数据以平均值?标 准误表示,统计分析采用SPSS12.0软件进行LSD 分析,P<0.05限定为差异性显着. 2结果与分析 2.1兔抗人外周血单核细胞和兔抗猕猴脾脏淋巴 细胞免疫血清的效价 兔抗人外周血单核细胞,兔抗猴脾脏淋巴细胞 免疫血清效价和补体最适稀释度测定结果见表1. 兔抗人外周血单核细胞免疫血清在补体的共同 作用下可以裂解人外周血单核细胞,表明所制备的 抗体有效.对照组a,b,C细胞死亡率分别为 (13.0?3.00)%,(13.0?1.2)%和(12.1?3.0)%, 三者无显着差异(P>0.05).所以抗体和补体无 天然毒性. 用半微量细胞毒试验法测定抗体效价时,补体 l:10和1:20稀释,细胞100%死亡;1:30和1:40 稀释时,细胞不能100%死亡,可能是补体稀释度 过高.补体稀释度1:20,兔抗人外周血单核细胞 免疫血清1:320稀释,使过半的细胞死亡[(68.8? 3.8)%一(13.0?3.0)%>50%],故兔抗人外周 血单核细胞免疫血清效价大约是1:320. 补体1:20稀释,以猕猴外周血单核细胞作靶 细胞,设类似的3个对照,测定兔抗猴脾脏细胞免 疫血清的效价,结果如表2所示.兔抗猴脾脏细胞 免疫血清在补体的共同作用下,可以裂解猕猴外周 血单核细胞,对照组a,b和c细胞死亡率无显着 1期张秀珍等:兔抗人外周血单核细胞,兔抗猴脾脏淋巴细胞免疫血清的制备及其 在分离人和猕猴胚胎内细胞团中的应用51 表1不同稀释度的兔抗人外周血单核细胞免疫血清(或兔抗猕猴脾脏淋巴细胞免 疫血清)和补体中人外周血单核细胞 (或猕猴外周血单核细胞)死亡百分率(平均值?标准误) Tab.1rl'hemortalityofhmanormonkeyperipheralbloodmononuclearcells(hPBMCormPB MC)indifferent dilutionofrabbit.anti.humanorrabbit?anti-monkeyantiserumandcomplement(mean? SE.一=3) 补体稀释 Dilutionofcomplement 差异(P>0.05),说明抗体和补体无天然毒作用. 补体1:20稀释,抗体1:640稀释时,细胞死亡过 半[(68.5土4.7)%一(7.1土0.5)%>50%],故 兔抗猴脾脏淋巴细胞免疫血清效价约为1:640. 2.2免疫外科手术法分离出内细胞团 人和猕猴胚胎体外培养7d得到扩张囊胚(图 1:A和D),与补体孵育后,滋养层细胞逐渐膨 大,空泡化(图1:B和E),进而裂解.用玻璃针 吹吸几次,去掉滋养层细胞,得到ICM.所获ICM 用DMEM+10%NCS洗3次后,接种到已准备好的 小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上.3d后,内细胞团 贴附在饲养层上(图1:C和F).采用自制的免疫 血清用免疫外科手术法成功地从15枚人囊胚和33 枚猕猴囊胚中分离出ICM,并用于分离人和猕猴ES 细胞. 3讨论 国内灵长类胚胎干细胞研究进展缓慢,主要是 因为分离胚胎干细胞存在困难.国外分离人或猕猴 胚胎干细胞绝大多数都采用免疫外科手术法,这种 方法可以方便有效地裂解滋养层细胞,分离出内细胞团.国内受免疫血清的限制,多采用机械法分离 内细胞团,内细胞团细胞在培养过程中受到滋养层 细胞的影响而分化丢失,建系难以成功.本实验室 在分离人和猕猴胚胎干细胞实验中发现,机械法不 易获得纯的未分化的胚胎干细胞,因此制备了兔抗 猕猴脾脏淋巴细胞免疫血清,并创造性地用人外周 血单核细胞免疫兔子,制备了其免疫血清.实验表 明这两种免疫血清可以成功地用于分离人和猕猴胚 胎内细胞团,其中使用兔抗人外周血单核细胞免疫 血清分离人胚胎内细胞团,国内外还没有报道. 实验表明所制备的兔抗人外周血单核细胞和兔 抗猕猴脾脏淋巴细胞免疫血清作用于人囊胚和猕猴 囊胚,使其滋养层空泡化进而裂解,与Solter& Knowles(1975)和Handyside&Barton(1977)报 道的免疫血清和补体裂解小鼠囊胚滋养层细胞的结 果一致,可以简便有效地分离胚胎内细胞团.本实 验室成功地建立了免疫外科手术法分离内细胞团, 为进一步分离培养人和猕猴胚胎干细胞奠定了基 础. 人和猕猴在进化上亲缘关系较近,以淋巴细胞 为免疫原制备的多抗可能会有免疫交叉反应,本实 验室以人,猕猴外周血单核细胞作为靶细胞,分别 用兔抗人外周血单核细胞免疫血清,兔抗猕猴脾脏 淋巴细胞免疫血清,辅以补体与之作用,发现两种 免疫血清都可以裂解人和猕猴的外周血单核细胞. l拗.研究奸卷 I免疫外科术法行离^(A—c)邢端撇 FipIIs,:dati,liiirtner?r.llIIILl~hPhJlvinIn~Ll1]l,"rg~rxI'rctnlhtlnl~tlll^ F1蛙l,匏14i and_?I】nkr-1l】一r)hla~lHc A.D:忭讣培壮的链:"}::札l}恤柏I1J.馑越柞l,川地强.:,池汜:L..F:LllJ上陈裂孵的融荐缎 褂刮I.qflllE~01ft:^.1I_c_I,iF50一J?1:l1奇2{Xl…11 HumorblLl^J~l[1lIiIil,rlk,-Yl,Iysl,'n1'tlItII['lll?r'itr,~;TIllcd'lILllk'fhumanhJ…ystslH】andill~rlklbI【YsI#(E undergoiltg'omldemenllYsjt(?r-mIIn1[rind[FINrlllhlt~,lhumal~l(:,;Lnlll_?…k'Y,f】州一1v…ttlht~hcIlntkem1)ryonictl l1n'I【l:ell~B:{A.I)E.r15(1…?:1l】J2001 同时用种免疫10l清辅以补体与小鼠囊仵加,术 发现裂解作用(结果术显求)f『.能址人羽f称缬.J 小鼠的亲缘关系远.其免疫m消与小鼠胚胎滋养层 细胞无免疫交叉反应.我仃J成功建立丁猕弦免疫外 参考文献 C…CA.I'dlmanskuy~,lM?.dl{)lIJ^IILII~LIJ.wilinyer『.,ker JP.W仰S,??CC.M(Mdlillrl^P1I1).MlIon,I 2(ml~'eri~ati,IrIclrEmbmmii,leNI-liHnllI_ ysts\,E{ied350:,353I356 Feng1998Jl~lateimnmn…v…rl(1bi'IdLhLirtimeE??11.,I lr1.州lfX.ZhIIR151l,nhm're,hr,I1--inlImnUrl~l-IMl Wuhan:Hubei5t,iemjlJJtliidlmgl.28g 327t砷I998也蛙的离.J曲能托翔j皑:洗置 心.披瞵碰f证崆.:耍螗姓术|t阪删J科牲水 .288327 Hamlvside^I{.RnIinS(.1977Ewduat?iiiflIll,~hni小?lIII一 !…urk'hI'"Lati"',r1?l,I"ll?…fn,1?n1f?_^l,l1'''. 【】JErn&~-fF,1f?37:2l7—22fi Eq~anl{,rillviil978a,一…l_vl{?'l1ItitllltunertE?llIlla'lis-i J?tn1l】nn?nrlRurlallI'ni[11…Js..hIl-,,_,:IIn『ier?llm.' slninl35duv"lJ,lt(?lTIInbaui{liar24hllefi~rlin. round.urger?…Jl^mlfErp,ltor/-.45:qln5 H1anB..rill?,RI8b.llsrsdev,[olmterll-Il__l?c1elJi(11…. 1aIlInIln1.n'u咄ludlyfn…1IJuIll?vNI:IIlmi?(一linn. 曙from5一h14O-,la~Ill,l~hx【J』?nr.4E.tp .rJ.d5:lm—I2l Hogan13.Rigidill~,'h:,riflh1inir.bI,】994f?IIr……l?一 科丁术法,J,tEn,j-血发现兔抗人外周m单核细胞免疫 m清可n?分离猕猴胍胎f细胞.解决商品化的称 黻免疫消较少II,:Jf-]题.促进猕擞胚胎细胞的分 离连系 l一Tlll1pl,inqIanhtlionemlIrllAIn:M?~ulNingEhbl~se ?iryil.Ir……Ii?1lM1.Il1邙n『igH~lmr?'JI~lllfng Hatt~r【_IIHttfllln.190—2J6 I『0gW1.}{uYJ.PurkJH.PkF:STeeEGKoo』M.JP?mH,, ll{L:.h…,SK.KimSJ,^hnr:.I1wdnJHrkKY.Cibelli 】B.M—ili[iY2{X]4E川{_?_L_.-I口iihJfi[iotenlhuman~imhp/nni~? twlI?ellliilld…llnl…1Iom~llIllIf??【ll5rt….303: 】6fi9l674 IY01.t:han~z:xJIuI1h,-IH?ofinlntunog~,ryIheiso— I?IIiliIlliiiiiIrl?lI……It,…}ll[1IlliiystsAIn:JianY9L. 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