小鼠卵巢异体移植后卵泡及卵母细胞发育研究

小鼠卵巢异体移植后卵泡及卵母细胞发育研究 . : .. : , 本项研究受下列基金资助 .国家自然科学基金项目编号:。 .国家高技术研究发展计划项目编号:。 。峰: .. .. . . . ????????????????????????????????????............一独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成 果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人 已经发 或撰写过的研究成果,也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学 位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 时间: 函。年月日 研究生签名:?二季?浆 关于论文使用的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅,可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 时间: 研究生签名:』查叠乏妾 加。年 月弓日 时间:为懈‘月『; 导师签名:二馋兽一摘 要 本研究是以日龄小鼠为卵巢移植供体卵巢上主要是一些原始卵泡和初级卵 泡,.周龄具有免疫力的成年去势公鼠作为卵巢移植受体。将日龄小鼠卵巢移 植到具有免疫力的去势公鼠背部肌肉后,通过给予受体鼠免疫抑制剂处理后。观察卵 巢异体移植后移植体存活及其卵泡和卵母细胞的发育状况;检测卵巢移植给去势公鼠 后移植体能否发挥内分泌功能;探讨在免疫功能健全的动物体内进行卵巢移植的可能 性,为该项技术的临床应用提供参考。 针对本试验的研究目的,目前开展了如下试验内容: 内容一、卵巢移植后,通过对试验组受体鼠实施免疫抑制剂处理,与对照组未 经免疫抑制剂处理相比,观察移植体直径、回收率以及移植体周围新生血管网的建 立,判断免疫抑制剂是否能够减缓卵巢移植受体对移植体的免疫排斥。结果发现卵巢 移植过程中,免疫抑制剂可以降低受体对移植体的免疫排斥。 内容二、卵巢移植 后,通过对移植体、日龄小鼠卵巢以及日龄小鼠卵 巢进行苏木精.伊红染色染色,对比观察移植体上卵泡的发育状况、卵泡数变 化以及卵泡凋亡情况。结果发现移植体上卵泡大量丢失,移植体上主要是一些原始卵 泡及有腔卵泡,而初级卵泡和腔前卵泡数相对较少,与对照组相比,差异显著。 内容三、卵巢移植 后,通过对移植体、同龄小鼠卵巢以及日龄小鼠卵 巢进行细胞凋亡染色染色,对比观察移植体上卵泡凋亡情况。结果发现移 植体上各个发育阶段的卵泡均有凋亡发生,特别是一些原始卵泡及初级卵泡凋亡现象 较为严重,然而,在日龄小鼠卵巢上对照组,主要是一些较高级发育阶段的 有腔卵泡发生凋亡。 内容四、为了观察免疫抑制剂处理的去势公鼠体内移植体、卵泡以及卵母细胞继 续发育情况,将卵巢移植后移植体发育时间延长到 ,组织学观察移植受体内卵泡 以及卵母细胞发育状况,结果发现移植体仍然能够存活,并且从移植体上回收到了卵 丘.卵母细胞复合体。 内容五、卵巢移植 后,将从移植体上回收到的卵母细胞经体外成熟及体外 受精后,观察其体外继续发育能力。结果发现.%的受精胚胎能够正常发生卵裂、 .%的早期胚胎能够发育到囊胚阶段,通过给只假孕母鼠进行胚胎移植后,只 母鼠获得了妊娠并最终生下只活的幼仔。 内容六、卵巢移植 后,通过激素检测观察受体鼠性激素的变化,发现雌激 素和孕酮水平均明显升高,与对照组相比,差异极显著。综上所述,本试验首次尝试将日龄小鼠卵巢移植给免疫功能完整的成年去势 公鼠后,通过回收移植体卵母细胞进行体外成熟、体外受精以及胚胎移植等试验,成 功的获得了小鼠后代,充分了移植卵巢能够在去势公鼠体内存活。组织学观察显 示移植体上卵泡及卵母细胞能够继续发育。并且发现了卵巢异体移植后受体 内性激素 的变化情况,提示卵巢异体移植后,或许能够在异体内重塑生殖内分泌轴。这 些结果 无论是在研究卵泡及卵母细胞体外发育机理,还是在人类医学临床卵巢移植 研究中以 及家畜优良品种保护方面都提供了重要的参考。 关键词:卵巢异体移植,卵泡,卵母细胞发育,小鼠, , . ,?., , ; . ?, . , , . ., . ,. 句 . . . ,., . 一 . , , . . , . , . ?,, ? . .. ? .%.%, ,弱 ,. . , ,. ,,.?.. , .,,. : ,, , 目 录 摘 要??..?..?.?.?.?.??.?...?.?.??.?..??.??.??.....?.?.?.?..... 插图和附表清单. 缩略词表? 文献综述? 引 言??. 材料和方法 .试验试剂与仪器..主要试剂?. ..主要仪器?. ..试剂配制?. .试验动物.试验内容?.. ..卵巢移植后,观察移植体存活情况..卵巢移植后,观察移植体上卵泡的发 育状况.. ..卵巢移植后,观察移植体上卵泡的凋亡状况? ..观察移植受体内卵泡及卵母细胞继续发育潜能??.. ..观察从移植体上回收到的卵母细胞体外发育能力?。 ..观察卵巢移植后受体鼠内分泌变化?.. .试验方法?。 ..移植受体与供体准备..卵巢异体移植..免疫抑制剂处理? ..外源促性腺激素处理..卵巢组织染色 ..卵巢组织染色? ..卵母细胞回收与体外成熟 ..体外受精与胚胎培养..胚胎移植? ..激素检测? ..统计分析结 果? .移植体生长发育?.. ..免疫抑制剂处理组移植体生长发育情况 ..未实施免疫抑制剂处理组移植体生长发育情况 .移植体染色分析??.. .移植体染色分析? .移植体内卵泡及卵母细胞发育情况??.. .移植体的卵母细胞体外发育情况.. .激素检测分析结果. 讨论?。 .卵巢存活及血管重建??. .免疫抑制剂的使用。 .移植体卵泡及卵母细胞发育??.. .移植体卵泡丢失?.. .卵巢移植后受体鼠内分泌变化?. 结 论. 参考文献.. 附录? 致谢? 个人简介..插图和附表清单 图卵巢在位移植与异位移植. 表卵巢移植影响因素??一 表卵巢移植在人类临床上的成功应用??一 图胚胎移植 图卵巢移植 后,移植体发育与血管再生 图卵巢移植后未实施免疫抑制处理,移植体发育状况? 表卵巢移植 后,移植体回收数目及直径变化.. 图卵巢移植 后,移植体的组织学观察.:?. 表卵巢移植 后,移植体上卵泡数目及卵泡密度的变化? 图卵巢移植 后,移植体上卵泡凋亡情况?. 图卵巢移植 后,移植受体内卵泡及卵母细胞发育.. 图卵巢移植 后,得到的胚胎及幼鼠. 表卵巢移植 后,移植体的卵母细胞体外发育能力. 表卵巢移植 后,受体鼠体内性激素变化?. 图卵巢移植 后,受体鼠体内性激素变化?. 图卵巢移植后,受体鼠内雌激素合成的可能机制图卵巢移植后,受体鼠内雄 激素合成的可能机制附表 体外受精液配制 附表 胚胎培养液配制缩略词表 缩略词 英文全称 中文 雌激素 孕酮 睾酮 ? 国际单位 ? /体外培养 人输卵管液 /体外受精 /体外成熟 胎牛血清 表皮生长因子 磷酸缓冲液 必需氨基酸 .非必需氨基酸 卵丘一卵母细胞复合体 人绒毛膜促性腺激素促卵泡激素每分钟转数孕马血清促性腺激素 培养液钾离子优化培养基 苏木精.伊红染色脱氧核糖核酸转移酶 死讯匠已末端标记文献综述 卵巢移植研究进展 一个世纪以前,人们就想过能否将卵巢异体移植给已失去生殖能力的妇女, 以使她们重新获得生殖能力。于是人们利用动物模型做了大量关于卵巢移植的 研究。早在年,法国学者 将兔卵巢移植到受体动物的腹腔,可惜 在这次试验中他并没有获得成功。而年后,澳大利亚学者以及他 的助手 重复了的试验,幸运的是他们发现异体移植后的两 个卵巢,其中一个存活,这个结果在当时已经掀起了较大的轰动,同时也拉开 了内分泌学研究的序幕那时还没有出现激素检测手段。 卵巢或卵巢组织移植分为自体移植、异体移植、异种移植。自体移植又分为在位 移植、异位移植,早期研究主要是证实能否通过卵巢在位移植治愈不育妇女以及恢复 卵巢内分泌功能。年,一直致力于研究内分泌腺内分泌功能的 毕业于哥伦比亚大学,曾经成功移植过甲状腺,并在当时的研究中首次 提出了“ ”,即被后来人们所接受的概念“ 后来他 在人类医学临床方面又开展了大量的关于卵巢移植研究工作,当时他已成功的 将人卵巢自体在位移植到妇女子宫及输卵管等部位,并且获得了后代图,左。 但是在此后的一段时间以及第二次世界大战期间,以及一些研究者的成 果遭到了质疑,即所谓的“ 。这些质疑声也由此催生 了卵巢组织异位移植的出现,然而由于当时还没有出现体外受精 ,等辅助生殖技术,所以此后相当一段时间内,卵巢异位移植 研究进展缓慢包括腹直肌、网膜、输卵管、子宫、乳房、肾包膜以及皮下。 且这些工作主要是研究卵巢的内分泌功能及病理发生,包括卵巢老龄化、血管 发生、冷冻保存、黄体溶解、神经支配、性别分化、性激素分泌、肿瘤发生以 及卵巢移植在濒危物种保护中的应用。然而那时卵巢异位移植研究利用的受体 主要是其自身,或者是一些近交系小鼠以及大鼠,目的是避免受体对移植卵巢 的免疫排斥。自世纪年代以来,已经陆续在至少个物种体内开展了关 于卵巢异位移植的研究,其中包括啮齿类动物、家畜、灵长类动物。并且都有 报道成功的案例,其成功率受到诸多因素的影响表。 虽然卵巢或卵巢组织移植在人类医学研究和人医临床上较早受到重视,且近年 来,关于卵巢移植的研究取得了许多重要进展,尤其是卵巢移植与显微外科技术、超 低温冷冻保存技术结合以后。并且在家畜研究方面,也有关于卵巢移植的报道,但是 其中还存在着一些关键限制因素。为了全面了解卵巢移植研究以及能够页;的开展卵巢移植试验,现将主要从以下个方面来阐述近年来卵巢移植研究进展: 一、卵巢组织移植概况 由于哺乳动物胎儿时期以及啮齿类动物卵巢个体较小,可以实施卵巢整体移植或 者卵巢组织移植,卵巢组织移植的具体做法是将卵巢皮质从髓质上剥离下来,切成. 大小的卵巢碎片,移植到皮下、卵巢囊以及肾包膜,当时这些移植部位被认为是 可以缩短卵巢血管重建所需时间间隔,从而降低了缺血损伤对移植卵巢的影响。此前 研究表明在移植卵巢血管化的过程中此过程大概需要. ,已经有超过%的原 始卵泡以及几乎所有的生长卵泡丢失了‘】,抗氧化保护剂或许可以降低组织体外氧 化,从而可以减少卵泡丢失【】。后来人们又发现血管生成因子丰富的组织及肉芽组织 是卵巢移植的理想部位,虽然卵巢或卵巢组织移植到这些部位后仍然有卵泡丢失, 但是也有一些研究发现新鲜或者冻融的卵巢组织移植后,受体动物能够表现出正常的 生殖周期’。据推测这些成功的例子可能是由于原始卵泡个体较小,位于卵巢表面, 且原始卵泡代谢率比生长卵泡低,使得原始卵泡能够更好的存活【引。虽然在卵巢移植 后一周内,大量生长卵泡发生丢失,导致移植受体内雌激素水平迅速下降,但是卵巢 组织上存活的原始卵泡能够不断得到募集。可能是因为移植受体内不断升高的水 平能够刺激原始卵泡进一步发育及分泌雌激素,从而表现出在卵巢移植后一段时间 内,移植受体内雌激素水平又逐渐升高以及阴道黏膜细胞恢复周期性角质化活动,移 植卵巢上各个发育阶段的卵泡数又呈现出正常金字塔模型,且移植后的卵巢组织仍然 具有正常的组织结构【。并且发现幼年动物卵巢或卵巢组织移植后,其能够维持更长 时间的功能性作用。但是对于一些大动物,其卵巢整体异位移植后,卵巢周围不太容 易重新建立血管网,从而导致移植卵巢上更多的卵泡发生丢失,于是人们就想到了是 否可以在卵巢移植时进行血管吻合。 二、卵巢整体移植、血管吻合 在体型较大的家畜及人类,由于其卵巢个体较大,卵巢移植不经血管吻合的主要 缺点是卵巢因缺血损伤而导致大量卵泡丢失【】。年,当时在洛克菲勒研究所的 血管研究学专家 在一次报告中称他曾经将猫的整个卵巢连同动脉一起移 植给受体动物,可惜他并没有继续观察移植后卵巢的最终命运。而是将研究注意力集 中在了其他器官外科血管吻合技术的探索,并且在年,因其在器官移植 中血管吻合的独创性成就获得了诺贝尔医学奖。这也是历史上卵巢移植与诺贝尔奖的 一次擦肩而过当时是一位非常有名气的外科医生,在血管吻合技术方面具有 很高的造诣,正是如此,他并没有把许多注意力放在探索移植卵巢及卵泡的发育。因 此后来学者认为年是卵巢移植历史上最值得纪念的一年。随后人们又在试验动 物体内开展了大量的卵巢连同子宫一起进行血管吻合移植,并且率先在狗体内获得了 成功。后来在大家畜及人卵巢移植方面也开展了一些研究,如年,等把 羊的整个卵巢通过外科手术自体异位移植到颈静脉周围,从而可以方便的从颈静脉采 集血液进行激素检测【】。年等把一位岁患有膈下恶性肉芽肿女孩 的左侧卵巢移植到其胳膊皮下组织内,右侧卵巢连同血管一起移植到腹膜腔内,目的 是减轻临床放疗对卵巢的损伤,结果发现患者仍有正常的月经周期,并且移植到其胳 膊上的卵巢活动还能够表现出与胳膊部位体温变化的一致性,推测可能有黄体细胞的 生长,并且移植体上获得的次级卵母细胞能够被激活【。可惜当时的试验中,由于诸 多限制因素的影响,他们并没有继续深入开展卵母细胞受精等胚胎发育方面的研究。 当时人们认为这种方法或许可以解决输卵管堵塞造成的不孕【?。但是这种想法很快就 被和 等人年提出的辅助生殖技术取代了。 近年来,随着卵巢或卵巢组织冷冻研究的不断开展,许多学者已经将卵巢移植技术与 卵巢或卵巢组织低温保存技术结合起来【.】。起初研究者在动物体内试想通 过利用冻 融的卵巢实行血管吻合自体移植,以使得卵巢重新恢复内分泌及生殖功能,并且也有 成功的报道称在卵巢移植后.年内,卵巢能够恢复内分泌功能以及产生正常发育的 卵母细胞【引。但是在实际临床应用中却受到了诸多因素的限制,如血管吻合要求较高 的外科手术技术、虽然血管吻合技术能够使移植后的卵巢快速得到供血而不至于大量 卵泡发生丢失,但是在卵巢移植后的一段相当长的时间内,血管吻合却增加了移植卵 知 巢的血管形成血栓的风斛啦。 三、卵巢异体移植、异种移植与免疫耐受性 年,和等通过在大鼠和猴体内开展的一系列研究表明卵巢自 体移植比异体移植更具有可行性主要是自体移植可以解决免疫排斥的影响。但是 他们的结论很快就遭到了许多学者的反对。年,和等声称通 过观察比较卵巢组织异体移植与皮肤异体移植后,受到移植受体免疫排斥反应的不 同,发现卵巢异体移植本身不会引起机体产生排斥反应。以及年,等 研究发现卵巢异体移植后,卵巢组织能够存活数周甚至数月。他们认为卵巢 是一种 无组织抗原性的组织器官,与皮肤、肝脏相比,卵巢组织内抗原呈递细胞数极少,并 且认为卵巢异体移植后,移植体具有较强的免疫耐受性。同样他们的理论很快就被 和以及后来的一些研究推翻了,通过大量的研究发 现卵巢异体移植后,免疫抑制治疗是很有必要的,如环孢菌素和类固醇激素联合 使用【,。虽然在同一品种之间实施卵巢移植,卵巢存活率相对较耐。但是在异 体或者异种动物之间进行卵巢移植,即使是体液中细胞的数量很少,不同组织相容性抗原之间的免疫耐受力仍然很低。如果移植受体与供体之间没有遗传相关性, 或者移植受体免疫系统仍然具有免疫力,卵巢移植后一周内,移植卵巢周围就会出现 大量的白细胞浸润现象且移植体受到强烈的免疫排斥。目前研究认为卵巢异体移植过 程中,无论是否进行血管吻合,都需要适当的免疫抑制辅助治疗【。并且发现异体 或者异种移植的卵巢可以在免疫缺陷动物体内存活和继续发育,如鼠、裸斜, 。此前研究把猫、羊以及人的卵巢组织移植到免疫缺陷鼠肾包膜下,已经成功获得 了继续生长发育的卵泡【?。虽然移植后的羊和人卵巢上继续发育的卵泡大小还没有报 道称超过 ,也就是说还没有能够发育到完全成熟阶段,但是这并不会影响卵巢 异体或者异种移植的可行性【。】。如等就成功的把从异种移植卵巢上获得的未 成熟的卵母细胞经过体外成熟 ,?、体外受精,最终 通过胚胎移植成功得到了动物的后代【。虽然异体移植、异种移植后的卵巢或卵巢组 织在移植受体内会受到免疫排斥的影响,但是卵巢异体或异种移植在人类医学临床上 还具有一定的应用情景。如将来或许可以考虑通过卵巢异体在位移植治疗不育妇女; 以及在年轻妇女腹腔器官肿瘤治愈之前,或许可以通过将其卵巢或卵巢组织异体、异 种移植给中间受体在伦理道德允许的情况下,以便于保存患病妇女卵巢的生殖内 分泌功能【’】,并且还可以进一步认识卵巢上卵泡及卵母细胞体外发育的机理。尤其 是在病理状态下,对于认识一些生殖疾病如多囊卵巢综合症和卵巢癌的发病机理 和治疗对策具有重要作用。 四、卵巢冷冻、生殖能力保存 随着卵巢冷冻技术的探索以及国外某些卵巢冷冻资源库的建立,并且卵巢冷冻技 术有望能够更长时间的保存卵巢组织甚至卵巢,但是目前卵巢冷冻主要是冷冻卵巢皮 质因为如果对整个卵巢连同血管进行冷冻保存,卵巢血管在冷冻过程中会受到损伤, 再通过血管吻合移植后,其血管会发生血栓【。卵巢皮质冷冻保存一段时间后, 再通过卵巢移植技术将体外保存的卵巢皮质在位移植给癌症患者,被认为是不育妇女 重新获得生殖能力的希望。自年以来,英国的等人用%的甘油作为冷 冻保护剂,以及后来的等成功利用冻融的卵巢组织移植后获得了动物后代【删。 然而由于当时该技术还没有被广泛的应用于临床治疗,再加上当时卵巢冷冻技术发展 缓慢和不成熟,直到以后,随着自动化程序冷冻仪以及不断更新的冷冻保护剂 的出现【如二甲基亚砜、丙二醇、乙二醇,而且近年来癌症患者平均年龄的年轻 化,人们逐渐意识到卵巢冷冻保存、卵巢移植技术对于使年轻女癌症患者重新获得生 殖能力的重要性。况且此后大量研究已经证明了大动物体内自体移植的冻融卵巢组织 完全能够使得该动物重新获得生殖能力【,,铷】。以及等研究也发现了 利用大动物卵巢组织冷冻的技术方法同样适用于人类卵巢组织冷冻【,,。就目前 来说,卵母细胞冷冻后的效果还不是很好,然而卵巢冷冻及移植技术的不断发展或许 会为卵巢及人类生殖功能的保存提供坚实的基础。目前某些血液学及肿瘤病学等研究 机构已经逐渐的开展了一些试图为患有癌症的年轻患者年龄岁建立卵巢保 存库的研究,特别是那些暂时还没有生育的、癌症正处在转移瘤低发阶段的年轻女患 者,卵巢冷冻及移植技术有望能够在其癌症治愈后使其重新获得生育能力【。 年,世界上第一例卵巢组织冷冻及卵巢移植技术在一位女性癌症患者身上得到了应用 冻融后的卵巢皮质移植到卵巢髓质上,并且成功诞生了自己的后代【蚓。目前世界 上已经有名孩子是通过此种方法得到的表,同时也使即将破裂的个家庭重 新获得了幸福和希望。然而科学总是在不断证实许许多多的疑问中得到发展的,同样 虽然这些技术冻融卵巢皮质移植到卵巢髓质上已经成功的在人类临床上得到了应 用,但是现代这些技术仍然摆脱不了那个年代提出的“ ”的质疑。这也孕育着一项新的卵巢移植技术的出现。 卵巢异位移植正是由于其临床手术操作较为简单,卵巢移植后,便于在移植部位 随时观察卵巢及卵泡的发育状况,以及卵母细胞便于回收进行体外受精等优点外 【孓,不,更重要的是它能够解决卵巢组织在位移植带来“ ”的 困扰,而且还可以避免在医学临床上治疗腹腔器官肿瘤的过程中,放疗对腹腔卵巢的 损伤。虽然迄今为止,卵巢组织异位移植还处于研究摸索阶段,在某些动物体内仅仅 得到了一些早期发育的胚胎【’引,但是也有一些成功的例子,如年等人把 灵长类猴的新鲜卵巢组织自体移植到其胳膊肌肉、腹部皮下组织等部位后,已经成功 的获得了生长发育的卵母细胞并且通过等技术得到了一只健康体格的小猴【, 该研究的成果发表在当年国际权威性期刊杂志上图,右,并且作为封面 文章。然而在卵巢组织异位移植过程中,即使通过注射外源促性腺激素促进移植卵巢 上卵泡进一步发育以及调动移植受体内血管生成因子的活动,也不可避免卵巢组织异 位移植后因急性缺血损伤造成大量卵泡的丢失。所以目前很多研究的注意力都是在寻 找最佳的移植部位以有利于移植卵巢在很短的时间内重新建立血管网,另外由于卵巢 冷冻保存对卵巢上卵泡的发育也有一定的影响。目前研究正在试图利用玻璃化冷冻来 改善卵巢冷冻对卵泡发育的负面影响,与以前程序化冷冻相比,玻璃化冷冻可以避免 在冷冻细胞内及细胞外基质形成冰晶,但是却要求较高浓度的冷冻保护剂,然而这些 高浓度的冷冻保护剂对细胞又具有较高的毒性唧】。现如今,玻璃化冷冻保存卵巢已经 在种动物体内做了相关研究,目前已在小鼠和羊体内成功的利用该技术获得了妊娠 后代,,。 五、卵巢移植在畜牧业生产中的潜在应用情景 在畜牧业生产上,卵巢或卵巢组织移植同样具有重要意义,因为良种家畜的推广 一直是畜牧业生产努力的目标,而且在传统家畜遗传育种的基础上,扩繁是推广良种 的有效途径。扩繁中制约因素是良种母畜的开发利用,因为受妊娠时长和繁殖年龄的 限制,良种母畜自身能产下良种后代的数量十分有限。另一方面,众所周知,按照经 典的繁殖理论,一头家畜在出生时卵巢上大概有上百万个原始卵泡,理论上能产生上 百万个卵母细胞,应用潜力十分可观。即是说,母畜一生中绝大部分卵泡的卵母细胞 都没有实现生殖。目前对卵巢上卵母细胞资源利用的主要方法是超数排卵,再结合体 外受精和胚胎移植等技术,可以实现良种的扩繁。近年来,这套技术已经在生产上初 步展显出作用。每一种技术都不是万能的,必须承认超排技术也存在一些缺憾。首先 是其得到可用卵的数量有限。以牛为例,现在国际公认的水平大概是枚左右的可 用卵,而其余的卵质量低下。这主要是因为超排中使用的促性腺激素通常只能使发育 到一定阶段的卵泡继续发育成熟,而对于更早期的卵泡,由于尚缺乏促性腺激素受体 而不敏感。第二,重复超排的效果有限。第三,对良种自身的刺激作用。第四,对多 胎动物如猪,超排的效果不理想。在超排技术应用的同时,完全可以寻求其它利 用卵巢上卵泡资源的方法。而将中间动物作为载体,是一种既传统又具有活力的方法, 比如卵巢移植,即是将家畜的卵巢移植给饲养成本较低的试验动物,获得具有发育能 力的卵母细胞。这也是目前努力探索卵巢组织异体或异种移植的原因所在。并且已经 有了一些初步进展,如等年在羊体内进行了初步探索性的研究【;在 牛上将牛卵巢组织移植给免疫缺陷鼠后获得了继续发育的卵泡和卵母细胞【彤】;在猪 上有将新生猪卵巢移植给免疫缺陷鼠的报道,发现有原始卵泡存活了个月而未发育 ‘,但也有学者通过研究发现猪卵巢组织移植后卵巢上有原始卵泡发育】。另一方 面,在畜牧业生产实践中,良种经常会遇到意外受伤、疾病影响等情况,结果导致母 畜运动受限、健康下降,甚至生命危险。本来是很好的良种,可能就不再适合继续繁 育。但其优良的遗传资源仍保留在卵巢上。另外如去势和屠宰也会产生一些卵巢。如 果能建立一种动物模型,将这些卵巢或卵巢组织移植给中间动物,如小鼠,继续利用 这些种质资源,对于畜牧业生产显然有积极的作用。而且出于同样的原因, 对于野生 动物【、特种经济动物【】、家养宠物【等濒危物种保护方面也具有特殊的意义。 六、展望 然而,科学技术是一个不断要求探索、创新与进步的,这其中包括旧的技术退出 历史舞台,新的技术应运而生。现今的卵巢移植也有可能终究一天会被更具有活力的、 新兴的组织保存技术所取代,然而所有的技术都是短暂而在当时又都具有应用情景 的,比如将来某天卵巢移植也有可能会被冻融后的卵巢及卵泡培养技术所取代【, 理论上还可以避免癌症患者癌细胞再度转移的危险。然而不管怎样,现阶段甚至是将 来,无论是在临床医学还是科学研究方面,目前的卵巢移植技术在现阶段甚至是将来 都将发挥不可替代的作用。 氅塑竺笠篓塑竺兰兰 嘲 。 “ “ 々 黧麓謦最浚麓?一??? ?自??, ?一?一 ?’?‘“一 ?。,??”。“”?‘?.,“??一?,?自一自一???一??一‘?? 一 ?~?‘?’一?一熏避一~。强;羹 蚕辫赣麓囊 图卵巢在位移植与异位移植 . 图左,人卵巢皮质在位移植模式图;图右卵巢异位移植在灵长类动物上的成 功应用。 .硪,,,:.; .,. 表卵巢移植影响因素 . .供体年龄 .受体年龄/性别/ .移植部位 .免疫相容性 .原始卵泡数 .氧敏感的物种差异性 鹤 / .组织块/皮质厚度 .冷冻/玻璃化冷冻/ .缺时间 / 表卵巢移植在人类临床上的成功应用 . 研究论文 引 言 卵巢是重要的生殖和内分泌器官,对于生殖和维持正常第二性征都起着重要的作 用。目前卵巢移植研究已经取得了阶段性的进展,研究发现,动物卵巢移植后,能够 恢复生殖和内分泌功斛,,,。在人医临床上卵巢移植已经有很多实际应用【,, ?,】,并且已经成功使得癌症患者重新获得了生殖能力。移植的卵巢不仅在同性体内 能够发育,而且在异性体内或异种动物体内也能够生长发育。等 将周龄小鼠卵巢移植到未去势雄性大鼠的肾包膜下,从移植体中获得的卵母细胞经 体外受精和胚胎移植后得到了小鼠后代,并且发现卵巢移植到异种动物甚至是雄性动 物体内仍然能够继续获得生长发育的卵泡及卵母细胞【。移植的妇女卵巢可以在雌雄 小鼠体内存活及生长【.】、将冻融的猪卵巢组织移植到免疫缺陷雄性小鼠体内,发现 原始卵泡能够继续发育到次级卵洲。还有研究表明公鼠体内环境可能更有利于移植 卵巢上卵泡的发育【,并且年等已经成功的将小鼠卵巢移植给未去 势公鼠后,通过生物技术等手段获得了小鼠后代【引,直接的证明了卵泡及卵母细胞在 雄性激素环境下能够发育。然而.等研究发现虽然未去势公鼠体内 移植的卵巢存活能力比去势公鼠好,但是卵巢移植后去势公鼠体内及未去势公鼠体内 雌激素水平上升都不明剧拶,表明卵巢移植给公鼠后虽然能够得到生长发育的卵母细 胞,但是移植的卵巢或许不能够发挥内分泌功能,以及去势公鼠体内性激素环境可能 不利于卵泡及卵母细胞发育。 自年以来,等研究发现卵巢异体移植后,适当的免疫抑制剂处理对 于卵巢存活是必要的,例如环孢菌素和类固醇激素联合使用。并且发现如果卵巢 移植受体与供体遗传存在差异性,或者移植受体的免疫功能仍然健全,卵巢移植后一 周内,卵巢周围会出现大量的白细胞浸润现象以及受到强烈的免疫排斥,还发现卵巢 组织异体移植免疫耐受性不会在品种间得到诱导【】。因为在免疫功能健全的动物之 间进行卵巢异体移植,免疫排斥是不可能避免的,所以为了便于开展研究,迄今大量 的卵巢异体移植试验都是采用免疫缺陷鼠或者近交系小鼠作为卵巢移植受体,目的是 为了降低卵巢移植后的免疫排斥反应裸鼠或者是鼠体内缺乏成熟的淋巴细 胞和淋巴细胞【『’赃。但是免疫缺陷鼠要求较高的饲养条件和成本,并且其实际 应用范围较窄,而普通小鼠的饲养条件和成本较低,且应用范围较广。虽然以前有人 将卵巢或者睾丸组织移植给兔、大鼠、狗后,采用免疫抑制剂处理,取得了成功【孓盯】, 但却很少有将卵巢移植到免疫功能完整的普通小鼠体内的研究报道。以普通小鼠为动 物模型,开展卵巢异体移植研究,对于探索卵巢移植技术的临床应用以及对优良家畜 品种保护都具有重要的参考价值。 目前,卵巢移植中值得关注的重要问题是如何在移植体周围快速建立血管网以满 足移植后卵巢发育的血液供给,以及如何提高移植体上卵泡及卵母细胞的数量和质量 等。血管网的建立与卵巢的移植部位有关,这就要求卵巢所移植的部位不仅要考虑便 于手术操作,更重要的是要考虑该部位能够加速移植体周围血管化。大量的研究证实, 肾包膜、皮下和肌肉内移植卵巢都能够获得生长发育的卵泡【,。】。相对而言,肾 包膜下卵巢移植对手术操作要求较高,卵巢发育不易观察,而皮下卵巢移植则易于观 察,但皮下组织内缺乏血管周细胞,移植体周围快速血管化难以建立【叼。另外,皮 下移植容易受到温度和外界大气压力的影响,限制了移植体上卵泡和卵母细胞的进一 步发育。最近有研究发现将小鼠卵巢组织移植到同性小鼠臀部预先处理的肉芽组织 内,获得了生长发育的卵涮。也有人把小鼠和人的卵巢组织移植到雌性小鼠背部肌 肉组织内,在卵巢周围能够快速建立血管网并且获得了生长发育的卵泡【,。还 有研究者将人卵巢组织移植到小鼠的颈部肌肉中,周后仍检测到存活的卵泡【。 这些结果提示,肌肉可以作为卵巢移植目的部位,且目前这种认识已经被广泛接受。 卵泡及卵母细胞的发育涉及到内分泌调节问题。众所周知,卵泡及卵母细胞的生 长发育主要受促性腺激素调节,所以移植后的卵巢中能否有卵泡及卵母细胞发育,关 键决定于是否有足够的促性腺激素刺激。此前有研究报道称把卵巢移植到雌雄小鼠体 内后,采用外源促性腺激素处理能够明显的提高卵泡存活力,以及改善卵母细胞体外 成熟及胚胎早期发育的能力【,,叫。 综上所述,卵巢异体移植能否成功,一是要保证移植组织的存活,即移植后的卵 巢能与其周围组织快速建立血管网以满足其血液供给,且不被免疫排斥;二是要重新 建立生殖内分泌调节机制,以刺激卵泡及卵母细胞的生长发育。尽管许多研究者在这 些方面已进行了大量的研究,取得了长足的进展,但仍有大量的问题未能解决。具体 问题如下:一,能否使用免疫功能完整动物作为卵巢移植受体。二,众所周知,在同 性小鼠之间进行卵巢移植时,为了能够使移植卵巢重新建立生殖轴,都是将雌性小鼠 进行去势处理。那么睾丸同样作为雄性动物生殖轴的重要组成部分,睾丸的存在是否 也会影响卵巢移植后异性体内重新建立生殖轴进而影响卵巢发挥内分泌功 能。三,卵 巢移植到公鼠体内,其体内性激素水平会如何变化。然而雄性动物睾丸作为产生雄激 素的主要部位,它的存在势必会影响移植受体内激素的检测。这也是本试验使用去势 公鼠作为卵巢移植受体的原因所在。 本试验首次采用免疫功能健全的成年去势公鼠作为卵巢移植受体,进行卵巢异体 移植试验,观察去势公鼠体内移植体存活及其卵泡和卵母细胞的发育状况;以及观察 卵巢移植给去势公鼠后移植体能否发挥内分泌功能;探讨在免疫功能健全的动物体内 进行卵巢移植的可能性及有关条件,为该项技术的临床应用提供参考。 材料和方法 .试验试剂与仪器 ..主要试剂 本试验过程用到的主要试剂如下: 氯化钙,, 碳酸氢钠,, 牛血清白蛋白,, 青霉素钠 ,,. 丙酮酸钠 ,, 链霉素 ,, ,, 环孢菌素 硫唑嘌呤,, 强的松,浙江仙琚制药厂 维生素 ,, ? , 一 .% , ;,北京 , ,,中国科学院动物研究所 促卵泡激素 ,,? 培养液 人绒毛膜促性腺激素 ,;宁波第二激素厂 / .;, 凋亡检测试剂盒,/, 孕马血清促性腺激素 ,; 伍,,。 ..主要仪器 倒置显微镜,, 荧光显微镜,, 实体显微镜,, 冷冻离心机.,上海安亭科学仪器厂 型,梅特勒.托利多仪器上海有限公司 仪 ., 培养箱 ., 化学发光免疫检测仪, ,,..试齐配制 人绒毛膜促性腺激素、孕马血清促性腺激素:各将 两种 激素溶于 双蒸水中,. 离心管分装。置于 保存。 小鼠体外受精液:按附表配方,配制完后过滤除菌,置于 保存。 小鼠胚胎培养液:按附表配方,配制完后过滤除菌,置于 保存。 环孢菌素溶液:配制环孢菌素溶液时,将其先溶解于无水乙醇,再在溶液中 加入橄榄油,使混合液中乙醇最终含量为%【。。 强的松溶液:将强的松每瓶 用.%的生理盐水稀释至. ?。 硫唑嘌呤溶液:由于硫唑嘌呤片剂,比较难溶,所以先将硫唑嘌呤每瓶片, 每片 片剂粉碎,用.%生理盐水配制成 ?’溶液。 .试验动物 试验中所用动物除特殊标明外,其它均为雌性和雄性清洁级昆明系小白鼠, 日龄的雌鼠作为卵巢移植供体;.周龄的雄性小鼠作为卵巢移植受体。受体鼠随机 分为三组:第一组为卵巢移植受体鼠,公鼠经过手术去势一周后,实施卵巢移植手术 将卵巢移植到去势公鼠背部肌肉;第二组公鼠经过去势一周后,在 其背部肌肉作同样的手术处理但没有移植卵巢,用于激素检测阴性对照组;第三组公 鼠不经过去势处理,但是根据同样方式在其背部肌肉作手术处理,用于激素 检性对照组。所有试验小鼠均饲养在. 的环境中,自由采食、饮水,保持 环境清洁。 .试验内容 ..卵巢移植后,观察移植体存活情况 卵巢移植后,采用免疫抑制剂处理移植受体鼠,同时匹配未进行免疫抑制剂处理 受体组,对比观察两组移植体发育、移植体周围新生血管网的建立、移植体回收率、 移植体尺寸大小以及通过染色观察移植体组织学结构变化。 ..卵巢移植后,观察移植体上卵泡的发育状况 卵巢移植 后,通过对移植体、同龄小鼠卵巢以及同龄小鼠卵巢进行 染色,对比观察移植体上卵泡的发育状况以及卵泡数变化。 ..卵巢移植后,观察移植体上卵泡的凋亡状况 卵巢移植 后,通过对移植体、同龄小鼠卵巢以及日龄小鼠卵巢进行 染色,对比观察移植体上卵泡凋亡情况。 ..观察移植受体内卵泡及卵母细胞继续发育潜能 为了观察免疫抑制剂处理的去势公鼠体内移植体、卵泡以及卵母细胞继续发 育情 况,将卵巢移植后移植体发育时间延长到 ,组织学观察移植受体内卵泡以及卵母 细胞发育状况。 ..观察从移植体上回收到的卵母细胞体外发育能力 卵巢移植 后,将从移植体上回收到的卵母细胞进行体外成熟、体外受精、 胚胎培养以及胚胎移植,观察移植体上卵母细胞体外继续发育潜能。 ..观察卵巢移植后受体鼠内分泌变化 ~ 卵巢移植 后,采集移植受体鼠、去势公鼠以及未去势公鼠血液,通过激素 检测手段检测血清内雌激素、孕酮以及睾酮的水平。观察卵巢移植后受体鼠 内分泌变 化。 .试验方法 ..移植受体与供体准备 所有用于卵巢移植的受体公鼠都要经过手术去势处理。去势时,先对公鼠实施全 身麻醉,按. ?剂量肌肉注射:双蒸水稀释的速眠新中国农科院哈尔 滨兽医研究所。麻醉后,提起小鼠颈部皮肤轻轻抖动小鼠以使双侧睾丸位于阴囊内, 用消毒好的手术刀在小鼠阴囊上划约 的切口,然后用拇指和食指轻轻挤压阴囊, 顺势钝性分离睾丸。去势后饲喂周,再进行卵巢移植。获取供体小鼠卵巢时,将 日龄小鼠采用颈椎脱臼法处死,采集卵巢,放在盛有事先预热的磷酸缓冲液 的 培养皿中,并且放在 热垫上,剔除卵巢周围组织及输卵管,将整个卵 巢用于移植。另取日龄小鼠的卵巢,经%多聚甲醛固定后用于组织学染色,以观 察卵巢组织结构。 ..卵巢异体移植 根据此前的报道】,简言之。卵巢移植当天,移植受体鼠禁食。按上述去势时采 取的方法全身麻醉,剪毛消毒后在无菌条件下进行卵巢移植手术。在小鼠背部中线两侧各剪开约 的表皮,暴露皮下肌肉层,轻轻分离肌肉表面的筋膜层,用 眼科镊 在脊柱两侧肌肉层上对称地各作一个. 深的切口凹】。然后轻轻地将切口处背部 肌肉层拉起,用眼科镊夹持预先处理好的整个卵巢送入切口内,左右两侧切口内各移 植枚卵巢,使移植卵巢一侧紧贴背部肌肉,另一侧面向筋膜层,整个卵巢离皮肤切 口边缘约 【一。松开眼科镊,抚平筋膜层,常规缝合表皮。整个卵巢移植过 程需在 内完成。卵巢移植当天记为第 ,另外一些去势的、未去势的公鼠采 取同样的手术方法作为对照组,但是这些小鼠没有被实施卵巢移植。卵巢移植后,每 隔 在受体鼠背部移植卵巢处的表皮上涂抹一些维生素,以便降低外界对移植 体的氧化和有利于移植体周围新生血管的形成【】。 ..免疫抑制剂处理 参照的方法并稍作改进,采用环孢菌素配合强的松和硫唑嘌呤三联用 药。卵巢移植前. ,皮下注射 ,肌肉注射. 强 ?环孢菌素. 的松,灌服. 硫唑嘌呤;此后 维持剂量. ,随后每隔. 皮下注射. ,肌肉注射. 强的松,灌服. 硫唑嘌呤。激素 ?环孢菌素. 检测对照组采用以上相同的方法实施免疫抑制剂处理,同时留取部分卵巢移植后的受 体鼠不实施免疫抑制治疗,是为了对比观察移植体回收率及移植体尺寸大小。 ..外源促性腺激素处理 根据此前报道,并经过一些适当的调整,给卵巢移植受体鼠注射外源促性腺激素, 以达到刺激卵泡的继续发育【】。卵巢移植前 ,给卵巢移植受体鼠腹腔注射 ;卵巢移植后第、 ,又分别给予受体鼠腹腔注射 ;在卵巢移植后 的第 ,给予受体鼠腹腔注射 。最终在卵巢移植后的第 ,又给受 体鼠腹腔注射了 ,同时激素检测对照组小鼠采取同样的激素注射方法和 程序。 ..卵巢组织染色 卵巢移植后的第 ,采用颈椎脱臼法处死卵巢移植受体鼠,分离移植体。随后 将移植体放在%多聚甲醛中固定 , 保存;然后在常温下经流水轻轻冲洗 、经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋,在石蜡切片机上制成厚约岬的组织 切片。切片经染色后,中性树胶封片,显微镜下观察拍照。根据文献以及此前 的 研究方法【岷对各级卵泡进行分类并计数,有一层扁平的颗粒细胞包裹于卵母细 胞周围视为原始卵泡;初级卵泡是由一层立方形的颗粒细胞包裹于卵母细胞周围;腔 前卵泡是由层或者更多层的立方形颗粒细胞包裹于卵母细胞周围,但是此时的卵泡 还没有出现卵泡腔;卵泡内一旦出现了卵泡腔,此时的卵泡即视为有腔卵泡。由于卵 泡有一定的大小,相同卵泡的不同部分有可能分布在连续的切片上,为了避免对相同 卵泡重复计数,每个连续切片被认为是同一组,然后在显微镜下,对这一组连续切 片上的相同卵泡进行辨别并计数。根据以上的方法,最终对移植体组织的所有连续切 片进行卵泡计数。 ..卵巢组织染色 卵巢组织经切片后,分别放在 温箱中烘烤 、二甲苯液体中 . 进行脱蜡,经梯度乙醇脱水后,用缓冲液漂洗次。组织切片经.% 室温下处理. 后,缓冲液漂洗次,然后组织切片经检测试剂 盒染色判断其上卵泡凋亡情况。具体方法如下:试验组中组织上滴加 . 反应混合液,放在 的湿盒中避光反应 ;阴性对照组中,组织上只添加肛 / 反应液,而不添加酶标记液;阳性对照组中,组织先经过 . 室温条件下处理. ,漂洗次终止反应,最后在组织 上滴加 反应混合液,放在 的湿盒中避光反应 。待染色完毕后, 在组织上滴加一滴,立即放在荧光显微镜下进行拍照。拍照时,同一个放大倍 数 条件下采用相同的曝光参数,以便于对比观察染色效果。 ..卵母细胞回收与体外成熟 收集到的 移植体经事先预热的.冲洗后,倒置显微镜下分离移植 体周围组织。用 注射器刺破移植体表面卵泡回收卵母细胞,将得到的卵母细 胞 漂洗后,每.枚卵母细胞放到事先经平衡预热的 .添加了 删 , / , / 和%培养液滴中,培养碟 放在 、饱和湿度恒温二氧化碳培养箱中,培养 后,观察第一极体排出情况。 ,对照组母鼠同样给予 促进卵泡发育, 在卵巢移植的第 后,采 用同样的回收卵母细胞的方法将回收到的期卵母细胞进行体外成熟。 ..体外受精与胚胎培养 成熟后带有第一极体的卵母细胞用来做体外受精。卵母细胞经漂洗后,转移到 受精液【吣事先已经在 、饱和湿度恒温二氧化碳培养箱中平衡至少 中平衡 ,将从成年公鼠体内取来的附睾经漂洗后,放在 受精 液中用剪刀剪开曲细精管,精子会呈云雾状的散开,在受精液中孵育 后,取 、饱 此上浮的获能精子放到“含有卵母细胞的培养液滴中,放在 和湿度恒温二氧化碳培养箱中受精 后。将得到的受精胚胎分别经和胚胎培养液中在。、饱和湿度二氧化 眠漂洗后,转移到“ 碳培养箱中培养。 后观察胚胎卵裂情况; 后,观察胚胎发育到囊胚的情况。 将得到的囊胚用 染色后,在荧光显微镜下进行拍照。 ..胚胎移植 按上述方法,对性成熟的公鼠进行全身麻醉后,使之平躺于手术台上,用剪毛剪 刀剪去睾丸腹侧毛发,酒精棉球消毒手术部位后;无菌手术刀轻轻在两侧睾丸中间部 位切开睾丸表皮,钟表镊钝性分离皮下组织找到双侧输精管,用酒精灯火焰 灼烧过的 手术镊快速夹持输精管尽量避开输精管周围血管,常规缝合睾丸表皮,经过手术 结扎的公鼠单笼饲养。在卵母细胞体外受精后时,将.周龄的母鼠/ 与性成熟的结扎公鼠合笼,于次日观察母鼠有无阴道栓,有阴道栓的母鼠作为胚胎移 植假孕鼠。将体外受精得到的. 的胚胎移植到. 假孕母鼠的单侧子宫与输卵管 结合处图,每只受体鼠大约移植.枚胚胎。. 后,观察胚胎移植受体鼠 的妊娠情况。 图胚胎移植 . ,雌鼠生殖系统;,通过移植管箭头将胚胎移植到宫管接合处;,移植的胚胎椭圈。八;, ;, . ..激素检测 在卵巢移植的第 ,用剪刀断头处死受体鼠后,采集卵巢移植受体鼠以及对照 鼠的血液于 离心管中,立即在冷冻离心机上以 /离心 后,将上层血清转移至. 离心管中。放在 冰箱保存或者立即用化学发光免 疫检测仪检测血清内雌激素、孕酮、睾酮的水平。 ..统计分析 回收移植体的直径、数目,以及移植体上的卵泡数、受体鼠体内的激素水平 均记 分析数据的差异性, 为平均数标准差 ,并且用 胚胎的卵裂率以及囊胚率用检验分析数据之间的差异性。.表示差异显著, .表示差异极显著。 结果 .移植体生长发育情况 ..免疫抑制剂处理组移植体生长发育情况 自卵巢移植后的第 开始,移植体周围逐渐开始形成血管;移植 后,移植 体突出于移植受体鼠背部肌肉,在移植体表面有不同尺寸大小发育的卵泡存 在图 ,此时移植体周围的血管网清晰可见图;回收到的移植体表面有有腔卵泡 存在图,并且在移植体上发现有黄体细胞出现图。 图卵巢移植后,移植体发育与血管再生 . ,移植体突起于背部肌肉,移植体表面的卵泡清晰可见箭头;,移植体椭圆周 围有血管网形成箭头; ,移植体上的有腔卵泡箭头;,移植体表面的黄体细胞箭头。八 明;, 嘲 『 ;, ;, . .,,,,..未实施免疫抑制剂处理组移植体生长发育情况 卵巢移植前,日龄小鼠卵巢尺寸大小约为岬图,而卵巢移植 后,对移植体尺寸以及回收率的观察发现:回收移植体数目及尺寸大小均明显的低于 对照组卵巢移植后,免疫抑制处理。表,其差异性得到了极显著图;另 外在没有进行免疫抑制的移植体以及进行免疫抑制的部分移植体周围出现有白细胞 浸润现象,如移植体呈红色,移植体周围有脓性液体图。 图卵巢移植后未实施免疫抑制处理,移植体发育状况 .。 ,同龄小鼠卵巢;,移植体星号直径明显小于对照组箭头;,未发育的移植体周围有白细胞浸润;, 现象椭圆。,? ;,., . 。 表卵巢移植 后,移植体回收数目及直径变化 . 注:表中同列数据采用检测,组问差异显著性尸?.用不同的上标字母表示..:日龄小鼠卵巢,/卵巢移植后采用免疫抑制,哪:卵巢移植后来采用免疫抑制.: .鞠 鹤. .伍”.: ?/: ,/: . .移植体染色分析 卵巢组织染色结果发现:卵巢移植前,在日龄小鼠卵巢上主要是一些原 始卵泡和初级卵泡图;相比之下,卵巢移植后 ,各个发育阶段的卵泡分布 于移植体的边缘图.,包括形态基本正常的原始卵泡图和有腔卵泡图 ;与日龄对照组小鼠卵巢相比,其卵巢上均匀分布着大量的处于各个发育阶段 的卵泡图,从原始卵泡到有腔卵泡图。然而在卵巢移植后,未采用免疫 抑制处理的受体鼠,其体内的移植体大量丢失,并且卵泡内的颗粒细胞及卵母细胞发 生了严重的退化图。 了、.?,‖?, 缪、.泸雾 图卵巢移植后,移植体的组织学观察. 八卵巢移植前,龄小鼠卵巢.:主要是一砦原始卵泡方框,缩影与初级卵泡箭头;,卵巢移植 后,移植体箭头紧贴着受体鼠肌肉星号;,移植 的卵巢.:有各个发育阶段的卵泡存在黑色箭 的卵巢皮质 头及黄体细胞白色箭头;, 的移植体上存在的原始卵泡箭头,缩影;,移植 部位存在的格拉夫氏卵泡箭头:,日龄小鼠卵巢上存在的不同发育阶段的卵泡;,图的局部扩大, 存在于日龄小鼠卵巢上的有腔卵泡箭头;,卵巢移植后未进行免疫抑制的受 体鼠,其体内移植体上颗 粒细胞及卵母细胞发生了退化箭头.八 ;,;,;, 弘 ;,谢 ; ; 姗 ;, .八,,, 岍 ;,,, .移植体染色分析 对移植体上的卵泡数及卵泡凋亡情况观察发现:在日龄的小鼠卵巢上,大多 数卵泡是处于原始卵泡和初级卵泡发育阶段,只有极少数有腔卵泡存在表;并 且染色结果显示一些原始卵泡和初级卵泡存在凋亡现象图.;然而 在卵巢移植 后,移植体上存在有各个发育阶段的卵泡,尤其出现了