革兰氏阳性细菌分选酶功能和应用研究进展

革兰氏阳性细菌分选酶功能和应用研究进展 革兰氏阳性细菌分选酶功能和应用研究进 展 966中国人兽共患病 ChineseJournalofZoonoses 文章编号:1002—2694(2010)10—0966—04 革兰氏阳性细菌分选酶功能和应用研究进展 祝令伟,郭学军,冯章 中图分类号:R378文献标识码:A 细菌表面元件,尤其是表面蛋白,由于和外界环 境直接接触,与病原菌的生存能力和致病性等密切 相关.革兰氏阴性细菌的表面蛋白镶嵌在外膜的脂 双层中,共同包裹住周质和肽聚糖层.革兰氏阳性 细菌没有脂双层形成的外膜,细胞壁成分主要为厚 的肽聚糖层,表面分子磷壁酸,脂膜酸以及表面蛋白 等均展示在肽聚糖上.将革兰氏阳性细菌表面蛋白 和菌毛锚定在细胞壁上需要分选酶(sortase,Srt)的 催化参与.分选酶兼有蛋白酶和转肽酶的功能,切 割表面蛋白保守的C末端信号序列,生成酰基酶的 中间体,该中间体随后被肽聚糖横桥或者菌毛蛋白 上的氨基团亲核攻击,从而将蛋白共价结合到细胞 壁肽聚糖上,或者与另外的菌毛蛋白共价连接.由 分选酶锚定的表面蛋白在细菌的黏附,细胞侵袭,凝 血过程,免疫逃避因子以及营养物质跨膜递送等多 方面发挥关键作用,是多种病原菌感染宿主的必要 环节.对许多革兰氏阳性菌进行SrtA基因敲除实 验后发现,SrtA的缺失使病原菌无法正常地将表面 蛋白锚定到细胞壁上,从而很大程度降低了病原菌 的致病性..基于这一理论,可将分选酶作为革兰 氏阳性病原菌抗感染治疗的靶点,开发新型抗感染 药物,以弥补抗生素治疗耐药菌株感染的不足. 1分选酶A(SrtA)作用机制 Mazmanian等首先发表有关金黄色葡萄球菌 分选酶A的文章.,并且以金黄色葡萄球菌中的表 面蛋白A(Spa)为模型阐述了表面蛋白的锚定过程. 金黄色葡萄球菌SrtA由206个氨基酸组成,具有催 化活性的Cys184位于分选酶特征基序TLxTC上. SrtA通过肽链N端部分固定在细胞膜上,并能识 别表面蛋白C末端分选信号所含的保守氨基酸基 序LPxTG.Ilangovan等通过NMR和X射线衍射 技术分析SrtA的三维结构H,其活性中心位于1个 疏水凹陷形成的口袋结构(pocket)中,除Cys184 外,活性中心其它氨基酸残基His120,Arg197和 Trp194等也都参与底物识别或催化过程,用其它氨 基酸取代这些氨基酸残基,SrtA的催化活性受到不 同程度的影响. 表面蛋白A的N端和C端都含有特征信号 肽,N端信号肽与表面蛋白分泌到膜外密切相关, c端信号肽部分被称之为细胞壁分选信号(cellwall sortingsignal,CWSS),含有35个氨基酸残基,包 括保守氨基酸序列LPxTG基序(LPxTGmotif),以 及随后的一个疏水区域(hydrophobicdomain)和尾 部带正电荷的氨基酸残基(chargedtail). 分选酶催化的表面蛋白锚定过程如图1所 示,携带基序LPxTG的表面蛋白作为底物与 ,催化中心的保 SrtA的催化活性口袋(pocket)结合 守氨基酸残基Cys184作为亲核基团攻击底物LPx— TG基序中的TG肽键将其断裂,与底物形成酰基一 酶中间体.随后肽聚糖前体lipid1I中五核苷酸横 桥上的氨基团亲核攻击酰基一酶中间体,与表面蛋白 苏氨酸(Thr)上的羧基形成酰胺键.通过这两步反 应表面蛋白共价结合到lipid11上,最后青霉素结合 蛋白(penicillinbindingproteins)催化lipid1I交叉 连接形成成熟的肽聚糖. 金黄色葡萄球菌基因组至少编码10种以上表 面蛋白,这些蛋白能与宿主不同组织,血清蛋白及细 胞外基质的多肽相互作用,不仅促进病原菌与宿主 组织细胞之间的反应,而且提供细菌逃避宿主免疫 反应的手段.比如表面蛋白A能与免疫球蛋白的 Fc部分相连,可使金黄色葡萄球菌进入人体宿主 后,不被调理吞噬.如果阻断由分选酶介导的锚定 过程,金黄色葡萄球菌就无法表现出强烈的致病性 并很容易被机体免疫系统所识别. 不仅天然的表面蛋白,将分选信号融合在N端 带分泌信号的蛋白前体C端,能够将这种融合体锚 定在细胞壁上,这种分选酶独特的作用机制可应用 于细胞表面展示技术(cell—surfacedisplay)领域. Nguyen和Schumann等首次通过外源SrtA将a淀 粉酶固定到枯草芽孢杆菌(B.subtilis)细胞壁 上,由于不知枯草芽孢杆菌中分选酶所识别的信 号基序,他们先将单核细胞增多性李氏杆菌(L. *国家"973"基金项目(No.2006CB504402)资助 通讯作者:冯书章,Email:shuzhangf@yahoo.corn 作者单位:军事医学科学院军事兽医研究所,吉林省人兽共患病预 防与控制重点实验室,长春130062 中国人兽共患病 ChineseJournalofZoonoses967 pept_山舱AcyI枷Zyme…一…. gellwallinconaoralion ]? 附 -_^纠?— L舳茵l2P3匿雷}2_图I2O.tGInIGl妞 蓄-?Il,营—薯O~C-MUeMACi-G?o..L{u.L-:~UlO?l.薹Xl萋X一峙L去-mfL龇.l《.I?il:,, 冒一吕…吕,.00o0毫doooooooo0oa0000口XIoO口口IX 玺嘲;罾;_ 耍—,《…'?'?_?gP髓罐蕊馥照 图1分选酶催化表面蛋白锚定过程 Fig.1Sortase—mediatedanchoringofsurfaceproteins i:表面蛋白通过N末端的信号肽(SP)由Sec途径分泌到胞外;iiiii:分选酶切割IIxTG 基序?形成硫酯连接的酰 基酶中间体;iv:lipid11氨基团亲核攻击酰基酶中间体,lipidII与表面蛋白形成酰胺键连接;V:lipidII交叉连接 形成成熟的肽聚糖.黑色长条和+代表表面蛋白C末端疏水区域和正电荷尾部.×代表锚定过程可被抑制的环节. m0nocytogenes)中的srtA基因导人枯草芽孢杆菌 中.然后将a淀粉酶基因与带有LPxTG分选基序 的金黄色葡萄球菌纤维素结合蛋白B基因融合构 建重组质粒,导入枯草芽孢杆菌表达,结果显示a淀 粉酶通过分选酶作用固定在菌体细胞壁上. 2革兰氏阳性细菌菌毛装配机制 目前的研究发现.除分支杆菌属(Mycoba~'tel一 )之外的所有革兰氏阳性细菌均有一个保守的管 家分选酶SrtA.另外,许多病原菌还有一些执行特 定功能的专属性的分选酶…,其编码基因通常位于 作用蛋白基因的附近,形成特定的功能基因群,比如 SrtB参与铁离子的摄取,SrtC负责菌毛装配,SrtD 作用于芽孢形成.其中C型分选酶家族是最大的 群体,包括白喉棒状杆菌,内氏放线菌,乳酸乳球菌, 粪肠球菌,产气荚膜梭菌以及链球菌属化脓链球菌, 肺炎链球菌,无乳链球菌和猪链球菌等均发现菌毛 和菌毛基因群,甚至在一个病原菌的基因组中就有 多个srtC基因,组成多个菌毛基因群.不同类型 的分选酶不仅在功能上存在差异,而且在酶识别底 物的机制以及所识别分选信号的序列等存在差异, 表1列出不同类型分选酶在主要的革兰氏阳性病 原菌中的分布. 菌毛是细菌表面的一种特殊结构,呈细长丝状, 通常与细菌的黏附和侵袭性等密切相关.革兰氏阳 性细菌的菌毛是多个单体菌毛蛋白共价连接形成的 聚合体,由分选酶通过转肽反应将各单体蛋白连接 并最终锚定在细胞壁肽聚糖上.大量的研究报道发 现革兰氏阳性细菌菌毛装配中的共性机制,菌毛基 因群多数包括1个或多个tC基因,l主2辅共3 个单体菌毛蛋白基因.有些基因群两侧还有可移动 性遗传元件结构,表明基因群可能是通过外源基因 水平交换和转移获得.菌毛的装配首先由单体的主 要菌毛蛋白共价聚合形成伸展的菌毛骨架,而两种 辅助菌毛蛋白锚定在骨架上,形成异源三聚体的菌 毛结构.通常细菌的黏附由分布在骨架上的辅助菌 毛蛋白完成,敲除主要菌毛蛋白基因,不能形成长丝 状菌毛结构,辅助菌毛蛋白则直接锚定在细胞壁上, 依然具有黏附能力.在对白喉棒状杆菌等研究中发 现,辅助菌毛蛋白不仅被锚定在菌毛骨架上.也 以单体形式被直接锚定在细胞壁上.但是形成长的 菌毛丝状纤维结构对于病原菌的黏附和定居是非常 有必要的,伸展的菌毛能够首先识别和黏附特异的 宿主细胞,进而引发其它非菌毛的黏附机制,尤其是 细胞壁上大量单体的辅助菌毛蛋白,与宿主细胞形 成较大的黏附区域,这种广泛的接触有利于细菌向 宿主细胞内递送毒素以及直接侵入细胞. 主要菌毛蛋白提供菌毛装配所必须的所有元 件,它具有3个保守基序:主要菌毛蛋白基序 (WxxxVxVYPKN),有1个保守的赖氨酸(Iys);E box基序(YxLxETxAPxGY),有1个保守的谷氨 酸(Glu);以及作为细胞壁锚定表面蛋白所必需的 CWSS分选信号.将2个主要菌毛蛋白单体连接, 分选酶切割一个单体的IPxTG基序.形成酰基酶 中间体,而另一个单体VYPKN基序保守的赖氨酸 968息iD国.es人eJo兽urn共al患ofZ病oo学nos报es2.1.,26(1.) 化脓链球菌(S.pyogenes) 变形链球菌(S.mutans) 肺炎链球菌(S.pneumoniae) 无乳链球菌(s.agalactiae) 猪链球菌(s.suis) 乳酸乳球菌(Lactococcuslactis) 粪肠球菌(Enterococcusecalis) 产单核细胞李氏杆菌(L,Monocytogenes) 炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis) 金黄色葡萄球菌(Stapkylococtaureus) 产气荚膜梭菌(ClostridiumperJringens) 天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor) 内氏放线菌(Actinomycesnaeslundii) 杰氏棒状杆菌(C.jeikeium) 白喉棒状杆菌(C.diphtheriae) 谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum) 注:数字代表该病原菌中含有该类分选酶基因的数目 (Lys)具有一个氨基作为亲核攻击的电子供体,从 而形成酰胺键.若VYPKN基序保守的赖氨酸 (Lys)突变,则不能聚合成菌毛结构,而是以单体形 式被直接锚定在细胞壁上.Ebox基序被证明在辅 助菌毛蛋白装配入菌毛骨架中发挥关键作用,当E box基序中不变的谷氨酸(Glu)被其它氨基酸所取 代,辅助菌毛蛋白则不能被掺入到菌毛骨架上.现 在认为Ebox基序的谷氨酸与辅助菌毛蛋白LPx TG基序的苏氨酸间能形成酸酐键,但是目前尚不 能证明分选酶具有这种催化功能,所以辅助菌毛蛋 白如何被锚定到菌毛骨架上尚待研究. 在白喉棒状杆菌和无乳链球菌等的研究 中0?,各单体菌毛蛋白的聚合由菌毛专属分选酶 SrtC催化,而完整的聚合体则由管家分选酶SrtA 锚定到肽聚糖上.但是在肺炎链球菌中菌毛蛋白只 被SrtC催化聚合和锚定,而不能被SrtA催化锚定. 究其原因,肺炎链球菌的菌毛蛋白并非标准的LPx— TG基序,第一个氨基酸残基亮氨酸(Leu)被其它氨 基酸所取代,这样的基序不为SrtA所识别n们.但 是在化脓链球菌的研究中,菌毛蛋白即使拥有标准 的LPxTG基序,依然不被SrtA识别,说明除了 LPxTG基序外,分选酶还需识别其它的序列标识才 能激活催化反应. 除细菌的黏附和侵袭性之外,不同病原菌的菌 毛还有其它特殊的功能,可被深入研究和利用.比 如在肺炎链球菌中菌毛可诱发宿主的炎症反应和免 疫应答.在牙菌斑形成过程中内氏放线菌等口腔病 原菌通过菌毛交叉聚合形成生物被膜". 3分选酶作为抗感染药物靶点 因为众多病原菌耐药菌株的产生,细菌的抗生 素耐受问题受到越来越多的关注,一些广谱耐药的 超级细菌往往意味着高致病性和死亡率.由于发现 新的抗生素并非易事,因此需要探索新的药物作用 靶点,抗感染治疗是最近提出的一个新观点.抗生 素的作用在于抑制细菌生长,但是在选择压力下细 菌往往对这些抑制作用产生耐受而使药物作用失 活;而抗感染治疗是抑制细菌的感染机制,使其易被 宿主的免疫系统所识别,可能不存在选择压力.分 选酶因为在细菌感染中有着至关重要的作用,也被 广泛关注. 如图1所示,分选酶催化表面蛋白锚定的各个 步骤均可作为抗感染药物筛选的靶点.在分选酶作 用机制被阐明前,已发现万古霉素(vancomycin)结 合肽聚糖前体lipidII,阻止其最终聚合,而默诺霉 素A(moenomycin)是一种lipidII的类似物,二者 均可阻断细胞壁的合成和表面蛋白锚定途径.但是 青霉素作为细胞壁生物合成抑制剂,却不能抑制表 面蛋白的锚定.Kim等从植物中筛选了几种SrtA 抑制剂q盯,其中木防己,浙贝母,阔叶麦冬和漆树对 SrtA有比较强的抑制效果,但是纯化的抑制剂抑制 效果不如粗提成分,这些天然植物药物对分选酶的 抑制机理不完全清楚.Kim等还分析鉴定了一些 异喹啉生物碱和2一吲哚生物碱对SrtA的抑制活 性,初步确定咪唑基和吡嗪基构成抑制功能的基本 2010.26(10)中国人兽共患病 ChineseJournalofZoonoses969 骨架. 因为分选酶的催化活性是由活性中心半胱氨酸 (Cys184)硫氢基发动亲核攻击,所以一些半胱氨酸 蛋白酶抑制剂可抑制分选酶催化的表面蛋白锚定过 程.根据重氮酮(一COCHN)和氯甲烷酮(一COCHz C1)能与半胱氨酸的硫氢基形成共价硫醚键的原理, Scott等合成了由分选酶识别底物LPxTG基序蛋 白衍生而得到的不可逆抑制剂力,肽酰重氮甲烷 (Cbz—Leu—Pro—Ala—Thr—CHN2)和肽酰氯甲烷(Cbz— Leu—Pro—Ala—Thr,CH.C1),其中肽酰氯甲烷对分选 酶有更强的抑制效果.除了半胱氨酸的硫氢基,底 物衍生的抑制剂还可作用于酶活性中心的其它位点 和区域.另外还有人合成苏氨酸类似物共价修饰分 选酶催化活性位点,竞争抑制分选酶的催化活性. 4展望 随着越来越多的小分子化合物和药物数据库的 开发利用以及分析自动化的发展,分选酶抑制剂的 筛选进入高通量筛选时代(high—throughputscreen, HTS),借助于这类技术手段,可以从众多的化合物 中筛选出最佳的抑制剂,并且通过合理的化学修饰 优化其抑制效果….目前分选酶抑制剂的筛选主 要以金黄色葡萄球菌SrtA为模型,虽然已初步筛 选出抑制活性相对较高的抑制剂,但是不能确定这 些抑制剂能否广谱作用于革兰氏阳性菌.虽然革兰 氏阳性细菌分选酶有相似的作用机制,但是在不同 的病原菌中不同类型分选酶德活性中心激活机制和 识别的底物分选信号序列存在差异,只有获得这些 分选酶及其所锚定表面蛋白更详细的研究资料,才 能针对性的筛选相应的分选酶抑制剂.作为一种新 型抗感染治疗思路,分选酶抑制剂的研究尚且刚刚 起步,目前的研究多是一些探索性的尝试.随着研 究的深入,在应用分选酶抑制剂作为一种抗感染治 疗药物之前,诸如对抑制酶活性和抗感染治疗效果 的检验标准和动物模型等也需要发展与完善. 参考文献: [1]MazmanianSK,LiuG,Ton—ThatH,eta1.Sm肼Z0f0ff"au reussortase,anenzymethatanchorssurfaceproteinstothecell wall(J1.Science,1999,285(5428):760—763. 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