免疫组织化学技术

免疫组织化学技术 (一)染色方法 1(直接法 荧光素直接标记特异性抗体(—抗)上，标记抗体与抗原结合(在切片上)荧光显微镜下观察?检测抗 原。 ? 酶标抗体要显示后镜检。 直接法优点:简单，时间短，特异性强。 缺点:灵敏度低，所需抗体量大(不经济)。 应用:基本不 用～～ 2(间接法 荧光素标记在二抗上(二抗:抗产生一抗动物的 IgG抗体)。 ※显色后镜检 特点:较直接法灵敏，可标记一种抗体? 鉴定多种抗原。 3(非标记Ab桥法: ―桥法‖是酶标记抗体的改进，经过三次抗体，其二抗为未标记桥抗体。 (1)单桥法 (2)双桥法 在三抗之后，将二抗和三抗再重复一次， 可增大染色强度。 ? 特别提示:注意动物种属关系 4(PAP法(过氧化物酶—抗过氧化物酶法 Peroxidase anti—peroxidase method， PAP法) ~ 是桥法的改良，既先形成PAP复合物?抗原—抗体—抗IgG抗体—PAP复合物。 该法简化了操作步骤，提高了灵敏度，所染标本可长期保存。 5(ABC法(亲和素—生物素—过氧化物酶复合物法，Avidin—biotin—peroxidase Complex method，ABC 法) Avidin: 亲和素，一种糖蛋白，其上有4个与生物素相结合的位点。 Biotin : 生物素—维生素H，两者亲和力巨大，牢不可破。 ABC法与PAP法的区别是:以ABC复合物代替PAP复合物。 (1)ABC复合物的制备: (2)ABC法反应原理 6(SP或SAP法(过氧化物酶标记的链霉卵 白素或过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染 色) Streptavidin/peroxidase or strepta- vidin/alkaline phosphata se) ※ 该法是ABC法基础上的进一步改良，使卵白素与链霉(而非生物素)结合，而后再结合PO 。 它有4个亚基可与生物素结合，灵敏特异， 背景低，成本低。 现在还有plus盒。优点是:更简便，放大倍数?，等电点中性更适合组织。分子量小，穿透力?。 7(蛋白A—金法(Protein—A gold method) ~多用于电镜 8(双重组化染色法 应用双重免疫组织化学激素可在同一张切片，同一细胞或亚细胞结构内同时显示两种不同的抗原。 9(免疫金—银染色法 (Immunogold—silver staining IGSS) (二)固定——见前述 注意事项: 1(固定剂的选择:因组织而不同，注意质量和 性能。 2(固定方式的选择:? 浸渍固定(参考文献) ? 灌注固定(+后固定) ? 蒸汽固定 (三)免疫组化染色步骤(以ABC法为例) 1(切片脱蜡入水，入PAS 洗三次/15分钟。 2(封闭内源性过氧化物酶。用新配置的0.3,H2O2 (在PAS或0.05Tris—HCL缓冲液PH7.6中或甲醇中)室 温，30 分钟。 3(水洗，入PBS，洗三次，每次5分钟。 4(减少非特异性着色用稀释20倍的正常血清(产生二次抗体动物血清～)，室温，30分钟。 5(滴加第一抗体，4?过液或室温5′~1 hour。 6(0.1MPBS，洗三次，每次5分钟。 7(滴加第二抗体，室温15′~ 60′。 8(0.1MPBS 洗净，洗三次，每次5分钟。 9(滴加ABC复合物，室温15~60分钟。 10(0.1MPBS 洗三次，每次5分钟。 11(0.05M Tris –HCL 5~10分钟，此步可省略。 12(DAB—H2O2 显色:用0.01,H2O2的DAB溶液，室温5~30分钟，随时镜检(DAB用时新配) 13(自来水洗净。 14(用Mayer 苏木精或0.5,甲基绿，复染胞核(可不染)。 15(常规脱水、透明、封固、镜检。 结果:棕褐色反应产物代抗原X的定位。 (四)免疫组化染色基本技术及注意事项 1(实验 ? 根据课题的内容选用动物，选用配套的Ab。如Ab—I鼠抗人的抗体，与其他种属间无 交叉，则不能用其他 动物，而且Ab-?必须是羊抗鼠，若PAP法Ab-?必须来源于鼠，否则不能连接成复合物。 ? 若要比较染色深浅在对照组与实验组间的差异，在贴片方面最好贴于同一张载片上，否则无可比性。 ? 选用的试剂可靠，货源充足，随时可取。 2(Ab稀释度 (如系购买的药盒有工作液和原液) (1)工作液:无须稀释 (2)原液: ? 应参照其提供的工作液浓度进行预试验验。 如:工作液浓度为1?1000， 可选1?500，1?1000，1?1500试验; 若: 1?500有背景，1?1000阳性反应稍浅，可选1?750进行试验。 ? 原液的保存(—20?)冻存——应选最佳稀度冻存。 ? 若工作浓度大于1?500则要先将原液稀释十倍，而后分装10μl/瓶?冻存(-20 ?)于 冰箱备用。 ? 关于Ab保存应参照说明书。 (3)Ab浓度的选择 Ab浓度不可太高或太低，因为Ag-Ab结合需在一定浓度范围内进行，若一方过剩则形成复合物小且少;极 过剩时已形成的复合物亦会解体而呈现假阴性。——并非Ab浓度越高越好。 3(Ab滴片技术 —— 所滴的抗体应与切片上的组织刚好吻合。 ,注意, 滴抗体前需把切片上的水弄干，但不能干片。 要领:甩净组织周围的水。 4(PBS洗涤技术 (1)洗涤的目的 ? 保证离子浓度和PH值。 ? 减少非特异反应(平时Ab不可靠很纯) (2)方法:洗三次，每次5分钟。 5(Ab孵育技术 (1)必须在湿盒内进行，以防抗体的蒸发和干片。 (2)温度与时间 4?:过夜; 37?:2 h or 参考说明书 6(光镜控制显色方法 (1)室内操作:注意温度与时间的关系，室温最宜5分钟。 (2)染色稍浅亦可拿出，脱水，封片后颜色可加深。 (五)对照组和染色结果的评价 从以下几 个方面综合评价: 1(阳性染色特点 ? Ag定位，胞浆、胞核、胞膜、间质具有结构性。(非特异性,细胞与组织无区别) ? 染色强度不同:颜色深浅不一(非特异性染色 弥散性均匀) 2(组织切片制作过程的影响 ? 固定不良—非特异性染色，显示不均。 ? 边缘干燥—非特异性染色(常见)，加抗体时勿干片。 3(人工假象与特异性结果显示不在同一平面上。 阳性对照: 用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染色。对照切片呈阳性结果，标为阳性对照。 阴性对照: 用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果，称阴性对照。其实这只是阴性对照中的一种，阴性对照 还应包括空白、替代、吸收和抑制实验。 ? 染色失败的几种原因: (1)所染的全部切片均为阴性结果，包括阳性 对照在内。全部(,)原因可能: ? 染色未完全严格按照操作步骤进行; ? 漏加一种抗体，或抗体失效; ? 缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性; ? 底物中所加H2O2 量少或失效; ? 复染或脱水剂使用不当 (2)所有切片均呈阳性反应，原因可能是: ? 切片在染色过程中抗体过浓，或干燥了。 ? 缓冲液配置中未加氯化钠和PH值不准确，洗涤不彻底。 ? 使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反应时间过长。 ? 抗体温育的时间过长。 ? H2O2 浓度过高，呈色速度过快。粘附剂太厚。 (3)所有切片背景过深，原因可能是: ? 未加酶消化处理切片。 ? 切片或涂片过厚。 ? 漂洗不够。 ? 底物呈色反应过久。 ? 蛋白质封闭不够或所用血清溶血。 ? 使用全血清抗体稀释不够。 (4)阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反应。 最常见的原因是:标本的固定和处理不当。