血红蛋白的提取和分离
血红蛋白的提取和分离 ?课
目标
1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白
2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理
3、体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求,注意按照操作提示进行相关步骤
?课题重点
凝胶色谱法的原理和方法
?课题难点
样品的预处理;色谱柱填料的处理和色谱柱的装填
1、基础知识――蛋白质提取和分离原理
蛋白质的 、大小、 、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别,由此提取
和分离各种蛋白质。
提取和分离的方法: 、
1)凝胶色谱法(分配色谱法)
?原理:分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的 ,路程 ,流动 ;分子量小的分子穿过
,路程 ,流动 。 多孔凝胶颗粒
?凝胶
: 化合物,如葡聚糖、琼脂糖。
?分离过程:
混合物上柱?洗脱?大分子流动快、小分子流动慢?收集大分子?收集小分子
, 洗脱:从色谱柱上端不断注入缓冲液,促使蛋白质分子的差速流动。
注:相对分子量较大的蛋白质 流出,相对分子量较小的 流出。 ?缓冲溶液(洗脱剂)
组成:由酸和相应的强碱盐组成(如HCO,NaHCO,HC,NaC,NaHPO4/NaHPO等) 233224
配制:调节酸和盐的用量,可配制不同pH的缓冲液。
缓冲液作用:抵制外界、 对溶液pH的干扰,而保持pH稳定。 2)凝胶电泳法:
?原理:不同蛋白质的 不同,在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不
同,导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。
决定运动形成库形成决定运动 方向 仑力 阻力 速率
电荷 ? 性质
电荷? ? 量
分子? ? 形状
分子? ?
大小
?分离方法: 、聚丙烯酰胺经胶电泳等。
?分离过程:在一定pH下,使蛋白质基团带上正电或负电;加入带负电荷多的SDS,形成
。 “蛋白质,SDS复合物”,使蛋白质迁移速率仅取决于
2、实验设计(分离血红蛋白)
蛋白质的提取和分离一般分为: 、粗分离、 、纯度鉴定。
1)样品处理
有关本实验材料的知识
你认为鸟类血液和哺乳动物血液中,最好哪种血液来提取血红蛋白,为什么,
血液。因为该细胞中 。
血液由 和 两部分组成。
血细胞中 细胞数量最多,细胞的含量最高的化合物是 。
该化合物是由 和 构成的,其中每条肽链中都含有一个能与O和CO结合的 基团。 22
?洗涤红细胞
?洗涤红细胞的目的是
?红细胞的洗涤过程为:
血液,柠檬酸钠? 离心?吸出上层血浆?红细胞,5倍体积 ?缓慢搅拌? 离心?吸出上清液?反复洗涤直至上清液无黄色
注意加入柠檬酸钠有何目的,为什么要低速、短时离心,为什么要缓慢搅拌,洗涤次数不能过少,
?释放血红蛋白
思考:释放血红蛋白过程中,在洗涤好的红细胞加入了哪些物质,
为了加速释放过程,采取了什么措施,
目的分析:
1. 蒸馏水的作用是______________________________。
2. 加入甲苯的作用是____________________________。
3. 充分搅拌的目的是____________________________
?分离血红蛋白
此时,红细胞破碎混合液中不仅含有血红蛋白,而且还含有细胞破碎物、脂质、甲苯有机溶剂等。怎样除去这些杂质呢,由于它们的密度不同,科学家采取了离心分离的方法:
红细胞
( ) 混合液 脂类物质等 ( )
( )
( ) 滤纸过滤 高速离心
离心管 烧杯 分液漏斗
?透析血红蛋白
目的:
思考:为何使用pH,7的磷酸缓冲液,为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量,
维持血红蛋白的正常特性。有利于杂质分子充分地向外扩散。
2)粗分离
通过以上四个基本过程,红细胞中的血红蛋白就被提取出来。但其中还含有其他种类的蛋白质分子(如呼吸酶等)。怎样将杂蛋白与血红蛋白分离开来呢,我们来研究蛋白质提取和分离的第二个步骤――粗分离(凝胶色谱操作)。
凝胶色谱分离蛋白质包括:制作色谱柱、装填色谱柱、样品加入和洗脱。
?制作色谱柱:准备材料?加工橡皮塞?安装色谱柱(了解一下)
?凝胶色谱柱的装填过程: ?
步骤 操作要求
? 操作要求 色谱柱垂直固定在支架上
? 计算称量凝胶 根据色谱柱体积计算凝胶用量
凝胶颗粒,蒸馏水?充分溶胀 ?配制悬浮液 ? ?凝胶颗粒,洗脱液?沸水浴
?装填悬浮液 一次性缓慢倒入;轻轻敲打 ?
? 缓冲液洗涤平衡 立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h,使凝胶装填紧密
注:步骤?中沸水浴加热,可加速凝胶膨胀,而且可以除去凝胶中可能带有的微生物,排除凝胶内的空气。
装填的凝胶要尽量紧密,降低凝胶颗粒之间的的空隙;还有装填凝胶柱时,不得有空气。都是因为(如
果装填不紧密,使本该进入凝胶内部的样品分子从空隙中或空气通过,)搅乱洗脱液的流动次序,影
响分离的效果。
?样品加入和洗脱
基本过程是:
调节缓冲液面(打开下端流出口,使缓冲液下降到与凝胶面平齐后关闭出口)?加入蛋白质样品?调节缓冲液面(使缓冲液下降到与凝胶面平齐后关闭出口)?洗脱(色谱柱上端连接缓冲液洗脱瓶,打开下端流出口)?收集分装蛋白质
至此,血红蛋白即可得到粗分离。在整个操作过程中,应当注意以下事项:
(1)红细胞的洗涤:
洗涤次数不能过少;低速、短时离心。
(2)凝胶的预处理:
沸水浴法时间短,还能除去微生物和气泡
(3)色谱柱的装填:
装填尽量紧密,降低颗粒间隙;无气泡;洗脱液不能断流。
4)色谱柱成功标志:红色区带均匀一致地移动。 (
跟踪练习
1 利用凝胶色谱法,什么样的蛋白质先洗脱出来( )
A.相对分子质量大的 B.溶解度高的 C.相对分子量小的 D.所代电荷多的 2 蛋白质提取和分离分为哪几步( )
A.样品处理、凝胶色谱操作、SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳
B.样品处理、凝胶色谱操作、纯化
C.样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定
D.样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定
3用凝胶色谱法分离蛋白质时,分子量大的蛋白质( )
A路程较长,移动速度较慢 B路程较长,移动速度较快
C路程较短,移动速度较慢 D路程较短,移动速度较快
4凝胶色谱法中所用的凝胶化学本质大多是( )
A. 糖类化合物 B. 脂质 C. 蛋白质 D. 核酸
5选用红细胞作为分离蛋白质的实验材料,有何好处( )
A. 血红蛋白是有色蛋白 B. 红细胞无细胞核 C. 红细胞蛋白质含量高 D. 红细胞DNA含量高
6将搅拌好的混合液离心来分离血红蛋白溶液时,第二层是( )
A. 甲苯 B. 血红蛋白水溶液 C. 脂溶性物质的沉淀层 D. 其他杂质的沉淀 7血红蛋白因含有( )而呈红色
A. O2 B. CO C. CO2 D.血红素
8下列操作正确的是( )
A. 分离红细胞时采用低速长时间离心 B. 红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可
C. 分离血红蛋白溶液是低速短时间离心 D. 透析时要用20mmol/l的磷酸缓冲液,透析12h
9样品的加入和洗脱的叙述正确的是( )
A. 先加入1ml透析后的样品 B. 加样前要使缓冲液缓慢下降全部流出
C. 如果红色带均匀一致的移动,说明色谱柱制作成功 D. 洗脱时可以用缓冲液也可以用清水
10下列有关提取和分离血红蛋白的程度叙述错误的是( )
A. 样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液
B. 通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质,此为样品的粗提取
C. 可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去,即样品的纯化
D. 可通过SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度
11凝胶色谱法操作正确的是( )
A. 将橡皮塞上部用刀切出锅底状的凹穴
B. 将橡皮塞下部切出凹穴
C. 插入的玻璃管的上部要超出橡皮塞的凹穴底面
D. 将尼龙网剪成与橡皮塞下部一样大小的圆片
12样品的加入和洗脱的操作不正确的是( )
A. 加样前,打开色谱柱下端的流出口,使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面
B. 加样后,打开下端出口,使样品渗入凝胶床内
C. 等样品完全进入凝胶层后,关闭下端出口
D. 用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端,不要破坏凝胶面