转化生长因子-β对大鼠腹膜纤维化的防治研究

转化生长因子-β对大鼠腹膜纤维化的防治研究 转化生长因子-β对大鼠腹膜纤维化的防治 研究 西部医学2007年5月第19卷第3期MedJWestChina,May2007,Vo1.19,No.3 转化生长因子一p对大鼠腹膜纤维化的防治研究 李春玲,王春梅,赵向阳 (1.1~t91省人民医院外科ICU,I~tJq成都610072;2.哈尔滨医科大学在读研究生,黑龙江哈尔滨150001) 【摘要】目的探讨腹膜纤维化的防治措施.Wistar大鼠3O只随机分成三组.A组为模型组,每日腹腔注射 4.25%的百特透析液20ml,B组为给药组每日腹腔注射透析液同时灌胃给药(血管紧张素转换酶抑制剂)一平苏,c组为 空白对照组,每日腹腔注入生理盐水20ml.试验开始3O天后取大鼠腹膜作病理组织学检查,同时收集血清和腹透液测 定转化生长因子一p.结果A组和B组的腹膜明显纤维化并且转化生长因子一p血清和腹透液中都有增加,与C组差异都 有显着性.结论高糖可以诱导腹膜纤维化.腹膜纤维化时转化生长因子一p血清和腹透液中都升高并且可被一平苏抑 制.3平苏有抗腹膜纤维化的作用. 【关键词】转化生长因子一p;腹膜纤维化;血管紧张素转换酶抑制剂 【中图分类号】R656.4【文献标识码】A【文章编号】1672-3511(2007) 一0344—03 ThestudyofTGFq3bothinserumandperitonealdialysateof ratwithperitonealfibrosis , , LIChun-ling,WANGChun—mei,ZHAOXiang-yang (ICUSichuanProvincialPeople’SHospital.Chengdu610072,Sichuan,China) [Abstract]0bjectiveToinvestigatethepreventionandtreatmentofperitonealfibrosisinlong—termperitoneal dialysispatients.MethodsThirtyWistarratsweredividedintothreegroups,Agroupmodelgroup,receiveddaily intraperitonealinjectionof20mL4.25%,Bmedicinegroup,receiveddailyintraperitonealinjectionof20mL4.25%and angiotensin—convertingenzymeinhibitor(inhibace)lOmg/kg?dwasgivenorallytoratsbygastricgavageinthe morningonceadayCgroupcontrolgroupreceiveddailyintraperitonealinjectionof20mL0.85natrlicloride.Thirty dayslateTGF—pexpressionwereexaminedinabdominalcavityliquidandserumofperitonealdialysisrats. Histopathologyofparietalperitoneumwasexamined.ResultsTGF-[3obvio uslyincreasedinBothAandBgroupsas comparedtOCgroup(尸 <0.05)SOdohistopathologyofperitoneumfibrosis.Conclusionshighgluco secaninduce peritonealfibrosistheexpressionofTGF一 ~bothinabdominalcavityliquidandserumisup-regulatedwhichisinvolvedin themechanismofperitonealfibrosis,thatcanbeinhibatedbyangiotensin—c onvertingenzymeinhibitor(inhibace). Inhibacecanrelieveperitonealfibrosis. [Keywords]Peritonealfibrosis;Transformgrowthfactor一 口;Angiotensin-converringenzymeinhibitor 腹膜透析是治疗急慢性肾功能衰竭的主要肾脏替 代治疗方法.腹膜透析相关性腹膜纤维化是维持性腹 膜透析患者常见的严重并发症,是导致腹膜超滤功能 丧失,患者退出腹透治疗的重要原因越来越多的研究 发现转化生长因子一B(Transforminggrowthfactor beta,TGF—B)是一种强效的致纤维化因子,在腹膜纤 维化的形成过程中起重要的作用].因此,针对TG, FB成为防治腹膜纤维化的新的治疗靶点.我们重在探 讨血管紧张素转换酶抑制剂(一平苏)对腹膜纤维化的 影响,并通过腹膜纤维化时血清和腹透液中转化生长 因子一B的改变进一步研究血管紧张素转换酶抑制剂 与腹膜纤维化的关系. 1材料和方法 1.1动物模型的建立和分组所有实验大鼠都买自 哈尔滨医科大学动物实验室,雄性大鼠体重在200, 250g,大约6,8周龄.随机分成3组每组1O只.A组 腹腔内每日注入2O毫升4.25百特透析液B组腹 腔内每日注入2O毫升4.25百特透析液,同时一平 苏10mg/kg?d灌胃;C组对照组,腹腔内每日注入 2O毫升0.9生理盐水. 1.2取材试验开始3O天后,宰杀所有动物.宰杀前 一 小时全部大鼠腹腔注入2.5百特透析液2Oml.摘 眼球取血两毫升静置3O分钟后,离心机5000r/min 离心15分钟,取上清保存在一2O度冰箱.1O水合氯 醛3ml/kg腹腔给药,麻醉后切开大鼠腹腔,去掉皮肤 和皮下组织后充分暴露腹膜前壁沿正中线切开,小心 收集腹透液lOml.取壁层腹膜组织10mm×10mm保 存于1O福尔马林中,准备作病理.腹透液以1500r/ 西部医学2007年5月第19卷第3期MedJWestChina,May2007,Vo1.19,No.3 min离心5分钟,取上清1.5ml保存于一20.冰箱准备 测定转化生长因子一口.所有实验数据用大鼠处死时体 重校正. 1.3常规病理检查壁层腹膜组织保存于10%的福 尔马林缓冲液中24小时后,开始脱水,石蜡包埋,切取 5m,做HE染色,马松染色.每个切片观察10个40 倍视野,计算问皮细胞下纤维结缔组织厚度取其平均 值,并比较炎症浸润的程度. 1.4ELASA测定腹透液,血清进行TGF—B1的 ELASA测定(试剂盒购自武汉博士德生物工程有限 公司). 1.5统计学方法计量数据以?S表示,组间差异 采用方差分析.一0.05为检验水准. 2结果 2.1腹膜组织学改变光镜下,C组腹膜厚度为(7.5 ?2.6)m,腹膜覆盖一层扁平间皮细胞,B组腹膜厚 度为(21.7?2.4)m和A组腹膜厚度为(42.0?2.0) m,腹膜厚度明显增加.间皮细胞变为圆形柱形,间皮 细胞有脱落,纤维裸露,间质有大量炎性细胞浸润, Masson染色显示有大量的胶原沉积,A组比B组改 变更明显,见图1.从表1看,3组腹膜厚度不同(F一 545.999,P一0.000),任意两组间比较均不同(g为 19.14,46.49,均P<0.O1). 表1各组大鼠腹膜厚度情况比较 Tab.1Actualthicknessofthesubserosaltissueineverygroup 2.2转化生长因子一B1的检测结果从表2看,腹透 液中TGF一61浓度三组不同(F=37.82,P一0.ooo), 且任意两组间比较,均不同(g为5.73,12.29,均P< 0.O1);血清中TGF一61浓度三组不同(F=223.60,P 一 0.ooo),且任意两组间比较均不同(g为12.19, 29.75,均P<O.O1);腹透液与血清中TGF一61浓度比 较,三组均是不同0为5.78,13.01,均P一0.ooo), 可认为血清中TGF一61浓度均高于腹透液中浓度.显 示在腹膜透析的同时服用血管紧张素转换酶抑制剂有 助于抑制炎症介质的产生,从而有效延缓腹膜纤维化 的进展.但是从B组血清及腹透液中的TGF一61的浓 度和C组比较中我们也可以看出,单纯应用血管紧张 素转换酶抑制剂(一平苏)并不能完全抑制腹膜透析中 炎症介质的产生. 3讨论 腹膜纤维化病理学的主要特是腹膜间皮细胞的 脱落,胶原纤维排列混乱,细胞外基质(ECM)沉积及 ,.1_ ? .. A组 B组 C组 345 图1各组大鼠腹膜染色(马松染色和H&EX40) Fig.1Theparietalperitoneumstaining(MassonTrichromeHEX40) 表2TGF一[31的浓度(pg/m1)检测结果 Tab.2TGF一[31concentrations(pg/m1) 注:调整一0.017 基底膜增厚.腹膜纤维化是由多种因素共同作用造成 的,包括非生理性透析液中的高渗性葡萄糖,糖基化终 末产物(AGEs),乳酸盐缓冲液和反复发生的腹膜炎 症[3”].TGF—B是一种影响细胞生长,分化和基因表达 的细胞因子,通过自分泌和旁分泌机制发挥多种生物 学功能.体外培养证实腹膜间皮细胞可以分泌TGF一 .高渗性葡萄糖刺激腹膜间皮细胞产生TGF一口增 加,呈剂量依赖性L3].高糖刺激间皮细胞产生TGF—B 的同时,细胞外基质如纤连蛋白(fibronectin,Fn)基因 表达水平及其蛋白产物也显着增加.抗TGF—B抗体可 以抑制高糖刺激的间皮细胞分泌的细胞外基质的产 生L6].体外培养中也证实外源性TGF一口可以刺激腹 膜间皮细胞分泌细胞外基质L9].甚至有学者提出Ang ?的致纤维化作用就是是通过TGF—B介导的.Ang? 不仅增加TGF一13mRNA的表达,还能使TGF一口转化 为活性形式.体外试验证明Ang?能使成纤维细胞 TGF—B的表达增加2,3倍.在许多肾间质纤维化的 动物模型中,肾间质TGF一~mRNA的表达明显增加, ACEI可降低,其表达水平,减轻肾间质纤维化的程 346西部医学2007年5月第19卷第3期MedJWestChina,May2007,Vo1.19,No.3 度.腹膜炎症时巨噬细胞的分泌产物使腹膜间皮细胞 分泌TGF—显着增加[9].发生腹膜炎的患者其腹透液 中TGF—的水平明显高于未发生腹膜炎的腹透患者. 反复发生腹膜炎的持续性不卧床腹膜透析(CAPD)患 者腹透液中可持续表达高水平的TGF—,该患者今后 发生腹膜纤维化的危险性比腹膜炎发生率低其腹透液 中TGF—浓度早期恢复到正常的患者要显着增加.本 试验中A组B组的腹膜纤维化与C组有明显差别,证 实了高糖可以诱导腹膜纤维化,而B组腹膜改变比A 组轻,同时伴随有血清和腹透液中TGF—的下降,不 仅说明一平苏可有效地抑制腹膜纤维化的进程,而且 , 平苏的作用机理可能和抑制转化生长因子一有密 切的关系,这和Duman等[10]在动物实验中给腹腔内 注入高渗性葡萄糖的大鼠饮食中添加依那普利,可部 分抑制大鼠腹膜纤维化和炎症细胞浸润的研究结果是 , 致的.因此推测血管紧张素转换酶抑制剂可通过抑 制TGF—来预防腹膜纤维化.并且本试验显示血清和 腹透液中的TGF—变化呈现同向性,通过血清可以预 测大鼠腹透液中的TGF—的浓度,从而预测大鼠腹 膜纤维化的危险程度.因为尿毒症患者多有不同程度 的血压升高,多在服用多种降压药.腹透患者在选择用 药的时候,可优先选择血管紧张素转换酶抑制剂,降血 压同时可以起到延缓腹膜纤维化的作用. 【参考文献】 [1]WolfG,MullerE,StahlRAK,eta1.AngiotensinIIinduced hypertrophyofculturedmurineproximaltubularcellismediated byendogenoustransforminggrowthfactor~t,JJ.JClinInvest, 1993,92:1366—1372. 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(收藕日期:2006-12—14;修回日期:2007—01—25;缩辑:陈彬) (上接第343页) 裹1各组术后l4天颈动脉NA/IA比和PCNA阳性细胞指数(士) Tab.1ComparisonofNA/IAratioandPCNApositivecellindexof carotidarteryinthreegroups(x士) 注:NA/tA:内膜/中膜面积比;PCNA:增殖性细胞核抗原;PTCA 组:PTCA球囊导管损伤组;Fogarty组:Fogarty球囊导管损伤组;调整 a=0.0253 3讨论 经冠脉介入治疗(PCI)后,因内皮损伤剥脱可以 刺激内弹力板下的血管平滑肌细胞增殖分裂,以及细 胞外基质形成,这是造成术后再狭窄的主要机制之 一 [2] .为研究血管损伤后的再狭窄机制,复制了多种动 物模型.研究显示兔颈总动脉球囊损伤后,主要变化是 损伤血管的平滑肌细胞迁移和血液细胞粘附,平滑肌 细胞增殖不明显;而大鼠血管内皮损伤后有大量的血 管平滑肌细胞增殖,是增生的新生内膜中主要的细胞 成分,所以大鼠颈动脉球囊损伤模型是较为理想的研 究对象[3].PTCA球囊导管是PCI中常用的导管之一, Fogarty球囊导管原用途是外周血管血栓去除术的主 要器材本研究比较了PTCA球囊导管和Fogarty球 囊导管对大鼠颈动脉损伤后14天,内皮剥脱和新生内 膜增殖的效果.结果显示,与对照组比较二种导管均能 达到较完全剥脱内皮的效果,随后的病理变化特点类 似,均可引起明显的新生内膜增殖.与对照组比较,无 论是用PTCA球囊导管还是Fogarty球囊导管,其 NA/IA比和PCNA阳性表达指数等指标的变化差异 均有显着性,提示二种不同球囊导管制备的大鼠颈动 脉损伤模型效果相似.研究者在进行与大鼠颈动脉球 囊损伤模型有关的研究中,应根据自己的实际情况,灵 活选材. 【参考文献】 [1]HayashiK,NakamuraS,MorishitaRtet口f.Invivotransferof humanhepatocytegrowthfactorgeneacceleratesre— endotheIiaIizationandinhibitsneointimalformationafterballoon injuryinratmodel[J].GeneTher,2000.7(19):1664—1671. 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