【doc】不同细胞周期大鼠肝实质细胞癌细胞粘弹特性研究

【doc】不同细胞周期大鼠肝实质细胞癌细胞粘弹特性研究 不同细胞周期大鼠肝实质细胞癌细胞粘弹 特性研究 ,430生物物理1999年 TURBULENCEUNDERMICROSCClPE LiuJunkang1)engGuohongguanZetaoLiuDaojianXuQiwang rRese~r(hCenteroJB?1"口,hirdMilitaryMedicalUniversityChongqing400038) ABSTRACI ThepurposeofthestudyistoobserveaHeV,Tformofturbulencecausedbvbi() logicaleffects————biologicalmicro—— turbulenceandexploreitsprocessandcontrolling factorsProteusmirabilisCrypticgrowthcellsweremicro—culturedtOrenderthc()c ctlrrenceofthespecificmovementofmicro—organisrasuspensionandthecontrolling factorsweredeterminedbycomparisonwiththecontro1trialsTheresu]tssh【)we(ttbat lurbu]enceundermicroscopewasgeneralJ3chaoticinwholebutregularinloca1.Itwa alsoconfirmedthattheturbulenceundermicroscopeexhibitedholloweffect.telnpera ture—dependentswitchingOHofoccurrenceandself,controlofsuspension0uantity 1tisclarifiedthatthisnewformofturbulenceisaspontaneousandselfc()ntr.1 process.whichprovidesanexperimentalrnodelwithcontrollableconditionsforstudies ofturbulenceandanewwayforresearches0nthemechanismandphysiologlca] ftmctionsoftheflowofbodyfluid KeyWords:ProleusrnirabilisCrypticgrowthcellTurbulenceChaos H25日收到 本文于1998年t】 j,; 生物物理第十五卷第二期 ACTABlOPHYSICASJNICA 一 九九九年六月 VO1.15No.2Jun.1999 不同细胞周期大鼠肝实质细胞癌细胞粘弹特性研究 ' 0 勉 4440004~ (重庆大学生物工程研究院重庄)f'/jJ/一 皙/z7.己 f. 摘要 烈胸腺嘧啶棱苷和被水仙碱顺序阻断法厦胸朦嘻啶桂苷双阻断法分别薇得同步化G.期和S 期虫丑胞,"细咆用期角度出发,采用微营吸吮技术叶大鼠肝实质细胞癌细胞的粘弹特性进行了测定 并线性固体模型叶窑验数据进行了拟夸,结果明:谊细胞具有高弹性和低粘性的总体特 征;G-期细胞与S期细胞相比具有高K-值和低值的特点,从而显示G-期细胞比S期细胞具有 更大的强度和更快的被动变形能力这些结果不仅反映了同步化细胞存在的细胞骨采状态的周期 性差异,也提示G.期细胞可能比S期细胞更适于在血流中存活和转移 关键词:HT【,细胞苎壁兰塑旦生些微管吸吮技术闩于砑爰P 牯弹性是主要由细胞骨架决定的一种细胞的本质属性,细胞骨架在细胞形态的支持,细胞 的变形,运动以及信息的传导等许多方面起着重要的作用,其结构或机能的缺陷是引起肿瘤细 胞接触非抑制增殖的重要原固国内外许多学者对于红细胞和白细胞的牯弹性作了大量的 研究,用于解释这些细胞在血流中的变形,牯附以及血栓形成等病理生理过程.以肿瘤细 胞运动和变形为基础的肿瘤生长侵袭以及转移过程中承受血流剪切及与内皮粘附等,也都与 粘弹性直接相关.另一方面,肿瘤细胞存在和延续的基础就是自主性的增殖,进入无限制的周 期性生长,在细胞周期生长的不同时相,其骨架蛋白的合成,组装也不同或有很大差别,从而直 观地表现为不同的形态及功能.在以往报道中,关于肿瘤细胞粘弹性的研究都没有进行分 细胞周期的测定,而只是作为一个整体来研究.本文从细胞周期角度出发,以微管吸吮技术对 肿瘤细胞的牯弹性进行了探讨. l材料与方法 1.1实验对象: 大鼠肝实质细胞癌细胞(HTC)由重庆医科大学临床生化教研室赠送,在本实验室以RP MI一1640/20%小牛血清传代培养.将细胞分为同步化G.期,s期和未同步化细胞三个实 验组. 1.2细胞同步化及检测方法: I2.1(期细胞同步化采取以胸腺嘧啶核苷和秋水仙碱顺序阻断后释放的方法,其简 要步骤如下:取两瓶处于对数生长期的细胞加入胸腺嘧啶核苷至其终浓度为2ram.l/I,3TU. 5%CO,潮湿空气中培养15小时,弃去培养液,以Hank's液清洗细胞后加入新鲜培养液及秋 水仙碱至其终浓度为lltg/m1.同上培养12小时,横向轻轻摇动两培养瓶收集中期细胞,于同 一 离心管中800r/min离心3分钟,弃上清,然后加入新鲜培养液及血清分两瓶常规培养.其中 丰项目受到国家自然科学基盘资助 牛物物理qqv{{ 一 瓶培养3小时后以002%EDIA25%胰蛋白酶消化收集,其部分细胞用于粘掸件实验, —7小时收集. 另一瓶则培养至6 122s期细胞同步化采取以胸腺嘧啶桉苷双阻断的疗法,简要步骤如下:取两瓶处于 对数生长期的细胞加入胸腺嘧啶核苷至其终浓度为2mmol/I.培养15小时.弃去培养液,以 Hank's液清洗细胞后加入新鲜培养液培养10小时,再次加^胸腺嘧啶枝苷至其终敞度为 2mmo[/L,培养15小时,弃去培养液,以Hanks液清洗细胞后加入新鲜培养液培养,其中一 瓶培养2小时以002%EDTA+O25%胰蛋白酶消化收集,其部分细胞用于粘弹性实验,另 一 瓶则培养至6小时收集: 1.23同步率检测:将收集样本用PBS液清洗,碘化丙啶(PI)染色3O分钟,片j流式细胞 仪检测,进行细胞周期分析. 1.3粘弹性实验: 采用微管吸吮技术(MicropiperteAspirationTechnique)对细胞的粘弹特性进行测试(详 细参见龙勉等的方法0). 1.4实验数据处理: 1.41由于本文是利用微管吸吮技术对活细胞进行的实验,其实验样品制备及粘弹 性实 验过程长达4小时,因此实验组的同步率取粘弹性实验前及实验后两样本的平均值.另外.因 G2/M期的时相过短,无法对其进行牯弹性测定. 142以标准线性粘弹性固体模型(KelvinMode1)拟合实验结果,本构方程如下: d+(K:)0o/St:Kl,+u【1+(K【/K2)]/ 其中K_和K为弹性系数,为牯性系数,和分别为应力和应变. 143对粘弹性参数进行两样本均数的t检验. 2结果 图1为流式细胞仪测定的未同步化细胞各时相细胞所占百分率,s+(/M期细胞百分 率占55O3%,呈现旺盛增长的状态.图示G.期细胞百分率为4497%: 图2中A,B分别为同步化于M期后释放培养3小时和7小时的流式细胞仪测定图,其 Channe[s Fig.1FlowcytoiTJeterdiagramofRenera HTCce【ls (期的同步率分别达6809%和7210%.平 均为7OlO%,维持于较稳定水平,能满足在 整个同步化G.期实验组粘弹性测定期问的 同步率要求 图3中A,B分别为阻断于(-/s交界后 释放培养2小时和6小时的流式细胞仪测定 图,其s期细胞的同步率分别达9885%和 97.18%,维持于较稳定水平,能满足同步化S 期实验组牯弹性测定的同步率要求一 图4为HTC细胞在微管中的典型变形 过程,表现为初始的快速弹性响应和其后缓 慢的蠕变过程 第2期不同细胞周期大鼠肝实质细胞癌细胞粘弹特性研究433 ;40 【2ll 090 { ? 60 30 280 2L0 { i Z 140 rhanlli1 Fig.2Flowcv【nLP1…EngramofG 【'hannek phaseHTCcells(A3hourB:7hour) 2(?l I50 E 【O0 50 B . …/ ('ha】ncChannels lqg.3FlowcytometerdiagramofSphaseHTCcells(A2hourB:6hour) 经Kelvin模型 和非线性迭代方法拟 台实验结果,得各实 验组粘弹性参数值 M?SD(表1);表 2.为HTC细胞变形 过程特征值:1/(K+ K)正比于细胞初始 变形程度,1/K正比 于细胞最大变形程 度,(K+K2)(Kx K)正比细胞蠕变时 间长短. 434生物物理1999年 Comparedwith(,phaseceils:P<0(3(31.nnumberofce|[smured 1ahie2Char~cteristicva】t】esOfdeformation.fHTCcells 3讨论 从总体来看,该细胞表现了高弹性系数(K,K:)和低牯性系数()的特征,这与吴泽志 等对人肝癌细胞的研究结果相符.另外,秦廷武'发现处于激活态的中性粒细胞K,K值增 高,Sung?也有类似结果,提示该牯弹特性可能为处于活跃功能态细胞的共同特征. G期细胞的K值明显比s期高,而值则显着比s期低,则无显着性差异.这可能反 映了不同周期细胞内骨架蛋白合成和组装的差异.根据Chein和吴泽志等,对细胞骨架与 牯弹性关系的研究结果分析,可能提示微丝对细胞,尤其是对G期细胞的牯弹性参数起主要 作用,而s期细胞则随着其管蛋白合成的增加,可能有更多的微管参与其中,并且这也与细胞 周期性的生物学行为相符,从而直观地表现为G期相比于s期细胞的高弹性与低 牯性的被 动力学特性.从表2来看,G期细胞的初始变形,最大变形和蠕变时间均比s期细胞要小,表 明G期细胞具有更大的强度抵抗外力以及更快的被动变形能力,而人体血液循环中一大部分 的肿瘤细胞被机械性涡流所杀死,G期细胞的这些特性显然有利于其在血液循环中的存活和 远端转移的成功.G期和s期细胞粘弹性的差异还可能通过其细胞骨架的差别反映了其对外 界信息传递的差异,运动能力的差异以及粘附性的改变等,这有待于进一步的探讨. 参考文献 1Okuda.K,Hepatocellularcarcinoma.fIbrogressHepatology,1992-15(5):948963 2GeertW,SchmidSchoabeine【a1Passivemechanicalpropertieshu…legkocytes.Bio砷 198l, ~sics』 36243—256 3ChieaSe 【alTheoreticalandemperimenta~~tud~cs0Hviscoelasticofer0cMembraneB~ophysics J,I978.24:463,478 4Sung,KLPSung.LACrlmrains,M-et口f.D似卅tcchangesincytotoxlcT一12~mphocyte…dldtd i~lingJ(llSciI98891I79—189 5蛇勉.吴泽志,王红兵等.肝癌细胞粘弹性的实验研究生翱翱理学擢.199612(1).169173 6昊释忐.张钢,l觉勉等.欷水仙素和长春花碱对肝癌细胞粘弹性的影响生物物理.1998,14(1】167171 7辜廷武,扬瑞芳,蒋稼欢等太鼠运动力竭岳生理生化因素对PMN粘弹性影响的宴验研究中国血渍流变学杂志. 第2期不同细胞周期大鼠肝实质细胞癌细胞粘弹特性研究435 l998.8(I)I6 8Chien.S.SungK【,1.Ejjfcolchicine?viscoelasticproperties0jneutrophilsBiopkysicsJ46 383386 9Chien,SetalRhe.1ogy[eukoeytesAnnNYAcadSci1987,516:333—347 INVESTIGATloNONTHE SYNCHRoNoUS VISCoELASTICITYoF HTCCELLS YuWeiqunSongGuanbinWuZezhiLongMianCaiShaoxi fBitwngineerlngInstitute.ChongqingUniversity,Chongqing400044) ABSTRACT Havingmadeuseofthemieropipetteaspirationtechnique,Wehereinvestigatedthe viscoelasticpropertiesofHTCcellsfromtheviewofcellcycle.ThesynchronousGL andSphasecellswereachievedthroughthymine——2——desoryribosideandcochicinese — quentialblockagemethodanddoublethymine——2—— desoryribosideblockagemethodre— speetivelyThesynchronizationresultsdetectedwithflowcytometershowedthatit couldmeettherequirementsoftheexperimentsnicely.Astandardlinearsolidvis— coelasticmodel(KelvinMode1)wasadoptedtofittheexperimentaldataTheresults indicatedthathighKI,Kvaluesandlowvaluewasthegeneralcharacteristics0f thecells;G1phasecellshadhigherKLvalueandlowervaluethanSphasecells had,whichendowedGIphasecellswithhigherelasticityandfasterpassivedeforma— bilitythanSphasecells.Theresultsmaybealsoreflectedthedifferenceofeytoskeleton betweenG1phasecellsandSphasecells.andsuggestedthatGtphasecellsweremore suitableforsurvivingandmetastasisncirculationthanSphasecells KeyWords:HTCcellsViscoelasticityCellcyclesynchronizati0n Micropipetteaspirationtechnique 事文于1998年10月29El收到一