巨细胞病毒感染导致听力损失的发病机制及宫内基因治疗的初步探索

巨细胞病毒感染导致听力损失的发病机制及宫内基因治疗的初步探索 华中科技大学 博士学位论文巨细胞病毒感染导致听力损失的发病机制及宫内基因治疗的初 步探索 姓名:程苾恒 申请学位级别:博士 专业:妇产科学 指导教师:闻良珍 20070501 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 巨细胞病毒感染导致听力损失 的发病机制及宫内基因治疗的初步探索 博士学位申请者 程苾恒 博 士 生 导 师 闻良珍 教授 中文摘要 第一部分 MCMV 感染导致听力损失的发病机制研究 【目的】建立小鼠巨细胞病毒(MCMV)感染导致听力损失的小鼠动物模型，研究高迁移率族蛋白B1(HMGB-1)细胞信号通路在其发病机制中的作用。 【方法】体外细胞培养法制备MCMV Smith株，细胞病变法(CPE)测定病毒致半数细胞感染量(TCID50)。ELISA法筛选MCMV IgM、IgG均阴性的BALB/c小 鼠 ，雌雄小鼠交配受孕，待分娩后随机选择乳鼠分为病毒感染组和实验对照组，于生后24h内颅内注射病毒悬液100TCID50/10μL和等量无菌生理盐水。观察各组幼鼠的生存发育情况;测定2周龄幼鼠的听性脑干反应(ABR);取幼鼠内耳组织分别采用RT-PCR和Western Blot法MCMV和HMGB-1 mRNA、糖基化终产物受体(RAGE)和NF-κB抑制物(IκBα)蛋白的达。 【结果】MCMV TCID50为105.22/0.1mL。病毒感染组幼鼠存活44/121只，存在明显生长发育异常;实验对照组幼鼠存活47/47只，无显著异常。ABR测定听阈显示病毒感染组为28.42?3.03 dB，实验对照组为15.66 ?0.38 dB，差异有非常显著意义(Plt0.01)。病毒感染组MCMV mRNA检测阳性，实验对照组阴性;HMGB-1 mRNA病毒感染组显著高于实验对照组(Plt0.05);病毒感染组RAGE蛋白表达较实验对照组明显升高，而IκBα明显降低，差异均有非常显著意义(Plt0.01)。 【结论】成功建立了MCMV感染导致听力损失的动物模型;HMGB-1/RAGE/NF-κB通路可能在CMV感染导致的听力障碍发病机制中占据重要地位。 I 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 【关键词】小鼠巨细胞病毒;听力损失;感染;高迁移率族蛋白B1 第二部分 pshHMGB-1-EGFP 双基因载体的构建和体外表达 【目的】构建HMGB-1短发夹状RNA(shRNA)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的双基因真核表达载体，并转染NIH/3T3细胞，以筛选出最有效的干扰质粒用于宫内基因治疗(IUGT)活体实验。 【方法】设计并合成5种DNA寡核苷酸双链，分别含有被9bp茎环(loop)序列间隔的4个HMGB-1基因片段的反向重复序列以及阴性对照序列NC，与携带EGFP基因的pGenesil-1质粒载体连接，构建重组质粒pshHMGB-1-EGFP a、b、c、d和阴性对照质粒pNC-EGFP。对重组质粒酶切鉴定和测序后采用脂质体转染法转染NIH/3T3细胞，采用荧光显微镜 和流式细胞仪 检测转染 效率 ， RT-PCR和Western Blot 测定 HMGB-1mRNA和蛋白水平。 【结果】Sal I酶切鉴定和测序结果表明重组质粒构建正确;在荧光显微镜下可以观察到NIH/3T3细胞内的绿色荧光，流式细胞技术检测转染率达57.25,;分别转染重组质粒pshHMGB-1-EGFP a、b、d的3组细胞HMGB-1 mRNA水平均呈不同程度下降，以质粒d最为明显，与其余各组差异具有显著意义(Plt0.05);转染重组质粒pshHMGB-1-EGFP a、b、d的3组细胞HMGB-1蛋白水平均降低，以d最为明显，与转染阴性对照质粒NC组和空白细胞组的差异具有非常显著意义(Plt0.01)。 【结论】成功构建了pshHMGB-1-EGFP双基因真核表达载体;重组干扰质粒能有效转染NIH/3T3细胞，并产生RNAi效应抑制HMGB-1表达，为RNAi用于IUGT的动物实验奠定了基础。 【关键词】RNAi;HMGB-1;EGFP;双基因载体 II 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 第三部分 pshHMGB-1-EGFP用于宫内基因治疗的初步研究 【目的】观察pshHMGB-1-EGFP重组质粒通过胎盘转染胎儿的效率和胎儿体内的 RNAi效应，探索RNAi联合IUGT治疗先天性疾病的可能性。 【方法】将孕12.5d BALB/c小鼠随机分为4组:pshHMGB-1-EGFP，脂质体组(1 ， ，组 ) pNC-EGFP ，脂质体组(2组 ) pNC-EGFP组(3组) 。 ，生理盐水组(4组 ) 分 别经尾 静脉注射DNA-脂质体复合物(或质粒DNA或无菌生理盐水)。72h后处死孕鼠，分 离胎盘和胎鼠各脏器，荧光显微镜检测胎盘和胎鼠体内EGFP表达;RT-PCR检测胎 鼠HMGB-1 mRNA水平;电泳迁移率改变分析(EMSA)测定胎鼠NF-κB活性。 【结 果】借助脂质体转染的1、2组孕鼠所有胎仔体内均可见绿色荧光，单纯质粒注射的3 组孕鼠所产41只胎仔均未检出荧光。1、2组胎盘绒毛膜板和迷路区、胚胎肝、肾、 脑组织局部尤其脑室、心肌纤维之间小血管、大血管壁、肺间质血管壁、脾皮质及 髓质血窦均可见较强烈绿色荧光表达，3、4组相应区域荧光表达微弱或未见明显荧 ; 光。1组HMGB-1 mRNA较其余3组明显降低，差异有显著意义(Plt0.05) NF-κB活 性较其余3组明显降低，差异有非常显著意义(Plt0.01)。 【结论】pshHMGB-1-EGFP RNAi效应抑制能在脂质体辅助下通过胎盘转染胎仔，并在胎仔体内 为发挥 HMGB-1表达和NF-κB活 性 ， CMV宫内感染导致的先天性疾病提示了一条可能的 治疗途径。 【关键词】HMGB-1 EGFP RNAi 宫内基因治疗 III 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文Pathogenesis of Hearing Loss Induced by Cytomegalovirus Infection and Preliminary Research on In Utero Gene Therapy ABSTRACT PART ONE Pathogenesis of Hearing Loss Induced by Infection of MCMV【Objective Objective Objective】To establish a murine model of hearing loss due to MCMV infection and probeinto the role of HMGB-1 cellular signal pathway in the mechanism of CMV-inducedhearing handicap.【Methods Methods Methods】The Smith strain of MCMV was passaged in NIH/3T3 cells in vitro and TCID50of the virus was quantitated in the light of CPE. MCMV-free BALB/c mice were screenedby ELISA assay of MCMV-specific IgM/IgG antibodies. After overnight mating，pregnantmice were separately bred. The newborn pups were randomly divided into two groups:MCMV-infected groupinfected group ， which was intracerebrally inoculated with viralsuspension in the first 24 hours after birth，and experimental control groupcontrol group，which was injected with sterile 0.9 sodium chloride of equal volume. We recorded theliving and developing condition of the pups，measured the ABR thresholds of the mice twoweeks later. MCMV and HMGB-1 mRNA in the cochleae were assayed by RT-PCR，in themeantime the expression of RAGE and IκBα were measured by Western Blot analysis.【Result Result】TCID50 of the virus was 105.22/0.1mL. 44 in the 121 pups of the infected group Resultsurvived with notable anomaly 2 weeks after birth，while all the pups of the control groupnormally developed. The ABR thresholds of the two groups were 28.42?3.03 dB infectedand 15.66?0.38 dB control，respectivelyPlt0.01. In the cochlear extract，MCMV mRNAwas detected in the infected group and the relative abundance of HMGB-1 mRNA were IV 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文3.124?1.836 and 1.077?0.085，respectivelyPlt0.05. According to the results of WesternBlot，the RAGE level was conspicuously higher while the IκBα apparently decreased in theinfected groupPlt0.01.【 Conclusion 】 The murine model of hearing loss induced by MCMV was successfullyestablished. The HMGB-1/RAGE/NF-Κb pathway might play an important role in thepathogenesis of hearing handicap caused by CMV infection.【Keywords Keywords Keywords】MCMV hearing loss infection HMGB-1 V 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 PART TWO Construction and In Vitro Expression of Double-gene Vector PshHMGB-1-EGFP【Objective Objective Objective】To construct an eukaryotic vector co-expressing shRNA specific to HMGB-1and EGFP，and transfect NIH/3T3 cells to screen out the most effective interfering plasmidfor IUGT in vivo.【Methods Methods Methods】We designed and synthesized five double-strand oligoneucleiotides of DNA，respectively including inverted repeat sequences of four different gene fragments ofHMGB-1 spaced by a 9bp loop sequence and a negative control sequence NC. The doublestrands were inserted into the plasimid pGenesil-1 carrying EGFP gene to constructrecombinant plasmid vectors: pshHMGB-1-EGFP a 、 b 、 c 、 d ， and pNC-EGFP. Therecombinant plasmids were digested by Sal I and identified by electrophoresis on agarosegel，meanwhile the plasmid DNA was sequenced. Then we transfected NIH/3T3 cells withthe plasmid/liposome complex. The transfection efficiency was estimated by fluorescencemicroscope and flow cytometer ， and the HMGB-1 level was assessed by RT-PCR andWestern Blot analysis.【 Result 】 The restrictive digestion and identification as well as DNA sequencing allindicated that the recombinant vectors were correctly constructed. The green fluorescenceof EGFP could be observed in transfected NIH/3T3 cells，and the transfecting efficacy is57.25 according to flow cytometry assay. The mRNA and protein level of HMGB-1 in theNIH/3T3 cells transfected by pshHMGB-1-EGFP a、b、d obviously decreased，among whichpshHMGB-1-EGFP d displayed the strongest inhibitory effectPlt0.05.【 Conclusion 】 The double-gene eukaryotic expression vector pshHMGB-1-EGFP wassuccessfully constructed. The could efficaciously transfectNIH/3T3 cells and perform recombinant interfering plasmid RNAi effect ，which set up foundation for applying RNAi inIUGT in vivo.【Keywords Keywords Keywords】RNAi HMGB-1 EGFP double-gene vector VI 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文PART THREE Preliminary Research on Application of the Recombinant Plasmid Vector PshHMGB-1-EGFP in IUGT【Objective Objective Objective】To probe into the possibility of treating congenital diseases combining RNAitechnology and IUGT by virtue of observing and evaluating the capability of passingthrough the placenta and transfecting the fetuses of pshHMGB-1-EGFP ， as well as theRNAi effect in the fetuses.【 Methods 】 The dams at day 12.5 post coitus were randomly divided into four groups:Group 1 inoculated with pshHMGB-1-EGFPliposome via the tail vein Group 2 withpNC-EGFPliposome Group 3 with pNC-EGFP alone Group 4 with aseptic normal saline. The dams were sacrificed 72 hours after inoculation ， meanwhile the placenta weredissected together with the fetal organs. EGFP expression in the placenta and fetal organswas examined by fluorescence microscope HMGB-1 mRNA was measured by RT-PCRthe activity of NF-κB was determined by EMSA.【Result Result Result】Green fluorescence could be seen in all the offsprings of the dams in Group 1 and2 none of the fetuses in Group 3 and 4 presented visible fluorescence. Fluorescence inGroup 1 and 2 was particularly obvious in the chorionic plate and labyrinth zone of theplacenta，fetal liver and kidney，local cerebral region especially proximal to the ventricles，capillaries among cardiac fibers ， the wall of main vessels ， the interstitial vessels of thelung，the cortex and sinus of spleen. Fluorescence was rather feeble or even could not beseen in corresponding regions of Group 3 and 4. The HMGB-1 mRNA and the NF-κBactivity were clearly lower in Group 1 compared with the other three groupsPlt0.05.【 Conclusion 】 PshHMGB-1-EGFP could efficaciously get through the placenta andtransfect the fetues with the help of liposome. HMGB-1 expression and NF-κB activitywere inhibited by RNAi effect caused by the plasmid， which presented a novel potentialremedy for congenital diseases due to intrauterine infection of CMV.【Keywords Keywords Keywords】HMGB-1 EGFP RNAi IUGT VII 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体， 均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担 。 学 位论文作者签名: 日期: 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完 全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即:学校有权保留并向国家有关部门 或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大 学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密? ，在________年解密后适 用本授权书。 本论文属于 不保密?。 (请在以上方框内打“ ? ”) 学位论文作者 签名: 指导教师签名: 日期: 年 月 日 日期: 年 月 日 华 中 科 技 大 学 博 位 论 文 前 言 人巨细胞病毒human cytomegalovirus，HCMV是属于疱疹病士 学 毒科β疱疹病毒亚科的线性双链DNA病毒，也是胎儿宫内感染中最主要的致畸病原 体之一，在所有活产儿中感染率达0.5,2.51。HCMV感染儿中仅10出生时即表现症 状: 皮肤瘀斑、肝脾肿大、黄疸、宫内发育迟缓、早产等。另外90,的感染儿出生 时无症状，其中10,15,留有听力障碍、脉络膜视网膜炎、智力缺陷等远期后遗症2， 3。在有症状的感染儿中听力损失发生率高达30,4。据统计美国每年至少有4000名 因HCMV感染引起听觉损害的婴儿出生5。闻良珍等在国家“八五”、“九五”攻关课题 中，对武汉、上海、沈阳三城市的调查显示，采用脑干听觉诱发电位(brainstem auditory evoked potential， ，BAEP) 检 测 17例先天性HCMV感染儿34只耳朵， ( 生后4个月时异常率为26.4, 9/34)，追踪至5.5,6.5岁时异常率仍达5.9,6。即 使仅单侧听力受损，也会对孩子的语言能力和学习成绩产生巨大影响，故探索HCMV 先天性感染所致听力损У姆?』啤?罢矣行Х乐问侄危员,じ腥居锥恼,橇 途穹?晌昀垂谕饩尴赴《竞拖忍煊行Х乐涡远喙匮芯康娜鹊 闼凇?HCMV已经被公认为是非遗传性先天性感音神经性聋(sensorineural hearing loss，SNHL)的最常见致病因素。目前多认为HCMV感染宿主的致病机制是:(1) 溶细胞性的病毒复制;(2)宿主对慢性感染细胞的免疫摧毁7。但其致病机制的具 体环节仍不清楚。一系列对先天性HCMV感染患者的颞骨病理学研究显示，内耳的 炎症反应较病毒的细胞病理学效应(cytopathological effect， CPE)更为泛化和显 著，提示在听力损失的发病机制中，内耳的炎性损伤可能起着与病毒本身引起的损 害同等或更重要的作用8-11。 高迁移率族蛋白B1(High mobility group box chromosomal protein 1， HMGB-1)是存在于真核生物细胞内的一类非组蛋白染色 体结合蛋白， HMGB1可分泌到胞浆乃至胞外， 并可与白细胞介素1 IL-1、白细胞 介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α TNF-α等重要炎症因子相互诱生，其效应通过糖基化终产物受体( Receptor for advancedglycation endproducts， RAGE)等受体介导，激发细胞内p38丝裂原活化蛋白激酶MAPK、 核 细胞外信号调节激酶1和2 ERK1/2、 因 子 NF-κB等多种信号转导机制， 从 1 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文而使细胞释放其他因子及功能发生改变12，对炎症反应起到维持和放大作用。HMGB-1在CMV感染导致炎性损伤的发病机制中的作用值得探究;它的促炎功能和特点，使得其比一些早期炎症介质更具有潜在临床应用价值。 小鼠巨细胞病毒(murine cytomegalovirus，MCMV)与HCMV在基因组结构和表达产物的功能上具有较高同源性，其生物学特性、致病性和致畸性相似13，这使得采用MCMV建立小鼠感染模型进行CMV感染发病机制以及药物干预的研究成为可能。在以往研究中，我们成功建立了颅内接种小鼠巨细胞病毒(murine cytomegalovirus，MCMV)感染新生小鼠的动物模型，发现MCMV能在颅内活动性复制 14。由于小鼠胎盘结构和内耳发育具有与人类不同的特殊性，这一动物模型可为CMV感染导致听力损失的机 感染的治疗仅以更昔洛韦理研究提供适宜的实验平台。 现阶段国际上对CMV (ganciclovir)等化学药物治疗为主，其机理主要为抑制HCMV DNA聚合酶活性，成人长期应用易产生毒性，且易诱生抗药菌株，妊娠期应用可以引起胎儿唇裂、无眼或小眼症等畸形，孕妇禁用。HCMV减毒活疫苗研究目前仍处于实验室阶段，远不能满足实践要求。因此，寻找一种安全可靠的围生期HCMV感染防治手段成为关乎国计民生的迫切要求，有利于提高我国出生人口质量，具有重大的现实意义和社会意义。 RNA干扰RNA interference， RNAi是一种在转录后水平特异地引起基因静默的现象。自从1998年Fire提出RNAi的概念以来，由于其作用的特异性、高效性， 成为一种有效而简便的基因敲除工具，被用于体外抗HCV、HIV、HBV的研究。采用体外合成针对HMGB-1的短发夹RNAshort hairpin RNA，shRNA，可诱导HMGB-1基因的转录后沉默(post-transcriptional gene silence，PTGS)，可能为治疗CMV感染所致炎性损伤提供一个潜在靶点。另一方面，利用质粒作为载体表达特定目的基因，近年来在感染性疾病，癌症和自身免疫病的治疗研究中广泛应用。质粒DNA一般不与宿主细胞基因组发生整合，故安全性较好。国外学者将重组质粒和脂质体混合，经尾静脉注射到妊娠小鼠体内，证实质粒能通过胎盘，在胎仔体内表达特定目的基因，在脂质体的辅助下其转染效率明显提高15-17，而在国内此研究尚属空白。我们设想，如携带 shRNA编码序列的重组质粒能自母体经过胎盘屏障进入胎体内，在全身及内耳局部表达特异 2 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文shRNA，诱导HMGB-1的PTGS，阻断炎症的级联.