【doc】抗松材线虫病赤松家系的抗性测定及组织病理学观察

【doc】抗松材线虫病赤松家系的抗性测定及组织病理学观察 抗松材线虫病赤松家系的抗性测定及组织 病理学观察 第31卷第4期 2007年7月 南京林业大学(自然科学版) JournalofNanjingForestryUniversity(NaturalSciencesEdition) Vol_31.No.4 Ju1.,2007 抗松材线虫病赤松家系的抗性测定及组织病理学观察 张艺,吴小芹,王钰,叶建仁 (南京林业大学森林资源与环境学院,江苏南京210037) 摘要:对自日本引进的赤松(Pinusdensiflora)27个抗病家系进行人工抗病性测定,结果发现抗病各家系对 3个不同来源的松材线虫(B"rs"^P"f^"sxylophilus)虫株都表现出不同程度的抗病性.且差异明显.综合 3次接种试验结果发现,引进赤松中有13个家系(1,4,5,6,7,8,13,14,15,17,2O,23和25号)抗病表现较好. 对5号抗病家系接种松材线虫后,分别按时间进程(4,8,12,24,36,48,72,96,12Oh)进行茎段取样,组织病理 学观察发现松材线虫在引进的抗病赤松体内的迁移速度较普通赤松慢,且松树茎内木射线细胞和树脂道泌 脂细胞周围的薄壁细胞出现病变较普通赤松晚,病变程度也比普通赤松轻. 关键词:赤松;松材线虫;抗病性测定;组织病理学 中图分类号:$432;$763文献标识码:A文章编号:1000—2006(2007)04—0110—05 ResistanceDeterminationandHist0path0l0gicalObservationofInduced PinusdensifloraFamiliesfromJapantoJEillrnpZc"xylophilus ZHANGYi,WUXiao—qin.WANGYu.YEJian—ren (CollegeofForestResourcesandEnvironmentNaniingForestryUniversity.Naniing210037,China) Abstract:Theresistanceof27wilt— resistantPinusdensiflOF(2familiesinducedfromJapanto 3isolatesofBuFsaphelenchuszylophiluswa'sdeterminated.Theresultindicatedthatal127 Pinusdensiflorafamilieshadresistancetothe3isolates,andthereweresignificantdiffer— encesfromeachother.,Itwasfoundbybarkinoculationthat13families(No.1,4,5,6,7,8, 13,14,15,17,20,23and25)weremoreresistantthanothers.Thehistopatho1ogica1observa— tionofNO.5familysampledat4,8,12,24,36,48,72,96,120hafterinoculationshowedthat B.xylophilusmigratedmuchslowerintheinducedpineseedlingsthaninthecontro1.Patho— logicalchangesinparenchymaradialcellandtheparenchymatouscellsaroundresinosiscells occured1aterinwilt— resistantpineseedlingsthaninthecontro1.Inaddition,thepathological changesoccuredmoregentlyintheinducedpineseedlingsthaninthecontro1. Keys:Pinusdensiflora;B"r5"p8Z8f"5xylophilus;Resistancedetermination;His— topathology 松材线虫病(B"rs?p8Z删f"sxylophilus)是发生在松属树种上的一种毁灭性森林 病害.该病已 对中国森林资源和生态环境造成严重的威胁l1].选育具有抗松材线虫病的松树品 种,是提高松树抗性 品质,保存松树资源,从根本上抵御松材线虫为害的有效途径之一.笔者对自日本 引进的27个赤松优 良抗病家系进行抗病性测定,并在此基础上选用较抗病的家系,就其组织和细胞受 松材线虫侵染后的病 理学反应进行了观察,以探讨抗病赤松与普通赤松之间的差别,从而为进一步弄清 抗病赤松的抗病机理 提供依据. 1与 1.1供试松材线虫与抗病赤松 选择来自日本和中国经致病性比较试验,分别表现为强毒和中强毒的共3个松材线虫虫株作为供 收稿日期:2007—01—05修回日期;2007—05—15 基金项目:国家林业局"948"创新项目(2003—4—38);江苏省农业"三项工程"资助项目(sx(2002)091j 作者简介:张艺(1979一),女,硕士生. *通讯作者(CorrespondingAuthor):吴小芹,女,教授,博士生导师. 2007年总第130期张艺等:抗松材线虫病赤松家系的抗性测定及组织病理学观察 试线虫.其中松材线虫1O号来自中国浙江黑松(Pinusthunbergii),致病性表现为中强毒;松材线虫19 号来自中国安徽黑松,致病性表现为强毒;来自日本黑松上松材线虫唐津3号的致病性表现为强毒.经 贝尔曼漏斗法分离纯培养保存的松材线虫,将获得的线虫用0.1的硫酸链霉素表面消毒3min,无菌 水洗涤3次后,分别移至培养5d的灰葡萄孢(Botrytiscinerea)的PDA平板上,25?下培养4,5d,待 线虫大量繁殖后,再用贝尔曼漏斗法分别分离线虫,用于接种试验. 从日本已选择出的抗松材线虫病赤松(Pinusdensiflora)家系中选择27个优良家系(2004年2月 从日本引种).种子产地分别来自日本茨城县,冈山县,熊本县和高知县.引进的抗病赤松和普通赤松 均在相同条件下室内播种,在生长季于野外培育0.5a后移置温室统一管理.各供试松树苗龄为1.5a. 1.2松材线虫的接种及松树抗病性观测 松材线虫的接种量为1000条/株.采用人工皮接法接种.对引进自日本的赤松27个抗病家系分 别用3个供试松材线虫接种(中强毒性松材线虫1O号为处理1,强毒性松材线虫 19号为处理2,强毒性 松材线虫唐津3号为处理3),然后置28,3O?温室中.以普通赤松为对照.每天观察松苗发病情况, 统计发病级值,计算感病率,感病指数一.病株分级标准为:0,健康;I,少数针叶褐变;1I,半数针叶褐 变死亡;?,大部分针叶褐变死亡,只剩少数绿叶;IV,所有针叶全部失绿褐变,全株枯萎. 采用SAS软件统计分析27个家系对3个不同来源的松材线虫虫株的抗病性差异. 1.3接种松材线虫后抗病赤松的组织病理学观察 选择抗病性测定中表现较好家系的1.5年生实生苗,以普通赤松作为对照.供试的松材线虫为中 国安徽19号虫株.接种方法与接种量与1.2节中的相同. 从松苗接种后第4小时开始定期(4,8,12,24,36,48,72,96,120h)取样.将切取的茎段迅速投人 FAA固定液(福尔马林:V冰醋酸:V.酒精一1:1:18)中固定,5h后取出脱水,透明,浸蜡和包埋.将包埋好的 材料经修块,粘块后进行切片.采用Leica旋转切片机横切茎段面(厚7m),再将切片粘到载玻片上. 切片干燥后,用番红一固绿双重染色,最后用中性胶封片.将抗病赤松组织切片在LeicaDMLB2 显微镜下观察,CanonPowershot$50摄影.描述颜色为染色后细胞和组织的颜色. 2结果与分析 2.1引进抗病赤松优良家系的抗病性测定 引进的赤松27个优良家系对3种不同来源毒表1引进赤松各家系对3个松材线虫虫株抗病性方差 性松材线虫表现出不同程度的抗病性,6O以上家分析 系的感病率低于普通赤松.其余40%0家系中的大Table1Variant"Yinresistantof27famofP? 部分家系虽在感病率上与普通赤松相近,但在感病 指数上却低于普通赤松,表现出良好的抗病性. 统计分析表明,抗性赤松对3个不同来源松材 线虫虫株的抗病性存在极显着的差异,且27个抗性 家系间的抗病性差异也极显着(表1). 尤其对日本唐津3号松材线虫,抗性赤松的抗 性明显.27个家系中有25个家系表现出较好的抗 densiflorato3isolatesofB.xylophilus 病性(除9,19号家系外).对中国浙江松材线虫,有15个家系(1,2,4,6,8,13,14,16,17,19,2O,23,24, 25,26号)的抗病性表现较好,其余12个家系在感病率上与普通赤松相近,但多数家系的感病指数均远 低于普通赤松.对中国安徽松材线虫,有7个家系(4,5,6,7,13,14和17号)表现出一定的抗病性,有 8个家系(3,15,19,22,23,24,25和26号)表现次之,而其余家系未表现出抗性(图1). 2.2松材线虫在抗病赤松与普通赤松中的迁移与扩散比较 选用抗病性表现较好的赤松5号家系接种19号松材线虫.接种4h后每隔一定时段取样观察. 接种后4h,在抗性赤松组织切片未观察到松材线虫,而在对照赤松皮层内已见有许多松材线虫. 接种后8h,抗性赤松接种点附近的皮层树脂道发现松材线虫,此后28h内,少量线虫迅速横向沿木射 线向髓部蔓延,纵向沿树脂道向上向下扩散.观察表明,松材线虫在普通赤松内无论是向下还是向上扩 一 111— 南京林业大学(自然科学版)第31卷第4期 l23456789l0Ill2l3l4l5l6l7l8l9202l222324252627CK 家系Families l2345678910Ill2l3l4l516l7l8l92021222324252627CK 家系Families 图1抗病赤松27个家系接种3个松材线虫虫株后的发病状况(接种12d) Fig.1O~currenceof27familiesofP.densiJlorainoculatedwith3isolatesofB.xylophilus(aft er12d) (口处理1;?处理2;口处理3) 散速度始终比抗性赤松快.普通赤松接种点处线虫在48h即侵染至髓心处,72h扩散至向上1.5cm 和向下3.5cm的髓心;而抗性赤松接种点处线虫接种后96h才侵染至髓心部位,到 ,远离接种 120h时 点部位的髓心细胞仍较正常.引进的抗性松苗与普通松苗在受害程度上表现出明显的不同. 2.3抗病赤松受松材线虫侵染后的组织病变 接种4h后,抗病赤松接种点细胞结构完整,未发生明显的病变.在所取茎段中未发现松材线虫 (图2A).普通赤松的皮层树脂道发现松材线虫(图2a).在番红,固绿双重染色下,线虫虫体染成深绿 色,取样部位细胞未见明显病变;接种8h后,抗病赤松接种点及接种点上1.5cm处皮层树脂道发现线 虫(图2B),但线虫数量较少.普通赤松中,线虫在接种点及接种点上1.5cm处皮层树脂道内大量繁殖 (图2b),皮层薄壁细胞染色不均匀,染色质凝集成颗粒状;接种12h后,抗病赤松接种点及接种点上 1.5cm处皮层发现线虫,线虫破坏了皮层的薄壁细胞(图2C),木质部树脂道周围细胞增生,破裂.普 通赤松木质部围绕树脂道泌脂细胞的薄壁细胞和木射线细胞变形,破裂,木树脂道周围细胞增生(图 2c),形成层部分细胞死亡,皮层与木质部剥离.接种点下3.5cm处,抗病赤松与普通赤松皮层薄壁细 胞均有可见的病理变化,细胞质凝集成颗粒状,但抗病赤松病变细胞问或发生,而 普通赤松发生的细胞 连成一片;接种24h后,抗病赤松接种点,线虫在皮层大量繁殖,木射线细胞部分变形,木树脂道发现线 虫,部分树脂道周围细胞破裂;接种点下3.5cm处,木质部树脂道薄壁细胞与木射线细胞变形较轻(图 2D).此时普通赤松接种点处形成层开始剥离(图2d);接种点及距离接种点上的木质部树脂道与木射 线都出现了变形,死亡,甚至严重的破裂;接种36h后,线虫侵染至抗病赤松接种点处近髓心的木树脂 道(图2E).在接种点及距离接种点上下1.5cm处,木射线细胞出现不同程度的变形,死亡,部分木树 脂道周围细胞死亡,破裂.线虫在引进赤松皮层中繁殖,皮层薄壁细胞遭到破坏.在普通赤松接种点附 近及远离接种点部位的皮层线虫大量繁殖,皮层薄壁细胞被完全破坏,木射线破裂,木树脂道薄壁细胞 死亡(图2e);接种48h后,抗病赤松接种点木质部树脂道泌脂细胞已看不到细胞核,树脂道薄壁细胞死 一 1]2一 ?印??加0?鲫??加0 摹?.,pl.ul??8?一口瓣《Pu?8?10辍《 2007年总第130期张艺等:抗松材线虫病赤松家系的抗性测定及组织病理学观察 亡,木射线细胞变形(图2F).在普通赤松接种点处线虫在木质部树脂道大量繁殖,髓心细胞部分破裂, 死亡(图2f);在距离接种点下3.5cm处可以看到大量的线虫由木射线向髓心移动,髓心部分细胞破裂; ,抗病赤松接种点处木质部树脂道薄壁细胞死亡,木树脂道空洞,髓心部接种72h后 分细胞死亡(图 2G).线虫侵染至近髓心树脂道;在取样茎段中木质部树脂道薄壁细胞木射线细胞半数死亡.线虫在 皮层大量繁殖,皮层遭到破坏.普通赤松接种点处,线虫侵染至髓心及近髓心树脂道,髓心细胞半数死 亡;在取样茎段中均可见木树脂道周围薄壁细胞死亡,破裂,木射线细胞死亡,木射线开裂(图2g);接种 96h后,引进赤松接种点处木质部树脂道形成空洞,但髓心仍可见到健康细胞(图2H).距离接种点上 1.5cm处,木质部树脂道形成空洞,木射线细胞死亡,破裂,髓心细胞较正常.而距离接种点下3.5cm 处木质部树脂道薄壁细胞死亡,部分树脂道破裂,但髓心细胞健康.普通赤松接种点处形成层细胞死 图2抗病赤松和普通赤松接种松材线虫后的组织病理学观察 Fig.2Histopatho1ogyobservationbetweenresistantandcontrolP.densiflorainoculatedwit hB.:cylophilus (A.接种4h抗病赤松,×200接种4h普通赤松(箭头示松材线虫),×800;B.接种8h抗病赤松(箭头示松材线虫).×400;b.接种 8h普通赤松(箭头示松材线虫),×400;C.接种12h抗病赤松皮层薄壁细胞被线虫破坏,×400接种12h普通赤松围绕木树脂道 的薄壁细胞和木射线细胞变形,破裂,×400;D.接种24h抗病赤松木质部树脂道薄壁细胞与木射线细胞轻微变形,×200;d.接种24h 普通赤松木树脂道与木射线均出现变形,死亡,甚至严重破裂,×400;E.接种36h线虫侵染至抗病赤松近髓心的木树脂道,×200;e. 接种36h线虫在普通赤松皮层大量繁殖,皮层薄壁细胞被完全破坏,×200;F.接种48h抗病赤松木树脂道泌脂细胞树脂道薄壁细 胞,木射线细胞死亡,×800;f.接种48h线虫在普通赤松木树脂道大量繁殖,×400;G.接种72h抗病赤松木质部树脂道薄壁细胞死 亡,木树脂道空洞,×400;g.接种72h普通赤松线虫侵染至髓心,髓心细胞半数死亡,×400;H.接种96h抗病赤松髓心仍可见到健康 细胞,×400;h.接种96h普通赤松髓心细胞死亡,×400;I.接种120h抗病赤松髓心部分细胞仍较正常,×400;i.接种120h普通赤松 髓心细胞死亡,形成空洞,×400) 一 1]3一 南京林业大学(自然科学版)第31卷第4期 亡,皮层与木质部剥离(图2h);接种点处的髓心细胞均死亡,木射线与树脂道薄壁细胞死亡,形成大面 积空洞;接种120h后,引进赤松接种点处形成层与木质部剥离,木射线与树脂道细胞死亡,髓心半数细 胞死亡(图2I).距离接种点上1.5cm,木射线与树脂道细胞死亡,形成空洞,髓心有部分细胞死亡;线 虫在距接种点下3.5cm处木树脂道内大量繁殖,近髓心树脂道形成空洞,但髓心部分细胞仍较正常. 普通赤松接种点及远离接种点部位,轴向和射线薄壁细胞都已死亡,形成空洞(图2i). 3讨论 引进的抗病赤松27个家系对3种来源不同的松材线虫的抗病性存在显着差异,且对来自日本的强 毒松材线虫表现出的抗病性高于对中国本土的强毒松材线虫.这可能是因为日本线虫与中国线虫在致 病力上存在差异,且引进的抗病赤松以往曾针对日本本土松材线虫进行了抗性筛选.在自然条件下,不 同种,同种不同种源的松树对松材线虫的抗性存在差异_8_.在实验中,抗病赤松各家系间抗病性差异 明显(P<O.0001),其中有13个家系(1,4,5,6,7,8,13,14,15,17,20,23和25号)表现良好,约占供试 家系的5O. 试验中发现引进的抗病赤松个别家系较普通赤松早出现针叶下垂失水的情况,但感病后病程发展 缓慢,较长一段时间停留在发病工级水平上.而普通赤松一旦出现感病症状,病情迅速发展,很快枯萎 死亡.这表明抗性赤松具有较强的抗病性,可能是生理调节能力或补偿能力较强,而普通赤松一旦失水 就表现为茎枯,很快死亡.这方面仍需进一步研究. 所引进的抗性赤松优良家系是日本经过抗性单株选择,穗条嫁接和两次人工接种筛选后所确定的 92个赤松无性系中的27个.此次抗病性测定结果表明,大部分家系的抗病性与其在原产地的抗病性 评价基本一致l_9],也有部分与原产地结论不同,这可能与不同环境条件下的同种松树对松材线虫的抗性 存在差异,而且松树在不同立地条件,不同生长状况和不同的生长阶段其抗病性有所不同均有关[]. 日本在进行抗病松苗抗性测定时多采用2年生野外松苗接种,而此次试验供试松苗为1.5年生且在温 室中完成接种试验,加上用于接种的松材线虫及其浓度都不相同,试验结果也就可能存在差异. 对引进松苗的早期组织解剖学观察表明,松材线虫在引进的抗性赤松内的扩散速度比在普通赤松 内要慢,且病程发展的进程也存在明显的差异,抗性赤松体内木射线细胞与围绕树脂道泌脂细胞的薄壁 细胞,出现病变要比普通赤松晚.因此,抗性赤松的受害程度明显比普通赤松轻,表现出一定的抗病性. 同时,通过组织切片观察到在松材线虫还没有大量繁殖前,松苗细胞已经出现了明显的内部变化,这可 能与松材线虫所分泌的一些物质在松苗中转导有关,对这方面还需进一步的研究. 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