促红细胞生成素受体在心肌缺血再灌注过程中的表达及功能

ZJNSF 浙江省自然科学基金申请书( 2005版) 第1页 同行评议组别 生理、病理及病理生理学 项目编号 Y205695 浙江省自然科学基金 申 请 书 申报类别: 一般项目 项目名称: 促红细胞生成素受体在心肌缺血再灌注过程中的表达及功能 申 请 者: 叶挺梅 电 话: 0578-2271390 依托单位: 丽水学院 通信地址: 丽水市丽水学院科研处 邮政编码: 323000 E-mail : ytmy@eyou.com 申报日期: 2005-5-30 浙江省自然科学基金委员会 二OO五年制 基本信息 申请者信息 姓 名 叶挺梅 性别 女 出生日期 1954年04月01日 最终学位 其他 获学位年份 职称 副教授 主要研究领域 心血管呼吸生理与药理 E-mail ytmy@eyou.com 电 话 0578-2271390 个人网页 依托单位 丽水学院 证件类型 身份证 证件号码 332521540228002 申请者是否近三年调入在浙单位工作 否 调入时间 申请者曾主持的浙江省自然科学基金资助项目编号: 申请者正在主持的国家和省部资助经费在20万元及以上的研究项目名称、来源和研究期限: 项目基本信息 项目名称 促红细胞生成素受体在心肌缺血再灌注过程中的表达及功能 申报类别 一般项目 研究属性 前瞻性应用基础研究 同行评议组别 医药科学/生理、病理及病理生理学 依托基地名称 预计研究年限 2006年01月－2008年12月 总经费预算 8.0万元 申请经费 8.0万元 项目研究目标、内容和意义简介(限400字) 研究缺血性心脏病时EPO受体的表达和功能。探讨心肌细胞表达EPO受体的调控机制，缺血再灌注损伤时心肌组织EPO受体表达分布和时间特征，以及外源性EPO的心脏保护作用与心肌EPO受体功能的关系。同时，观察外源性EPO治疗对于心脏EPO受体表达情况的影响等。通过研究以明确缺血性心脏病时是否存在EPO/EPO受体的内源性保护机制和外源性EPO治疗的最佳时间窗，为临床使用EPO治疗急性心肌缺血性损伤提供实验依据。 关键词（不超过4个） 心肌；促红细胞生成素；受体；缺血再灌注 疾病的生理、病理及病理生理学基础 重点资助方向 重要疾病机理及防治研究 项目组主要成员 编号 姓名 出生日期 性别 职称 学位 单位名称 电话 项目分工 每年工作时间（月）（（(月) 1 叶挺梅 1954年04月01日 女 副教授 其他 丽水学院 0578-2271390 负责人 6 2 任少华 1953.08.15 男 主任医师 学士 丽水市中心医院 0578-2206355 临床试验 3 3 秦丽君 1953.06.01 女 主治医师 其他 丽水市中心医院 0578-2280026 分析试验 3 4 陈伟伟 1958.03.06 男 主任医师 硕士 丽水市中心医院 0578-2681120 临床试验 4 5 郭伟 1973.04.06 女 讲师 硕士 丽水学院 0578-2271330 基础实验 8 6 陈楠 1975.04.06 女 助教 学士 丽水学院 0578-2271330 基础实验 10 7 总人数 高级 中级 初级 博士后 博士生 硕士生 参加单位数 6 3 2 1 0 0 0 1 说明：1.个人介绍部分申请者必须填写，其他人员可以不填写； 2.高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生及参加单位数由申请者负责填报，总人数自动生成； 3.第一人必须是申请者，信息从前面自动读入，但每年工作时间必须手工录入。 个人介绍： 叶挺梅：大学本科，副教授，浙江大学动物科学院兼职硕导，浙江省生理科学理事。主要从事医学生理学、生物学等生命科学研究。积累了丰富经验，已发表论文及共30余篇（本），其主要发表学术论文有： 1、 叶挺梅、任少华、秦丽君，钝性心肌挫伤临床诊断的研究进展，医学综述杂志，2005年5月第5期。 2、 叶挺梅，丽水市社区居民心脑血管病危险因素调查，浙江预防医学，2004年第16卷第7期。 3、 叶挺梅、叶治国、高琴、夏强，线粒体SLO1通道激活引起的心肌保护作用涉及线粒体渗透性转换机制，浙江大学学报（自然科学版）2005年第6期。 4、 叶挺梅、朱满莲，消化系统恶性肿瘤病人及家属心理健康状况调查，中国健康心理学杂志，2005年第13卷第3期。 5、 叶挺梅，关于慢性阻塞性肺部疾病急性恶化的临床研究进展，医学综述杂志，2000年第6卷第6期。 6、 叶挺梅，生理学多媒体仿真教学的改革与探讨，丽水学院学报，2004年第26卷第7期。 7、 叶挺梅，类风湿性关节炎患者在骑车和水中奔跑时的心肺反应，国外医学，1994年第4期。 8、 叶挺梅，副主编，生理学纲要及试题，中国科学技术出版社出版，2002年1月。 9、 叶挺梅，主编，人体生理学目标检测，人民中国出版社出版，1998年12月 10、 叶挺梅，主编，生理学学习辅导，中国科学技术出版社出版，1994年12月。 主要主持的项目： 1、 菊米对心血管作用的有效成份及其提取技术研究，项目编号：2004C33104，浙江省科技厅项目，资助15万元，研究起止年月：2004年1月至2005年12月。 2、 混胺铂类配合物的合成及其抗肿瘤作用的研究，项目编号：20040496，浙江省教育厅项目。 3、 欠发达地区中老年身心健康研究，项目编号：KY04003，丽水学院校级项目，立项时间：2004年3月。 学术奖励：1、获第十二届（2001---2002年）浙江省自然科学优秀论文二等奖（证书编号：032087003） 2、获丽水学院教师现代教学技能比赛三等奖，证书编号： 2003145 任少华： 主任医师，从事心血管、呼吸方面研究，现任丽水中心医院呼吸科主任医师、科教科副科长。是国家级刊物《国外医学呼吸分册》第三届编委会和《国外医学肿瘤学分 册》第二届编委会特邀编辑。在心血管和呼吸专业领域具有较高的学术造诣。率先开展了“纤维支气管镜替代胸腔镜检查和治疗” “纤维支气管镜引导下经鼻气管插管”，“经纤维支气管镜选择性支气管造影”，“根据支气管肺泡灌洗液内毒素水平快速诊断革兰氏阴性菌肺炎”和“控制性高碳酸血症机械通气治疗”和“胸管负压吸引引流治疗巨型肺大疱”（该技术被北平医药信息中心收编于《中国疑难病求医问药信息库》）等诊疗新技术。善于学习引用国际先进医学科学技术，应用于临床实践，积极总结临床经验和引进先进医学知识，在《中华结核和呼吸杂志 》、美国《Chest 》和英国《Thorax》等大型权威杂志发表临床论文１５篇，其中多篇被《Biological Abstract》，《Current Science 》等国际索引文献收录。多次获省自然科学论文奖。 在国家级刊物发表综述文章50余篇，文摘200余篇。公开发表文字40余万，连续三届荣获“世界科技译报”好译者奖。丽水市第三批有突出贡献中青年专业技术人才。 申请经费预算 8.0 万元 开支项目名称 计算根据及理由 金额（万元） 1．信息费 资料费文印费上网信息费论文版面费 0.5 2．专题学术活动费 国际国内学术会议差旅 会务费 国内外期刊论文版面费 0.5 3．仪器和设备购置费 实验等相关仪器如显微镜电子天平 0.5 4．能源材料费 公办耗材费实验动物实验药品等 5.5 5．计划管理费 按学校规定提取 0.4 6．人员费 加班等补助费 0.6 注：开支范围和参见《浙江省省级科技项目经费管理暂行办法》（浙财教字[2002]20号）。 申请者承诺： 我保证： （1）申请书内容是真实的； （2）恪守科学道德，伦理道德的基本原则； （3）项目组成员知晓申请书内容，并自愿参与研究工作； （4）已如实填报申请者正在主持的国家和省部资助经费在20万元及以上的研究项目名称、来源和研究期限； （5）如果获得资助，我将履行项目负责人职责，严格遵守浙江省自然科学基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，认真开展工作，按时报送有关材料。 若填报失实或违反规定，本人将承担全部责任。 签字： 日期： 项目依托单位承诺: 已按规定对申请人的资格和申请书内容进行了审核。申请项目如获资助，我单位保证对计划实施所需要的人力、物力和工作时间等条件给予保障，严格遵守浙江省自然科学基金委员会有关规定，督促项目组遵守科学道德和伦理道德的基本原则，督促项目负责人和本单位项目管理部门按照规定及时报送有关材料。 依托单位公章 日期 . 促红细胞生成素受体在心肌缺血再灌注过程中的表达及功能 1、项目研究意义 随着溶栓和急诊介入治疗的广泛开展，心肌梗死患者短期和长期的生存率得到显著提高，但仍有相当部分存活的患者随后发生进行性心力衰竭。缺血/再灌注导致的心肌损伤是目前心机梗死治疗中有待解决的关键问题，有文献报道，心肌缺血/再灌注过程中凋亡的发生是导致心肌损伤的重要机制之一[1]。凋亡是细胞程序性死亡，因此，可以通过早期干预减少凋亡的发生，从而降低心肌在缺血复灌过程中的损伤[2]。在动物实验中已经证实，应用抗凋亡药物，细胞因子或采用基因治疗可减轻心肌缺血/再灌注损伤。但目前某些抗凋亡尚不能应用于临床，而已有抗心肌再灌注损伤的临床试验未见显著的心肌保护作用[1]。因此，有必要探索一种既可用于临床，又具有显著心肌保护作用的治疗方法，作为心肌梗死再灌注治疗的辅助治疗，以减轻心肌损伤。 促红细胞生成素（Erythropoietin，EPO）是第一个被克隆的造血生长因子，以往主要用于促进红细胞生成以纠正贫血，在临床上已被广泛使用十余年。其造血活性的主要机制为抑制晚红系祖细胞凋亡而非直接刺激细胞生成[3]。随着EPO受体在脑、肝脏、子宫等器官及实体肿瘤组织的发现，EPO的髓外作用日益受到重视[4]。近十年的研究主要集中于EPO的脑保护作用， EPO/EPO受体通过抗凋亡、抗炎、抗氧化等机制，可预防或减轻神经系统缺血/再灌注损伤[5]。一项已完成的EPO对缺血性中风病人安全性和疗效的随机双盲临床试验，对于中风8小时内的患者，连续3天经静脉使用重组EPO（recombinant EPO, rEPO），观察30天显示rhEPO对于急性缺血性中风患者能有效缩小梗塞面积和改善临床表现[6]。同时在心肌细胞也发现EPO受体的存在。已有研究表明EPO可在细胞水平显著减少缺氧诱导的大鼠心肌细胞凋亡，同时器官水平研究表明EPO可减少缺血再灌注心肌损伤和梗死心肌的范围，改善心功能[7]。在缺血再灌注的不同时期，包括心肌缺血前、缺血时及再灌注时使用单一剂量rEPO均能产生显著心肌保护作用[8]。由于单一剂量EPO治疗后3~5天才可见外周循环中红细胞增加，因此EPO的心脏保护作用与增加红细胞浓度无关，直接保护机制可能包括：（1）减少心肌细胞凋亡；（2）稳定内皮细胞和促进血管生成[9]；（3）动员骨髓内皮祖细胞[10]；（4）减轻缺血和再灌注引起的炎症反应[11]等。 体内EPO主要由肾脏分泌入循环，EPO和细胞膜的EPO受体结合发挥生物活性，激活多种信号转导途径发挥抗凋亡作用[12]。多种神经细胞可分泌EPO和表达EPO受体，EPO/EPO受体系统被认为是脑缺血损伤的内源性保护机制，在脑缺血/再灌注或持续局部脑缺血时，神经细胞上调EPO受体和分泌EPO增强，并且上调EPO受体要早于增加EPO分泌[13，14]。EPO受体在成年大鼠心肌细胞、内皮细胞和纤维母细胞均有表达[15]，细胞EPO受体表达可能与缺氧，胰岛素样生长因子（insulinlike growth factor, IGF），肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF），白介素-1（interleukin, IL-1）和白介素-6（interleukin6, IL-6）等有关[4]。目前尚无心肌组织分泌EPO的证据，调控心肌细胞EPO受体表达的因素尚不明确，对于心肌梗死时是否也存在EPO受体上调尚不清楚。 EPO受体的表达分布和时间，对于外源性EPO的治疗效果起决定作用。在大鼠离体心脏Langendorff灌注模型中，40min缺血和2h再灌注，EPO受体的表达量和在心肌细胞内皮细胞和纤维母细胞的表达分布未见显著改变，并且发现外源性EPO治疗使心肌组织EPO受体下调[15]。是否持续缺血或更长的再灌注时间能使EPO受体的表达量和分布产生影响，以及EPO治疗是否会导致EPO受体持久下调等情况，需进一步研究。 本项目研究缺血性心脏病时EPO受体的表达和功能。重点探讨心肌细胞表达EPO受体的调控机制，缺血和再灌注损伤时心肌组织EPO受体表达分布和时间特征，以及外源性EPO的心脏保护作用与心肌EPO受体功能的关系。同时，观察外源性EPO治疗对于心脏EPO受体表现情况影响等。通过研究以明确缺血性心脏是否存在EPO/EPO受体的内源性保护机制和外源性EPO治疗的最佳时间窗，为临床使用EPO治疗急性心肌缺血性损伤提供实验依据。 2、项目研究目标及与申请者研究工作长期目标的关系 研究目标： 探索心肌细胞表达EPO受体的影响因素，明确心肌缺血损伤时是否存在EPO/EPO受体的内源性保护机制。探索外源性EPO对于心肌保护作用及与EPO受体表达的关系，明确EPO治疗的时间要求。EPO治疗缺血性心脏病提供实验依据。 与申请者研究工作长期目标的关系： 本课题组成员长期从事心血管疾病治疗和细胞移植治疗的研究，在心血管生理学、细胞生物学分子生物学、分子遗传学和病理学等方面做了大量的工作，积累了丰富的理论和实践经验。 3、项目研究内容，研究和进度安排 研究内容： 第一部分：体外实验：大鼠心肌细胞EPO受体表达及影响因素 1、低氧及IL-6等细胞因子对体外培养的心肌细胞EPO受体表达的影响： 观察体外培养的心肌细胞EPO受体表达情况，以及在低氧和/或与心肌梗死相关的IL-6等细胞因子对于心肌细胞EPO受体表达的影响。 2、外源性EPO对缺氧心肌细胞损伤的保护作用及EPO受体的表达变化： 观察外源性EPO对于心肌细胞的保护作用，以及EPO处理对于心肌细胞表达EPO受体的变化。 第二部分：在体实验：缺血损伤对于心肌细胞表达EPO受体的影响 1、缺血性损伤时心肌表达EPO受体改变及分布：观察缺血再灌注及心肌梗死模型中缺血区域心肌细胞、内皮细胞及间质细胞表达EPO受体情况及随时间的改变。 2、缺血性心肌损伤时循环中EPO浓度改变及时间特征：观察缺血再灌注及心肌梗死时循环中EPO浓度改变，随时间的浓度曲线，以及与EPO表达相关的细胞因子水平的改变。 3、外源性EPO对缺血心肌的保护作用及对EPO受体影响：观察外源性EPO对于缺血再灌注及心肌梗死的保护作用和EPO治疗开始时间及维持治疗对于保护作用的影响。观察外源性EPO对于缺血心肌表达EPO受体的影响。 研究方案： 第一部分 体外培养的心肌细胞EPO受体表达及影响因素 1、新生大鼠心肌细胞原代培养，光镜及免疫细胞化学染色鉴定； 2、低氧、低糖、TNF、IL-6、EPO等单一或复合条件下培养心肌细胞，使用半定量RT-PCR，Western Blot和免疫细胞化学染色检测EPO受体表达情况。并与正常条件培养的心肌细胞对照。 3、低氧条件下培养的心肌细胞中加入不同浓度的rEPO，TUNEL法检测凋亡细胞，免疫细胞化学染色检测凋亡细胞和存活细胞表达EPO受体表达情况。 第二部分 缺血损伤对于心肌细胞表达EPO受体的影响 1、钳夹3min或结扎大鼠前降支分别建立大鼠心肌缺血/再灌注和心肌梗死模型。 2、再灌注或心肌梗死即刻、2h、6h、12h、24h、4d、7d等不同时间，使用半定量RT-PCR，Western Blot和免疫组织化学染色检测EPO受体表达情况，同时以免疫组化确定细胞类型：心肌细胞（TnT、Cardiac myosin）、内皮细胞（VE-cadherin, factorⅧ）、血管平滑肌细胞（anti-a-smooth muscle myosin）及疤痕组织（1型和3型胶原抗体混合物）的特异性抗原。TUNEL法检测凋亡细胞。检测不同的时间点血浆EPO及IL-6等细胞因子浓度的变化。 3、分别在建立模型前、再灌注或心肌梗心即刻、心肌梗死后3h、6h等不同时间点开始皮下注射不同浓度的rEPO（1000-5000U/Kg，单交或1/d*7），以假手术组和生理盐水治疗组为对照。 4、不同时间获取大鼠心脏，观察心功能主要参数改变，观察梗塞区域病理变化，测定梗死面积，原位凋亡检测和EPO受体抗体双染色检测相关区域凋亡细胞数量，以及EPO受体表达的关系。 关键技术： （1）具有心肌细胞细胞原代培养、细胞移植、基因治疗及动物体内实验等相关研究经验和技术。 （2）本校动物实验、病理检测、细胞分类鉴定、凋亡检测及其他实验条件已具备，可配合实验的完成。 （3）免疫组织化学双抗体染色：可能出现两种抗体染色过程相互干扰，拟根据不同的细胞特导性抗体和EPO抗体双染色，摸索最佳的实验方案。 研究进度计划： 整个研究需要3年完成 （1）2006.1~2006.12 心肌细胞原代培养，低氧及细胞因子等条件下心肌细胞表达EPO受体的改变。 （2）2007.1~2007.6 EPO对于体外培养心肌细胞的缺氧损伤保护作用及对于EPO受体表达的影响。 （3）2007.6~2008.12 在大鼠心肌缺血/再灌注和心肌梗死模型中观察EPO受体表达情况，外源性EPO对心肌的保护作用及对受体表达的影响。总结实验资料、撰写论文。 技术路线： 体外实验 在体实验 4、项目创新之处 （1）EPO被认为具有多种器官的保护作用。脑缺血损伤时，EPO/EPO受体上调发挥内源性保护机制，目前对于心肌缺血时是否存在同样的内源性保护机制尚不清楚。本项目探索心肌缺血/再灌注损伤时EPO受体表达的改变，以明确是否存在内源性的EPO心肌保护机制。 （2）已有的研究主要观察EPO对心肌缺血时的保护作用及信号途径，对于EPO受体在心肌组织中的表达分布及缺血时的表达改变情况尚未见系统研究。本研究重点观察心肌缺血/再灌注损伤时相应区域EPO受体的表达情况及时间特征，并研究EPO的心肌保护作用与EPO受体的关系。 （3）EPO长期治疗肾性贫血时出现疗效下降的部分原因为EPO受体下调，目前对于EPO治疗后心肌组织EPO受体是否会出现下调而导致保护作用减弱尚不清楚。本研究观察EPO治疗对心脏EPO受体表达的影响。 5、工作基础与工作条件 工作基础： 本实验室已掌握心肌细胞原代培养、大鼠心肌梗死的模型的建立和细胞移植治疗等方法，为本课题的完成奠定了良好的基础。 工作条件： 本实验室已具备血细胞培养、动物模型制作、免疫细胞和组织化学染色、半定量RT-PCR及实验动物心功能测定等基本技术和条件。实验室相关仪器有外科手术显微镜、电子天平（0.001mg级）、各类CO2孵箱、多谱勒超声仪、各类电泳仪、纯水系统及各种冰箱等。本实验室与浙江大学医学院生理教研室有长期的科研合作，部分工作能在浙江大学完成。 6、预期研究结果及其利用研究结果的计划和今后发展的思路 预期试验结果： （1）明确心脏是否存在内源性的EPO/EPO受体保护系统。 （2）明确心肌缺血损伤时心肌组织表达EPO受体的分布和时间特征，以及EPO治疗对于EPO受体表达的影响，为EPO治疗寻找合适的时间窗。 （3）在国内外专业杂志上发表4~6篇研究论著。 今后发展思路： 在明确EPO/EPO受体对抗心肌缺血再灌注的保护作用基础上，进一步深入探讨EPO引起EPO受体表达改变的具体分子机制，探讨其可能涉及的信号通路。 7、参考文献 [1]Eeftinga F, Rensinga B, Wigman J, al. Role of apoptosis in reperfusion injury. Cardiovascular Research.2004;61(3):414-426 [2]Kitsisa RN, Mann DL. Apotosis and the heart: a decde of progress. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 2005;38(1):1-2 [3]Fisher JW. Erythropoietin: physiology and pharmacology update. Erythropoietin. JAMA. 2005;293:90-95 [4] Maiese K, Li F, Chong ZZ. New Avenues of Exploration for Erythropoietin. JAMA.2005;293-90-95 [5]Maiese K, Li F, Chong ZZ. Erythropoietin in the brain: can the promise to protect be fulfilled? Trends in Pharmacological Sciences. 2004;25(11):577-583 [6]Ehrenreich H , Hasselblatt M,Dembowski C, et al. Erythorpoietin Therapy for Acute Stroke Is Both Safe and Beneficial. Molecular Medicine. 2002;8(8):495-505 [7]Bogoyevitch MA. An update on the cardiac effects of erythropoietin cardioprotction by erythropoietin and the lessons learnt from studies in neuroprotection. Cardiovascular Research. 2004;63(2):208-216 [8]Lipsic E, Meer P, Henning RH. Timing of Erythroietin Treatment for Cardioprotction in Ischemia/Reperfusion. J Cardiovasc Pharmacol.2004;44(4):473-479 [9]Jaquet K, Krause K, Tawakol-Khodai M, et al. Erythropoietin and VEGF Exhibit Equal Angiogenic Potential. Microvascular Research. 2002;64:326-333 [10]Heeschen C, Aicher A, Lehmann Lehmann R, et al Erythropoietin a potent physiologic stimulus for endothelial progenitor cell mobilization. Blood. 2003; 102(4) 1340-1346 [11]Ruia T, Fengb Q, Lei M, et al. Erythropoietin prevents the acute myocardial inflammatory response induced by ischemia/reperfusion via induction of AP-1. Cardiovascular Research. 2005;Article in Press, [12]Lappin T. The Cellular Biology of Erythropoietin Receptors. The Oncologist. 2003;8(Supp1 1)15-18 [13]Wen TC, Rogido M, Genetta T, et al. Permanent focal cerebral ischemia activates erythropoietin receptor in the neonatal rat biain. Neuroscience Letters. 2004; 355(3): 165-168 [14]Spandoua E, Papoutsopouloua S, Soubasib V, et al. Hypoxia-ischemia affects erythropoietin and erythropoietin receptor expression pattern in the neonatal rat. Brain Brain Research. 2004;1021(2):167-172 [15]Meera P, Lipsica E, Henning RH, et al. Erythropoietin improves left ventricular function and coronary flow in an experimental model of ischemia-reperfusion inyjry.European Journal of Heart Failure. 2004;6(7):853-859 新生大鼠心肌细胞原代培养及鉴定 不同条件下培养2h-48h低氧、低糖、IL-6、TNF、EPO等 低氧条件下加入不同浓度rEPO 观察EPO受体表达情况及与细胞凋亡的关系 （RT-PCR、Western Blot、TUNEL检测） 建立大鼠缺血再灌注模型和心梗模型 不同时间点给予rEPO 不同时间点观察缺血组织EPO受体表达分布、表达量及时间特征 心功能、梗死范围、凋亡细胞分布 循环EPO及其他细胞因子浓度等 申请书版本号：50456793