多药耐药相关蛋白2与谷胱甘肽共转运体系对肝脏砷代谢的影响

望丝通 卫生职业病杂志 既 年 月第 从 卷第 期 ‘ , 以拓 , 解 , 。 · 论著 · 多药耐药相关蛋 白 与谷耽甘肤共转运体系 对肝脏砷代谢的影响 高怡 裴秋玲 李国星 韩光 田 凤洁 秦秀军 张蕊 候文胜 李秀云 【摘要 】 目的 用谷胧甘肚 合成酶抑制剂丁硫氨酸亚 甲矾胺 抑制大 鼠 合成 , 探讨多药耐药相关蛋 白 与 共转运体系在肝脏砷代谢过程 中的作用 。 方法 只健康 大鼠随机分为 组 第 组为对照组 , 给予生理盐水 第 一 组为染砷组 , 分别给予 、 和 体重的亚砷酸钠溶液 , 隔天染毒 次 , 周后将动物处死 。 第 组为 干预组 , 在实验结束的 前 , 每天大鼠预先腹腔注射 体重 溶液 , 后再经 口 给予 体重 的亚砷酸钠 溶液 , 其他处理同上 。 原子吸收分光光度法测定胆汁 、肝组织和全血中的总砷含量 。 蛋 白印记法测定 肝细胞膜上 的含量改变 。 结果 和对照组 比较 , 各砷染毒组胆汁 、 肝脏和血砷含量均明显增 高 , 差异有统计学意义 而 个染毒组间血砷差异无统计学意义 尸 。 随着染砷剂 量增加 , 巴 表达有增加 的趋势 , 且 段 表达量与胆汁砷的含量呈正相关 , 尸 。 大鼠经 预处理后再给予 体重的亚砷酸钠溶液 , 胆汁砷含量明显高于对照组 , 而低于高 剂量组 肝脏和血砷水平明显高于对照组和高剂量组 , 差异有统计学意义 表达量 比 高剂量组减少 。 结论 亚砷酸钠可 以诱导 凡 的表达 , 随染砷剂量增加 , 咫 表达量增加 。 凡 在砷及其代谢产物的胆汁排泄过程 中发挥了重要作用 。 巴 转运砷及其代谢产物的作用 与细胞 内 水平相关 , 通过抑制 合成 , 导致 代一 共转运功能减弱 , 砷在肝脏内蓄积增加 。 【关键词 】 多药耐药相关蛋 白 谷胧甘肤 砷代谢 伤 肠 刊陀 一 幼 犯苗 , 尸 了 , 肠 “堵 , , 几月 凡 , 矛少记 , 口才刃 防 伽 ,喇 瓜 写 召 , 八“ 。 婉而 疏吧厂 ,心 户 , 勺侧‘ 自义 , 厅 以 尸 了 沙 加 “ 乳 。 山。 己 。 咫 卯 即 侧北 上 脚 山 脚 习 , 叩 , , 苗 叮 仙 卿 一 铭 即 脚 脚 化 曲 曰 , 印 伴 , 咫 一 铭 吧 , 脚 脚 石 哪 五 祀 娥 脚 巴 , , 叼 币 脚 脚 脚 脚 主 咫 衅既 咒 卜 咫 咒 鸽 沮 , 凡一 明 旋 山 山西 省归 国留学人 员基金资助项 目 作者单位 仪旧 山西 医科大学卫生毒理学教研室 高怡 、裴秋玲 、 田凤洁 、秦秀军 、张蕊 、候文胜 、李秀云 天津市卫生 防病 中心 李国星 通讯作者 裴秋玲 一 四 中华劳动卫生职业病杂志 年 月第 卷第 期 互 目坦丝卫压旦竺 , 幻 , , 目前 , 关于砷 的毒性作用机制 的研究 主要集 中 于砷引起脂质过氧化 、 与蛋 白质相互作用 以及 引起 和 的损伤方面 ’ , 但是关于砷在体 内的代 谢转运方面的报道 尚不多见 。 多药耐药相关蛋 白 一 , 是 肝 细胞膜上一个重要的转运蛋 白 。 我们在前期的研究 中已经发现 在砷及其代谢产物 的胆 汁排 泄 过程 中发挥 了重要作用圈 。 同时有资料显示 , 在生 理条件下 , 存 在一 个依赖 的谷 胧 甘肤 输出体系 , 通过 与 共转运机制将 内源性 有毒物质共 同泵出细胞外 , 并且细胞 内 水平可 调节 对底物的主动外运 。 我们观察 了 含量变化对肝脏砷代谢的影 响 , 测定 了不 同剂量砷 染毒大 鼠肝细胞膜上 表达水平 的变化 , 以探 讨 与 共转运体系在肝脏砷代谢过程中的 作用 。 与方法 主要试剂 和仪器 试 剂 丁硫 氨酸亚 甲矾胺 而 , 购于美国 公司 , 兔 抗大 鼠 咒 抗体 由德 国 教授提 供 , 辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体 北京中山生物 技术有限公司 , 高分子量蛋 白 美 国 生物公司 , 相对分子质量为 、 、 、 、 扩 , 蛋 白酶抑制剂 苯 甲磺酞氟 贝 五 , 、 而 、 白胃素 、抑肤 酶 购于美 国 公 司 , 胃蛋 白酶抑 制素 购于美 国 公 司 , 蛋 白印记 电 泳试剂分别购于美 国的 公司 、 公司和 公司 , 亚砷 酸钠 德 国化工厂 , 测 定试 剂盒 南京建成生物工程研究所 。 仪器 一 型垂直电泳槽 、 一 型转移电泳槽 北京六一 仪器厂 , 一 图象系统 四川川大智能软 件股份有限公司 。 动物分组和处理 将 只 私 大 鼠 雌雄 各半 随机分为 组 , 每组 只 , 经 口 染毒 , 灌 胃体积 为 血八 体重 。 第 组 为对照组 , 给予生 理盐 水 第 一 组为染毒组 , 参照预实验分别给予 、 和 的亚 砷 酸钠 溶 液 , 浓度 分别 为 、 和 耐 , 隔天染毒 次 , 周后将动物处死 。 第 组为 干预组 , 在实验结束的前 , 每天大 鼠 预先腹腔注射 , 后再经 口 给予 的亚砷酸钠溶 液 , 其 他处 理 同上 。 处 理 大 鼠 时首先使用 质量 分数 为 的乌拉坦 而八 。 腹腔注射麻醉 , 麻醉后打开腹腔 , 经胆总管插管 , 取胆汁 , 一 ℃保存备用 。 腹 主动脉采血 , 取 耐 全血 加入肝素抗凝 , ℃保存备用 。 随后处死 大 鼠并迅速分离肝脏 , 用生理盐水快速 冲洗标本 , 去 除血污 。 肝组织去 除包膜及肝 门处 的结缔组织 , 保 存于 一 ℃ , 作为 的测定标本 。 蛋 白印记试验 称取 一 ℃保存的肝脏组织 约 , 加 耐 含有蛋 白酶 抑制 剂 苯 甲磺酞氟 , , 、 胖 、 白胃素 拜 、 抑肤酶 滩 耐 、 胃蛋 白酶抑制素 此 耐 的 一蔗糖缓 冲液 「蔗糖 、 · 、 、 一 ℃ 。 」〔‘ 〕剪碎后手工匀浆 , 上下 次 , 至均匀无 固体物质及 悬 浮物 。 ℃保 存匀浆 液 。 用 法囚 测 定 样 品 中蛋 白含 量 后 , 调 节 蛋 白浓 度 至 而 , 并与样品缓 冲液混合 , 保证 每个加样孔的上 样量均为 此 , 同时加人高分子量 , 在质量 分数为 的分离胶上开始电泳 。 电泳结束后将其 电转至 硝 酸纤 维 素膜 上 , 分别 用封闭液按照 的浓度稀 释一抗 〔兔抗 大 鼠 多克隆抗体血清 , 抗大 鼠 甲 」用 含质量 分数为 去脂奶粉的 以 浓度稀释二抗 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔的多克隆抗体 。。 待 膜与一抗和二抗作用后用 显色液进行显色 , 用 扫描仪扫描 , 用 一 图像分析系统进行 分析 。 测定采用二硫双硝基苯甲酸 法 。 胆汁砷 、 肝砷和全血总砷 含量用原子吸收分 光光度法进行检测 。 统计方法 各组数据用 软件进行 分析 。 砷含量的比较采用方差分析检验和方差分析 的两两 比较 , 并对肝细胞膜 表达 水平 和胆汁 砷含量进行相关性分析 。 结 果 结 果 与高分 子量 比较 , 染色条带大致在 丁 处 。 本次实验用积 分光密度作为指标 , 对 电泳条带进行定量分析 。 结 果显示 , 与对照组相 比 , 各实验组的 表达条带 的积分 光 密 度 度 增 加 差 异 均 有 统 计 学 意义 尸 , 且随着染砷剂量的增加 , 表达量有增加 的趋势 , 组 比高剂量组 表达减少 , 见表 。 肝脏 含量 的测定结果 与对照组 比较 , 高剂量组 和 干 预 组肝 含量 明显 降低 且 干预组肝 含量明显低于高剂量组 , 见表 么 生些劳动卫生职业病杂志 以巧 年 月第 抖 卷第 期 司 , , 仪巧 , 胆汁砷 、肝砷和血砷 的测定结果 和对照组 比较 , 不同剂量砷染毒组胆汁砷 、肝砷和血砷含量均 增高 , 差异有统计学意义 随着染砷剂量 的增加 , 胆汁砷和肝脏 中砷含量逐渐增加 , 经方差检 验差异均有统计学意义 尸 , 而血砷 个染 毒组间差异无统计学意义 。 干预组胆汁砷含量 明显高于对照组 , 而低于高剂量组 干预组肝脏 砷和血砷含量明显高于对照组和高剂量组 , 见表 。 表 各剂量组大鼠肝组织 凡 表达 定量分析结果 无 士 组别 动物数 对照组 低剂量组 中剂量组 高剂量组 干预组 积分光密度 士 土 土 ’ 士 ’ 士 翻 与对照组 比较 , ’ , 口 与高剂量组 比较 , 尸 表 大鼠肝脏 含量的测定结果 无 士 组别 动物数 肝 创 对照组 高剂量组 干预组 士 土 份 土 与对照组 比较 , ‘ 尸 与高剂量组 比较 , 舒 表 各剂量组大鼠胆汁砷 、肝砷和 血砷的测定结果 无 土 , 二 组别 动物 数 胆汁砷 阔耐 肝砷 拜 血砷 拜 司 对照组 低剂量组 中剂量组 高剂量组 干预组 叨 士 土 有 土 士 赞 土 土 乃 土 ‘ 普 士 件 土 伪 苍 汉 土 乃 臼 士 士 卯 士 土 上 合成 , 观察 含量 变化 对肝脏 砷代谢 的影 响 , 与对照组相 比 , 各染毒组的 咫 表达条带的吸 光度均有明显增加 , 差异有统计学意义 尸 , 且随着染砷剂量 的增加 , 表 达量有增加 的趋 势 , 提示砷可诱导 咫 表达增加 , 并且 凡 表达 量随着染砷剂量的增加而增加 。 实验结果还显示 , 随着染砷剂量的增加 , 胆汁砷 和肝脏 中砷含量逐渐增加 , 对 几 和胆 汁砷含量 做相 关 性 分 析 , 发 现 两 者 存 在 正 相 关 关 系 二 , 尸 。 说 明存在于毛细胆管膜 的 可能将肝细胞 内的砷外排人胆汁 中 。 用 抑制 大鼠 合成后 , 胆 汁砷排泄 明显减少 , 仅为高剂 量组 的 肝脏砷 蓄积增 加 , 为高剂量组 的 倍 。 表明细胞 内 浓度下降后 , 外排功 能 随之减弱 , 与 咫 可能在细胞 内共 同组成 了 一条解毒途径 , 介导砷 剂 的外排 。 有报道 , 用 处理 。 转染的肺癌细胞 , 在 耗竭的同 时 , 该细胞对阿霉素 、柔红霉素 、 长春新碱和 一 的耐药性也被完全逆转 。 另外在 白血病治疗研究 中发 现 , 可 以 逆 转 耐 药 细 胞 株 对 气 。, 的交叉耐药性 , 这些体外试验研究结果均 支持本研究的结论 , 表 明砷在体 内的代谢转运是 由 咒一 这 个共转 运 体 系完成 的 。 进 一 步研 究 一 共转运体系在哺乳类动物细胞 中对砷的 脱毒作用 以及 参与体 内代谢毒物转运 的分子 机制 , 将对砷 中毒的防治研究具有重要的意义 。 参 考 文 献 与对照组 比较 , ‘ , “ 尸 与高剂量组 比较 , 翻 尸 胆汁砷含量与 验 , 两者呈正相关 表达水平做相关性 检 , 。 讨 论 是 结合 的盒式膜 转运 蛋 白家族 成 员 , 可 通 过 水解 供能逆浓 度梯 度转运相应底 物 , 它广泛存在于肝 、 ’肾等有分泌功能的细胞膜上 , 可将有毒物质及时排人尿 、 胆汁和粪便 中而对机体 起到保护作用 。 是一种 一谷氨酞半胧氨酸合成 酶的潜在抑制剂 , 可抑制 合成 , 增加 的消 耗 , 使细胞内 浓度下降 , 从而使 外排功能 减弱 。 我们利用亚砷酸钠对大鼠染毒 , 检测 在此过程 中的表达 水平 。 同时 , 用 抑 制 大 鼠 毗 罗 朋 记 , 耐 司 田仪 , 尹 己刃 ,叮 曰 , , 二 一 李 国星 , 裴秋玲 , 高怡 砷对大鼠肝脏多药耐药相关蛋 白 影响 的研究 中华劳动卫生职业病杂志 , 以又 , 一 肠 , 田 , 五 】坦 , 七 , , 场 , , 一 , 二 , 阮 , 马 即 甲 。一 咧 明 , , 一 奥斯伯 , 主编 精编分子生 物学实验指南 北京 科学技术出 版社 , 一 叩 , 肠 , 曰丑 , 己 一 日即 一 记川 , , 一 , , 朋 】 出 厂 , 即 而 , 的 一 卜 收稿 日期 加 一肠一 本文编辑 杨德一