GBT 27982-2011 小反刍兽疫诊断技术

ICS”．220 B41 瘩雪 中华人民共和国国家 GB／T27982—201 1 小反刍兽疫诊断技术 Diagnostictechniquesforpestedespetitsruminants 2011-12-30发布 2012—06-01实施 宰瞀嬲鬻瓣訾糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会仅1” 刖胃GB／T27982--2011本标准按照GB／T1．12009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(sAC／Tc181)归口。本标准起草单位：农业部热带亚热带动物病毒学重点实验室、中国动物卫生与流行病学中心、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：包静月、吴晓东、王志亮、李林、刘春菊、王清华、赵文姬、邹艳丽、郑东霞、徐天刚、李金明、姚李四、张乐、林祥梅、吴绍强、韩雪清。 ????? www.bzfxw.com ???? 1范围小反刍兽疫诊断技术本标准规定了小反刍兽疫的临床诊断和实验室诊断的技术要求。本标准适用于小反刍兽疫的诊断。2规范性引用文件GB／T27982--2011下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB／T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489--2008实验室生物安全通用要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3．1荧光定量反转录一聚合酶链式反应realtimequantitativereversetranscriptionpolimerasechainre-action荧光定量RT-PCR反应在RT—PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个RT—PCR进程，最后通过标准曲线对未知进行定量分析的方法。3．2荧光域值threshold荧光定量RT-PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3个～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。3．3Ct值Ctvalue每个反应管内的荧光信号到达设定的荧光域值时所经历的循环数。4生物安全措施进行小反刍兽疫实验室检测时，如病毒分离、血清处理等，按照GB19489--2008。5临床诊断5．1临床症状5．1．1突然发热，第2天～第3天体温达40℃～42℃高峰。发热持续3d左右，病羊死亡多集中在发热后期。1 ????? www.bzfxw.com ???? GB／T27982--20115．1．2眼、鼻大量排出分泌物，最初水样的眼、鼻分泌物日益增多，变成脓性然后结干，动物发出恶臭。由于鼻孔被凸起的结干的鳞屑覆盖，动物打喷嚏和咳嗽。呼吸急促，呼吸困难，排痰性咳嗽和眼睛的卡他性分泌物。5．1．3口腔粘膜充血，El腔上皮和鼻腔粘膜出现大量部分粘连的极微小的略灰色坏死点，坏死组织脱落后形成界线分明的浅糜烂斑。上皮破损偏好部位为嘴唇、齿龈、牙板、舌头以及母羊阴户的阴唇面。口腔破损可能伴有大量流涎。5．1．4发热2d～3d后病畜开始腹泻，伴随严重脱水、消瘦、虚脱。怀孕母羊可发生流产。5．1．5特急性病例在发热开始的4d～6d内死亡。亚临床型病例症状较轻，病畜在生病10d～14d以后康复。5．2病理变化5．2．1嘴唇充血，1：3腔破损程度不等，较轻的只有一处溃疡，严重的出现广泛的溃疡性及坏死性口腔炎，涉及牙板、硬腭、颊粘膜和乳突和舌头喙部背面。粘膜病变可延伸至咽部，偶尔在网胃和瘤胃交界处。5．2．2上呼吸道粘膜可能严重充血，伴有鼻孔和气管的溃疡。支气管肺炎，肺尖肺炎。5．2．3皱胃粘膜出现严重的充血和溃烂。偶尔，整个肠道出现弥散性的充血，但是，多数情况仅局限于十二指肠、回肠、盲肠和结肠上部分。常见回盲肠瓣膜出血。大肠纵向折叠顶部偶尔出现严重的出血形成斑马样条纹。5．2．4肠淋巴组织坏死、萎陷。肠系膜淋巴组织轻微肿大、水肿，脾可能肿胀。上呼吸道粘膜可能严重充血，伴有鼻孔和气管的溃疡。支气管肺炎，肺尖肺炎。肺部淋巴结肿胀并水肿。5．2．5结膜出现脓性结膜炎。肾和膀胱可见充血。母羊可见阴户和阴道糜烂。5．2．6组织学上可见肺部组织出现多核巨细胞以及细胞内嗜酸性包含体。5．3结果判定山羊或绵羊出现上述临床症状和病理变化，羊群发病率、病死率较高，传播迅速，可判定为疑似小反刍兽疫。6实验室诊断6．1样品采集与运输6．1．1样品的采集6．1．1．1每个发病羊群最少选择5只病畜采集样品。6．1．1．2选择处于发热期(体温40℃～41℃)、排出水样眼分泌物、出现口腔溃疡、无腹泻症状的活畜采集样品。采集结膜棉拭子2个、鼻粘膜棉拭子2个、颊部粘膜棉拭子1个，分别放在300pL灭菌的0．01mol／LpH7．4磷酸盐缓冲液(PBS)中。无菌采集血液10mL，用常规方法分离血清。6．1．1．3选择刚被扑杀或者死亡时间不超过24h的病畜采集组织样品。无菌采集肠系膜和支气管淋巴结各3个～4个，脾、胸腺、肠粘膜和肺等组织各约25g～50g，分别置于50mL离心管中。6．1．1．4肉制品取25g～50g，置于50mL离心管中。6．1．2样品的运输与储存6．1．2．1样品采集后，置冰上冷藏送至实验室检测。6．1．2．2血清储存应置于--20℃冰箱。2 ????? www.bzfxw.com ???? GS／T27982--20116．1．2．3棉拭子、病料组织和肉制品储存应置于一70℃冰箱。6．2器械与设备5％二氧化碳培养箱，DNA热循环仪，低温高速离心机，电泳仪和电泳槽，凝胶成像系统或者紫外检测仪，实时荧光定量PCR仪，96孔高吸附性酶标板，洗瓶或者洗板机，恒温箱，酶标仪。6．3病毒分离与鉴定6．3．1试验材料非洲绿猴肾(Vero)细胞，pH7．4磷酸盐缓冲液(PBS)(见A．1)，细胞培养液(见A．3)，细胞培养瓶。6．3．2样品处理棉拭子充分捻动、挤千后弃去拭子，加入青霉素至终浓度200Iu／mL，加入链霉素至终浓度200pg／mL。37℃作用1h。3000g离心10rain，取上清液300pL作为接种材料。用灭菌的剪刀、镊子取大约0．5g组织样品或肉制品，置于研钵中，剪碎，充分研磨，加入5mL灭菌的0．01mol／LpH7．4磷酸盐缓冲液(含青霉素200IU／mL，链霉素200pg／mL)，制成1：10悬液。37℃作用1h。3000g离心10rain，取上清液5mL作为接种材料。不能立即接种者，应将上清放一70℃保存。6．3．3样品接种取样品上清液接种已长成单层的Vero细胞，37℃恒温箱中吸附2h，加入细胞培养液，置5N二氧化碳培养箱37℃培养。6．3．4观察结果接种后5d内，细胞应出现细胞病变效应，表现为细胞融合，形成多核体。如接种5d～6d后不出现细胞病变，应将细胞培养物盲传三代。6．3．5病毒的鉴定将出现细胞病变的细胞培养物，按“6．4RT-PCR方法”和“6．5荧光定量RT-PCR反应”做进一步鉴定。6．3．6结果判定样品出现细胞病变，而且RT-PCR方法或实时荧光RT-PCR方法鉴定结果阳性，则判为小反刍兽疫病毒分离阳性，表述为检出小反刍兽疫病毒。否则，表述为未检出小反刍兽疫病毒。6．4RT-PCR方法6．4．1试剂与材料除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB／T6682的要求。TRlzol试剂，三氯甲烷，异丙醇，无水乙醇，DEPC处理过的水(见附录B)，反转录酶／TaqDNA聚合酶混合液，2×一步法RT-PCR反应缓冲液，1．5％的琼脂糖凝胶(见附录B)，0．5×TBE缓冲液(见附录B)，溴化乙锭。3 ????? www.bzfxw.com ???? GB／T27982--2011可以采用引物NP3／NP4用于小反刍兽疫病毒核酸的检测，引物的靶基因、位置、序列和扩增产物的大小见表1。表1用于小反刍兽疫病毒RT-PCR检测的引物引物目的靶基因序列(57—37)产物NP3正向引物N基因TCTCGGAAATCGCCTCACAGACTG351bpNP4反向引物N基因CCTCCTCCTGGTCl：TCCAGAATCT6．4．2样品处理将棉拭子充分捻动、挤干后弃去拭子，取100pL样品液至一新的离心管中，加入1mLTRIzol试剂，振荡混匀，进行RNA提取。取大约100mg组织样品，剪碎后，加入1mLTRIzol试剂充分匀浆后转移至1．5mL离心管中，进行RNA提取。6．4．3RNA提取经TRIzol处理的样品液12000r／rain，4℃离心10rain，取上清，静置5rain。加200pL三氯甲烷，振荡混匀，15s，静置2min～3rain。12000r／rain，4℃离心15rain，取400pL上层水相到新的离心管中，加400pL的异丙醇，混匀，静置10rain。12000r／rain，4℃离心10rain，去上清。加入75％乙醇1mL，混匀，12000r／rain，4℃离心5rain，去上清。再加入75％乙醇lmL，混匀，12000r／min，4℃离心5rain，去上清。干燥RNA沉淀后加入100pLDEPC处理过的水溶解。立即进行RT．PcR反应或一70℃保存。6．4．4RT-PCR反应反应体系为25pL，依次加入以下成分：12．5pL2×一步法RT-PCR反应缓冲液，ipL正向引物NP3(10／tmol／L)，1pL反向引物NP4(10pmol／L)，1pL反转录酶／TaqDNA聚合酶混合液，4．5pLDEPC处理过的水，5pLRNA模板。每次进行RT-PCR反应时均设标准阳性、阴性及空白对照。标准阳性用阳性对照RNA作为模板，标准阴性用Veto细胞RNA作为模板，空白对照用DEPC处理过的水作为模板。RT-PCR反应条件为：50℃反转录30rain；94℃，2rain进行Taq酶的激活；94℃，30s，55℃，30s，72℃，30s，共35次循环；72℃延伸7rain。6．4．5PCR产物的电泳取PCR产物5pL在1．5％琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像系统中观察结果。6．4．6质控标准小反刍兽疫病毒RT-PCR标准阳性对照有大小为351bp的特异性阳性扩增条带，标准阴性对照和空白对照无任何扩增条带，说明质控合格。6．4．7结果判定样品有大小为351bp的特异性阳性扩增条带判为RT-PCR结果阳性，表述为检出小反刍兽疫病毒核酸。4 ????? www.bzfxw.com ???? GB／T27982--2011样品无特异性的阳性扩增条带判为RT-PcR结果阴性，表述为未检出小反刍兽疫病毒。6．5荧光定量RT-PCR反应6．5．1试验材料TRIzol试剂，三氯甲烷，异丙醇，无水乙醇，DEPC处理过的水(见附录B)、2×一步法荧光RT-PCR反应缓冲液，TaqDNA聚合酶，反转录酶，参比荧光ROXⅡ。引物和探针：引物和探针针对小反刍兽疫病毒N基因保守序列区段，引物和探针的位置和序列见表2。表2用于小反刍兽疫病毒实时荧光定量RT-PCR检测的引物和探针引物目的位置序列(5’一37)PPRN8a正向引物1213—1233CACAGCAGAGGAAGCCAAACTPPRN9b反向引物13271307TGTTTTGTGCTGGAGGAAGGAPPRNlOP探针1237—1258FAM一5’一CTCGGAAATCGCCTCGCAGGCT一3’一TAMPA6．5．2RNA提取同6．4．3。6．5．3荧光定量RT-PCR反应反应体系为25儿，依次加入以下成分：12．5FL2×1stepbuffer，1FL正向引物PPRN8a(10／_￡mol／L)，1pL反向引物PPRN9b(10Fmol／L)，0．5pL探针PPRNlop(10／zmol／L)，0．5PLTaqDNA聚合酶，0．5pL反转录酶，0．5pL参比荧光ROXII，3．5FLDEPC处理过的水，5pLRNA模板。每次进行荧光定量RT-PCR时均设标准阳性、阴性及空白对照。标准阳性用阳性对照RNA作为模板，标准阴性用Veto细胞RNA作为模板，空白对照用DEPC处理过的水作为模板。荧光定量RT-PCR反应条件为：42℃反转录30rain；95℃，10rain进行Taq酶的激活；95℃，15s，60℃，1rain，共50次循环；每个循环在60℃，1rain时收集荧光信号。6．5．4质控标准读取每个样品的ct值。标准阳性对照样品有特异性扩增曲线而且ct值≤30，标准阴性对照和空白对照无特异性扩增曲线，说明质控合格。6．5．5结果判定样品有特异性扩增曲线而且ct值≤40判为实时荧光RT-PCR扩增阳性，表述为检出小反刍兽疫病毒核酸。样品ct值>40或者无特异性扩增曲线判为实时荧光RT-PCR扩增阴性，表述为未检出小反刍兽疫病毒核酸。6．6竞争ELISA方法6．6．1试验材料包被用抗原：PPRV疫苗株重组N蛋白。对照血清：强阳性血清、弱阳性血清、阴性血清。单克隆5 ????? www.bzfxw.com ???? GB／T27982--2011抗体：小反刍兽疫病毒N蛋白的单克隆抗体。酶结合物：辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠血清。封闭缓冲液、洗涤缓冲液、底物溶液及终止液，配制方法见附录c。6．6．2抗原包被PPRV重组N蛋白用包被缓冲液1：3500倍稀释后，每孔50pL包被96孔酶标板，37℃置湿盒吸附1h，用洗涤缓冲液洗板4次。6．6．3血清加样步骤每孔加入45pL封闭缓冲液。每份待检血清做2孔，每孔加入5pL待检血清。设强阳性血清对照孔(c++)4个，每孔加人5pL强阳性血清，设弱阳性血清对照孔(c+)4个，每孔加入5pL弱阳性血清，设阴性血清对照孔(c一)2个，每孔加入5pL阴性血清，设单抗对照孔(Cm)4个，每孔加入5pL封闭缓冲液，设酶结合物对照孔(cc)2个，每孔加入55pL封闭缓冲液。6．6．4单克隆抗体的加入除酶结合物对照孔外，每孔加入50pL工作浓度的单抗，37℃置湿盒作用1h，用洗涤缓冲液洗板4次。6．6．5酶结合物的加入每孔加入50pL工作浓度的酶结合物，37℃置湿盒作用1h，洗涤缓冲液洗板4次。6．6．6显色与终止每孔加入50“L底物溶液，37℃避光反应10rain，每孔加入50pL终止液。6．6．7读值酶标仪预热15rain，读取每孔492nm波长的吸光度值(OD值)。6．6．8计算抑制率按照式(1)计算每孔(包括对照孔)的抑制率，并计算每份样品的平均抑制率。PI一100一(ODT÷ODc)×100⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(1)式中：PI——抑制率；ODt——试验孔或对照孔OD值；ODc——单抗对照孔OD平均值。6．6．9质控标准结果在质控标准(见表3)范围内，则试验成立。表3小反刍兽疫竟争ELISA检测方法质控标准项目最大值最小值Cm孔的OD值1．5000．500cc孔抑制率+105+95Cm孔抑制率+20—19 ????? www.bzfxw.com ???? 表3(续)GB／T27982--2011项目最大值最小值c++孔抑制率9081C+孔抑制率805lC一孔抑制率3056．6．10结果判定平均抑制率(PI)>80，判为强阳性，50<平均抑制率(PI)≤80，判为弱阳性，表述为小反刍兽疫血清学阳性。平均抑制率(PI)≤50，判为阴性，表述为小反刍兽疫抗体血清学阴性。7综合判定凡具有6．3．6、6．4．7、6．5．5、6．6．10中任何一项阳性者，均判为小反刍兽疫阳性。 ????? www.bzfxw.com ???? GB／T27982--2011A．1pH7．4磷酸盐缓冲液(PBS)附录A(规范性附录)病毒分离鉴定溶液的配制NaCl8．00gKCl0．20gNa2HP04·2H201．44gKH2POt0．24g用HCI调节溶液的pH值至7．4，加去离子水至1000mL，在1．034×105Pa高压下蒸汽灭菌20rain。保存于室温。PBS一经使用，于4℃保存不超过3周。A．2高糖型DMEM培养液高糖型DMEM13．37g碳酸氢钠(NaHC03)3．7g超纯水1000mL充分溶解后，0．22pm微孔滤膜过虑除菌。4℃保存。A．3细胞培养液高糖型DMEM培养液950mL胎牛血清50mL加入青霉素至终浓度200IU／mL，链霉素至终浓度200tlg／mL，两性霉素B至终浓度2．5vg／mL充分混匀。4℃保存。 ????? www.bzfxw.com ???? B．1 DEPC处理过的水 附录B (规范性附录) 反转录一聚合酶链反应溶液的配制 DEPC lmL 去离子水 1000mL 充分混匀，将瓶盖拧松后置于37℃放置过夜，高压灭菌。 B．2 5×TBE缓冲液 Tris碱 54g 硼酸 27．5g 0．5mol／LEDTA 20mL 加去离子水调整体积至1000mL。 B．3 0．5×TBE缓冲液 取100mL5XTBE缓冲液，加去离子水调整体积至1000mL。 B．4 1．5％的琼脂糖凝胶 GB／T27982--2011 琼脂糖0．75g 0．5XTBE缓冲液 50mL 溴化乙锭溶液(10mg／mL) 2．5pL 称取0．75g琼脂糖，置于200mL锥形瓶中，加入50mL0．5XTBE缓冲液，加热溶解，冷却至 50℃～60℃时加入2．5pL溴化乙锭溶液，倒入胶槽内自然凝固。 GS／T27982--2011 附录C (规范性附录) 竞争酶联免疫吸附试验溶液的配制 C．1 包被缓冲液--0．05mol／LpH9．6碳酸盐／重碳酸盐缓冲液 NazC03 NaHC03 去离子水 用0．22“m膜过滤除菌，室温保存备用。 0．318g 0．588g 200mL C．2洗涤缓冲液——pH7．4PBST(0．05％吐温一20) 吐温一20 PH7．4PBS 0．5mL 1000mL C．3封闭缓冲液(含3％BSA的pH7．4PBS) BSA pH7．4PBS 封闭液要临用前配制。 C．4底物溶液 C．4．1A液 30g 1000mL Ha2HP04 3．682g 柠檬酸 1．021g 过氧化氢尿素0．06g 去离子水 100mE． 临用前配制，避光4℃～8℃保存。 C．4．2B液 柠檬酸 1．05g EDTA 14．6mg TMB(3，3’一二氨基联苯胺) 25．0mg 去离子水 100mL 用0．45pm滤膜过滤，i临用前配制，避光4℃保存。 C．4．3用法 使用时，将A液、B液按1：1的比例混合。 】0 C．5终止液——3mol／LH2SO, 浓硫酸 16．5mL 去离子水87．5mL 将浓硫酸缓缓加到蒸馏水中，混匀。 GB／T27982--201 1