米曲霉与酱油曲霉高酶活菌株的诱变选育

2009 No．11 Serial No．212 China Brewing 米曲霉（Aspergillus oryzae）和酱油曲霉（A. sojae）是酱 油酿造中常用的菌株，在酱油生产过程中，米曲霉和酱油 曲霉所分泌的蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等把原料中的蛋 白质、淀粉、纤维素分别水解产生氨基酸、葡萄糖等物质， 因此，酱油酿造用菌株的酶系分布对酱油生产的原料利用 率和酱油的风味起着决定性的作用[1]。然而，由于长期的 移种和保藏，菌种会出现退化，导致曲霉酶活性和代谢能 力降低，严重影响了酱油的产量和品质。因此，菌种的选 育显得非常必要[2]。 在实际生产中，普遍采用物理或化学诱变的方法对酱 油酿造用菌株进行选育[3]。本实验采用紫外诱变、亚硝基 胍诱变、紫外－亚硝基胍复合诱变3种方法分别对米曲霉 和酱油曲霉进行诱发突变，通过酪蛋白透明圈法以及福林 酚法和DNS法筛选育高酶活菌株，并进一步探讨了初筛 方法的可行性和不同诱变方法对菌株改良的效果，为酱 油酿造用菌株的改良积累资料及为进一步的工业化应用 奠定基础。 1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 菌株 米曲霉（A. oryzae 2339）和酱油曲霉（A. sojae 40255） 由中山大学刘建忠教授惠赠。 1.1.2 培养基 种曲培养基：原料配比为豆粕∶麸皮＝8∶2，拌水量为全 料的110%。具体操作：将豆粕称好放入盆中，加定量的温 开水（80℃~90℃），用麸皮覆盖于上，保持30min，拌匀后每 个150mL三角瓶中按10g左右分装，121℃高温灭菌备用。 酪蛋白培养基：称取酪蛋白4.0g，KH2PO40.36g，MgSO4· 7H2O 0.5g，ZnCl2 0.014g，Na2HPO4·7H2O 1.07g，NaCl 0.16g， CaCl2 0.002g，Tryptone 0.05g，琼脂20g，加蒸馏水至1000mL。 充分混匀后，121℃高温灭菌备用。 1.1.3 主要试剂 酪氨酸（北京鼎国），酪蛋白（广州威佳），Tryptone （OXOID），福林酚试剂（北京奇华盛），N-甲基-N'-硝基-N- 亚硝基胍（NTG）（SIGMA），酒石酸钾钠、三氯乙酸（天津 福晨），羧甲基纤维素钠（天津光复）。 1.2 实验方法 1.2.1 种曲制备方法 装有10g种曲培养基的150mL三角瓶，121℃高温灭菌 20min，冷却后，接入2环菌种孢子。30℃培养18h后摇瓶一 次，再培养6 h后摇瓶一次，继续培养至菌丝充分生长，形 成结饼状之后（培养约48 h后）扣转（使底部曲料充分接触 空气），成曲，全程约需3d。 1.2.2 酶液的制备 米曲霉与酱油曲霉高酶活菌株的诱变选育 林剑青，陈晓莹，贺竹梅* （中山大学基因教育部重点实验室水产品安全教育部重点实验室，广东 广州 510275） 摘 要：酱油酿造过程中菌株所分泌的酶系直接影响原料的利用率和最终产品的品质。实验通过紫外诱变、亚硝基胍诱变以及紫外- 亚硝基胍复合诱变方法分别对米曲霉和酱油曲霉菌株进行了诱变，采用酪蛋白透明圈法初筛以及福林酚法和DNS法复筛，根据碱性 蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、纤维素酶和α-淀粉酶酶活水平的变化，选育出数株米曲霉和酱油曲霉高酶活菌株。并对初筛方法 的可行性和不同诱变方法对菌株改良的效果进行了探讨。 关 键 词：米曲霉；酶系分布；诱变筛选；高酶活 中图分类号：Q93-331 文献标识码：A 文章编号：0254-5071（2009）11-0024-04 Screening of Aspergillus oryzae and A. sojae strains with high enzyme activity by induced mutation LIN Jianqing, CHEN Xiaoying, HE Zhumei* (Key Laboratory of Gene Engineering of Ministry of Education, MOE Key Laboratory of Aquatic Product Safety, Sun Yat-sen University; Guangzhou 510275, China) Abstract: Utilization of raw materials and quality of soysauce was directly affected by enzymes produced by fungal strains used. Strains Aspergillus oryzae and A. sojae were induced mutation by UV, NTG, or combination of UV and NTG. Mutant strains with high activity of enzymes, including alkaline protease, neutral protease, acid protease, cellulase and α-amylase, were selected by lucency circle of casein plate, followed with Foline-phenol and DNS method. Feasibility of screening methods and efficiency of mutant strains were also evaluated. Key words: Aspergillus oryzae; enzyme distribution; mutation screening; high enzyme activity 收稿日期：2009-06-18 基金项目：广东省科技项目（2008A010900001）；国家人才培养基金（基地）项目（J0730638） 作者简介：林剑青（1986-），男，在读硕士研究生；贺竹梅*，教授，通讯作者，研究方向为微生物遗传学与植物生物技术。 Research Report24· · 中 国 酿 造 2009年 第 11期 总第 212期 称取2 g种曲，充分研磨后，加入100mL蒸馏水，40℃水 浴中浸提1h，每隔约15min用玻璃棒搅拌1次，然后抽滤去 掉固体残渣，即得酶液。 1.2.3诱变方法[4] 紫外诱变：在直径为9cm的无菌培养皿中加入2mL104 cfu/mL的孢子悬浮液，在距15W紫外灯30cm处照射5min， 将诱变之后的曲霉孢子悬液涂布于酪蛋白固体培养基上， 每个平板涂布200μL。 亚硝基胍诱变：在2 mL离心管中加入500μL1.0 mg/mL NTG溶液和500μL 2×105 cfu/mL的孢子悬浮液，30℃、200 r/min振荡30min，用生理盐水稀释100倍以终止反应，将诱 变之后的曲霉孢子悬液涂布于酪蛋白固体培养基上，每 个平板涂布200μL。 复合诱变：在2mL离心管中加入500μL 1.0mg/mL NTG溶液和500μL 2×105cfu/mL的孢子悬浮液，30℃、200 r/min振荡30min，用生理盐水稀释100倍以终止反应；取化 学诱变后的曲霉孢子 悬液10mL于直径为9cm的无菌培 养皿中，在距15 W紫外灯30cm处照射5min，将诱变后的 曲霉孢子悬液涂布于酪蛋白固体培养基上，每个平板涂布 200μL。 1.2.4 筛选方法 初筛方法：采用酪蛋白透明圈法[5]进行初筛。将诱变 后孢子悬液涂布于酪蛋白平板，48h后测量透明圈直径D 和菌落直径D0，挑选K值（D/D0）最大的10株进行复筛。 复筛方法：碱性蛋白酶的测定采用福林酚试剂法[6]。 40℃，pH10.0，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸为1个酶 活单位（U）。 中性蛋白酶的测定采用福林酚试剂法[7]。40℃，pH7.0， 每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸为1个酶活单位（U）。 酸性蛋白酶的测定采用福林酚试剂法[8]。40℃，pH3.0， 每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸为1个酶活单位（U）。 纤维素酶的测定采用DNS试剂法[9]。50℃，pH4.8，每分钟 水解羧甲基纤维素生成1μg葡萄糖为1个酶活单位（U）。 α-淀粉酶的测定采用DNS试剂法[10]。50℃，pH4.8，每 分钟水解淀粉生成1μg葡萄糖为1个酶活单位（U）。 2 结果与 2.1 米曲霉和酱油曲霉出发株的酶系分布 米曲霉和酱油曲霉出发菌株A. oryzae 2339和A. sojae 40255的酶系分布见表1。从表1可以看出，米曲霉所分泌产 生的碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、纤维素酶的活 性均分别大于酱油曲霉对应的酶活性；而α-淀粉酶则是米 曲霉比酱油曲霉低。在2种曲霉的3种蛋白酶中，中性蛋白 酶活性略低于碱性蛋白酶活性，而远高于酸性蛋白酶活性。 2.2 米曲霉高酶活菌株的诱变筛选 2.2.1 米曲霉的紫外诱变筛选结果 米曲霉孢子在距15W紫外灯30cm处照射5 min，其致 死率为99.44%。由表2可以看出，K值最大的10株突变株 （编号为OU1~OU10）的各种酶的酶活性均有不同程度的改 变（升高或降低），其中仅有菌株OU3的大部分酶活性提高， 且其中性蛋白酶、纤维素酶、α-淀粉酶活性有较大幅度提 高，但碱性蛋白酶活性最高也仅提高13%（OU3），而酸性 蛋白酶活性则大部分有所下降。总体上看，紫外线对米曲 霉的诱变效果并不理想。 2.2.2 米曲霉的亚硝基胍诱变筛选结果 米曲霉经终浓度0.5mg/mL NTG处理孢子悬浮液30 min后，致死率为95.05%。由表3可以看出，初筛K值最大得 到的10株突变株（编号为ON1~ON10）的中性蛋白酶和纤 维素酶活性均有不同程度的提高，其中ON5的中性蛋白酶 活性比原始株提高了54%，ON7的纤维素酶活性比原始株 提高了60%。综合考虑各种酶活性以及其在酱油发酵过程 的重要性，ON3和ON5的诱变效果较好，但这2株菌株的酸 性蛋白酶活性降低较多。 2.2.3 米曲霉的复合诱变筛选结果 米曲霉经亚硝基胍和紫外线复合诱变，致死率为96.8%。 由表4可以看出，在最大初筛K值的10株突变株中（编号为 ONU1~ONU10），碱性蛋白酶、中性蛋白酶、纤维素酶、α- 淀粉酶活性均获得提高的有8株（ONU1、ONU3~ONU8、 ONU10）。综合考虑，ONU3和ONU7的诱变效果最好，其各 种酶的活性均有较大程度的提高。 表1 米曲霉和酱油曲霉出发菌株的酶系分布 Table 1. Enzyme distribution of A. oryzae and A. sojae 菌株 碱性蛋白酶 中性蛋白酶 酸性蛋白酶 纤维素酶 α-淀粉酶 米曲霉 1842 1728 214.3 2389 2354 酱油曲霉 790.3 668.3 97.7 1809 3008 U/g 表2 紫外诱变后K值最大的10株米曲霉酶活测定结果 Table 2. Enzyme activity of the top 10 A. oryzae strains with largest K values after UV mutation 注：复筛结果显示的是诱变株相对于原始株的比酶活相对比值，（下同）。 项目 原始 株 OU1 OU2 OU3 OU4 OU5 OU6 OU7 OU8 OU9 OU10 初筛K值 1.27 1.53 1.4 1.53 1.4 1.43 1.43 1.43 1.47 1.47 1.38 复 筛 碱性 蛋白酶 1.00 0.92 0.84 1.13 0.89 0.73 0.98 0.82 0.98 0.72 1.05 中性 蛋白酶 1.00 1.22 1.09 1.65 1.19 0.86 1.34 1.4 0.59 0.85 0.94 酸性 蛋白酶 1.00 0.56 -0.44 0.91 0.71 0.5 0.24 0.49 0.18 -0.03 2.08 纤维素 酶 1.00 1.22 0.89 1.5 1.09 1.02 1.14 1.57 1.16 0.96 1.26 α-淀粉 酶 1.00 1.11 1.02 1.44 0.92 1.07 0.97 1.26 0.96 1.09 1.14 研究报告 25· · 2009 No．11 Serial No．212 China Brewing 表3 亚硝基胍诱变后K值最大的10株米曲霉酶活测定结果 Table 3. Enzyme activity of the top 10 A. oryzae strains with largest K values after NTG mutation 项目 原始 株 ON1 ON2 ON3 ON4 ON5 ON6 ON7 ON8 ON9 ON10 初筛K值 1.26 1.67 1.6 1.6 1.64 1.62 1.75 1.6 1.62 1.62 1.7 复 筛 碱性蛋 白酶 1.00 0.98 1.01 1.14 1.01 1.29 1.08 0.57 1.11 1.00 1.26 中性蛋 白酶 1.00 1.30 1.40 1.41 1.34 1.54 1.13 1.05 1.12 1.11 1.3 酸性蛋 白酶 1.00 1.39 0.22 0.16 1.34 0.51 0.4 0.79 0.97 0.81 0.79 纤维素 酶 1.00 1.13 1.22 1.23 1.11 1.14 1.19 1.63 1.16 1.09 1.23 α-淀粉 酶 1.00 1.18 1.25 1.27 1.06 1.23 0.80 1.33 1.13 0.97 0.89 综合3种诱变方法对米曲霉的诱变改良效果，亚硝基 胍诱变和复合诱变的效果较好。综合考虑各种酶活性以 及其在发酵过程中的重要性，筛选出ONU3、ONU7菌株。 将这2个菌株接种于PDA培养基上，传代3代后，制备种曲， 分别测定其酶活，2菌株绝大部分酶活性较原始株提高的 程度均保持稳定，具有较好的遗传稳定性，但2菌株的酸性 蛋白酶活性的遗传稳定性较差，其原因进一步探讨。 2.3 酱油曲霉高酶活菌株的诱变筛选 2.3.1 酱油曲霉的紫外诱变筛选结果 酱油曲霉经过紫外线诱变，致死率为99.4%。由表5可 以看出，初筛K值最大得10株诱变株（编号为SU1~SU10） 中，除SU6之外，其他菌株的碱性蛋白酶活性均有不同程 度的提高；除SU2之外，其他菌株的中性蛋白酶活性均有 不同程度的提高；大部分诱变株其他酶类的活性也有不同 程度的提高。综合考虑，SU3、SU8、SU9、SU10的诱变效果 较好，其中SU9的改良效果最好，其中性蛋白酶、纤维素 酶、α-淀粉酶活性比原始株分别提高了44%、35%、45%。 2.3.2 酱油曲霉的亚硝基胍诱变筛选结果 酱油曲霉经过化学诱变剂亚硝基胍诱变，致死率为 96%。由表6可以看出，初筛K值最大的10株诱变株（编号 为SN1~SN10），综合考虑，仅SN3的诱变效果较好，其碱性 蛋白酶、中性蛋白酶、纤维素酶酶活性比原始株分别提高 了47%、35%、53%。部分菌株的酸性蛋白酶酶活性出现负 值，这是由于曲线的截距为正值且大于所测OD值所 导致的误差。 2.3.3酱油曲霉的复合诱变筛选结果 酱油曲霉经亚硝基胍和紫外线复合诱变后，致死率为 97.3%。由表7可以看出，初筛K值最大的10株诱变株（编号 为SNU1~SNU10）中，大部分诱变株的各种酶（包括酸性蛋 白酶）活性均有不同程度的提高。综合考虑，SNU3和SNU9 的诱变效果较好，且酸性蛋白酶活性有较大幅度的提高。 综合3种诱变方法对酱油曲霉的诱变改良效果，紫外 诱变和复合诱变的效果较好。考虑各种酶活性以及其在 发酵过程中的重要性，筛选出SU9、SNU3、SNU9菌株。将 这3株菌株接种于PDA培养基上，传代3代后，制备种曲，分 别测定其酶活性，3株菌株绝大部分酶活性较原始株提高 表4 复合诱变后K值最大的10株米曲霉酶活测定结果 Table 4. Enzyme activity ratio of the 10 A. oryzae strains with largest K values after combination of UV and NTG 项目 原始 株 ONU 1 ONU 2 ONU 3 ONU 4 ONU 5 ONU 6 ONU 7 ONU 8 ONU 9 ONU 10 初筛K值 1.46 2.11 2.63 1.70 1.83 1.67 1.70 1.73 1.75 2.10 1.78 复 筛 碱性蛋 白酶 1.00 1.29 0.42 1.40 1.15 1.06 1.16 1.45 1.09 0.65 1.66 中性蛋 白酶 1.00 1.26 0.43 1.32 1.08 1.18 1.03 1.22 1.09 0.89 1.35 酸性蛋 白酶 1.00 0.72 2.33 1.17 -1.84 1.54 0.24 7.30 6.45 5.22 0.18 纤维素 酶 1.00 1.13 0.98 1.28 1.22 1.14 1.19 1.63 1.16 0.93 1.23 α-淀粉 酶 1.00 1.16 0.99 1.32 1.07 1.14 1.21 1.59 1.38 0.96 1.70 表5 紫外诱变后K值最大的10株酱油曲霉酶活测定结果 Table 5. Enzyme activity of the top 10 A. sojae strains with largest K values after UV mutation 项目 原始 株 SU1 SU2 SU3 SU4 SU5 SU6 SU7 SU8 SU9 SU10 初筛K值 1.37 1.67 1.75 1.70 1.62 1.79 2.00 1.63 1.70 1.73 1.82 复 筛 碱性蛋 白酶 1.00 1.31 1.20 1.49 1.28 1.41 0.89 1.34 1.24 1.20 1.57 中性蛋 白酶 1.00 1.18 0.83 1.28 1.66 1.18 1.35 1.27 1.37 1.44 1.59 酸性蛋 白酶 1.00 0.43 1.15 1.78 0.74 0.21 0.17 1.26 1.35 1.15 1.00 纤维素 酶 1.00 1.28 0.92 1.03 0.92 1.05 1.16 1.25 1.26 1.35 1.41 α-淀粉 酶 1.00 1.02 1.01 1.11 1.06 0.96 0.95 0.92 1.00 1.45 1.36 表6 亚硝基胍诱变后K值最大的10株酱油曲霉酶活测定结果 Table 6. Enzyme activity ratio of the top 10 A. sojae strains with largest K values after NTG mutation 项目 原始 株 SN1 SN2 SN3 SN4 SN5 SN6 SN7 SN8 SN9 SN10 初筛K值 1.25 1.73 1.83 1.77 1.75 2.25 1.75 1.65 2.25 1.69 1.87 复 筛 碱性蛋 白酶 1.00 0.97 0.62 1.47 1.30 1.29 1.15 0.90 0.87 0.96 1.06 中性蛋 白酶 1.00 0.85 1.08 1.35 1.24 1.20 0.99 1.01 1.14 0.91 1.13 酸性蛋 白酶 1.00 -0.95 -0.18 -0.18 0.50 -0.68 0.82 -0.11 0.74 0.08 0.58 纤维素 酶 1.00 1.18 0.95 1.53 0.85 1.04 1.09 0.99 1.23 1.33 1.47 α-淀粉 酶 1.00 0.93 0.92 1.22 1.02 0.90 0.93 0.98 1.32 1.15 1.30 Research Report26· · 中 国 酿 造 2009年 第 11期 总第 212期 表7 复合诱变后K值最大的10株酱油曲霉酶活测定结果 Table 7. Enzyme activity ratio of the top 10 A. sojae strains with largest K values after combination of UV and NTG 项目 原始 株 SNU 1 SNU 2 SNU 3 SNU 4 SNU 5 SNU 6 SNU 7 SNU 8 SNU 9 SNU 10 初筛K值 1.27 1.67 1.78 2.00 1.70 2.00 1.88 1.78 1.73 1.67 1.67 复 筛 碱性蛋 白酶 1.00 1.27 0.98 1.35 1.06 0.97 1.46 0.96 1.20 1.35 1.11 中性蛋 白酶 1.00 1.15 0.37 1.29 1.37 0.86 1.32 1.24 1.03 1.12 0.81 酸性蛋 白酶 1.00 2.09 1.28 3.63 4.40 3.50 3.74 0.10 4.44 4.25 2.26 纤维素 酶 1.00 0.87 0.73 1.31 0.91 0.74 1.15 1.56 1.10 1.19 1.47 α-淀粉 酶 1.00 0.99 0.93 1.26 0.85 0.91 0.91 1.39 1.01 1.40 1.32 且稳定，并具有较好的遗传稳定性，但酸性蛋白酶酶活的 遗传稳定性较差，相对于原始株其比值有较大的波动。 3 讨论 酱油发酵过程中，曲霉所分泌的蛋白酶起了最重要的 作用，酱油发酵菌株的蛋白酶活与菌体生长速度和个体菌 的比产酶速度有关。蛋白酶能够分解酪蛋白产生透明圈， 通过酪蛋白透明圈D与菌落直径D0之比可了解其产酶的 速度。张玉涛等[11]报道可以通过酪蛋白平板培养粗略估计 菌株发酵酱醅的综合酶活；吴华昌等[12]也证实，酪蛋白透 明圈法可以初步估算曲霉蛋白酶的相对酶活性高低，从而 大大减少复筛的工作量。实验结果表明，K值与米曲霉和 酱油曲霉的酶活性（尤其是在pH7时测定的中性蛋白酶活 性）呈一定正相关性，然而，K值大小并不与酶活性大小呈 线性关系，仅能作为初步筛选高酶活菌株的一个标准，酶活 性大小的最终确定应当以复筛测定结果为准。 比较紫外诱变、亚硝基胍诱变2种诱变方法发现，对于 米曲霉来说，亚硝基胍诱变的效果要比紫外诱变的效果 好，而对于酱油曲霉来说则相反；而复合诱变用于2种曲霉 高酶活菌株的诱发突变，可以获得各种酶类活性均有很大 提高的诱变株。因此，在实际生产中，为了获得较好的诱变 效果，采用2种诱变方法结合的复合诱变较好。 由于米曲霉和酱油曲霉酸性蛋白酶的酶活性本身很 低，且标准曲线的截距为正值，因此，所测OD值的少量误 差就可以引起酶活很大的变化，导致不同批次测量中突变 株相对于原始株酸性蛋白酶酶活的比值有较大的波动。例 如，ONU3第1代的酸性蛋白酶活性为原始株的117%，传代 3代后降低到原始株的95%；ONU7原来较原始株大幅度提 高到730%，传3代后酶活为原始株的169%。因此，对于酸 性蛋白酶活性的测定需进一步优化，以提高其准确性。 实验通过3种方法对2种酱油发酵用菌株进行诱变，筛 选出2株米曲霉高酶活菌株和3株酱油曲霉高酶活菌株，为 进一步的工业化应用奠定了基础，对其进行进一步优化后 将具有良好的应用前景。 参考文献： [1] M譈LLER C, MCLNTYRE M, HANSEN K, et al. 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