C7_基因芯片技术简介

第七章第七章 基因芯片技术简介基因芯片技术简介 7.1 7.1 生物芯片简介生物芯片简介 7.2 7.2 生物芯片的分类生物芯片的分类 7.3 7.3 基因芯片的制作基因芯片的制作 7.4 7.4 基因芯片的杂交及结果分析基因芯片的杂交及结果分析 7.5 7.5 基因芯片的应用基因芯片的应用 7.1 7.1 生物芯片简介生物芯片简介 •• 生物芯片（生物芯片（biochipbiochip））又称又称微阵列微阵列 ((microarraymicroarray))，， 是指通过机器人自动印迹或光引导化学合成技术在是指通过机器人自动印迹或光引导化学合成技术在 硅片、玻璃、凝胶或尼龙膜上制造的生物分子微阵硅片、玻璃、凝胶或尼龙膜上制造的生物分子微阵 列，根据分子间的特异性相互作用的原理，将生命列，根据分子间的特异性相互作用的原理，将生命 科学领域中不连续的分析过程集成于芯片表面，以科学领域中不连续的分析过程集成于芯片表面，以 实现对细胞、蛋白质、基因及其它生物组分的准确、实现对细胞、蛋白质、基因及其它生物组分的准确、 快速、大信息量的检测。快速、大信息量的检测。 基因芯片（基因芯片（gene chipgene chip）） •• 又称又称DNADNA芯片（芯片（DNA chipDNA chip）或）或DNADNA阵列（阵列（DNA DNA microarraymicroarray），），是生物芯片的一种。是生物芯片的一种。 •• 是将是将DNADNA分子固定于支持物上，并与标记的样分子固定于支持物上，并与标记的样 品杂交，通过自动化仪器检测杂交信号的强度来品杂交，通过自动化仪器检测杂交信号的强度来 判断样品中靶分子的数量，进而判断样品中靶分子的数量，进而得知样品中得知样品中 mRNAmRNA的表达量的表达量，也可进行基因突变体的检测和，也可进行基因突变体的检测和 基因序列的测定，为进一步了解基因间的相互关基因序列的测定，为进一步了解基因间的相互关 系及基因克隆提供有用的工具。系及基因克隆提供有用的工具。 •• 19981998年度世界十大科技进展之一。年度世界十大科技进展之一。 基因芯片技术的发展简史基因芯片技术的发展简史 Southern & Northern Southern & Northern BlotBlot Dot Dot BlotBlot MacroarrayMacroarray MicroarrayMicroarray •• 19891989年，年，SouthernSouthern获得在刚性载体表面固定寡聚核苷酸及获得在刚性载体表面固定寡聚核苷酸及 杂交法测序的专利杂交法测序的专利 •• 19921992年，年，AffymetrixAffymetrix公司成功应用光导向平板印刷技术，公司成功应用光导向平板印刷技术， 直接在硅片上合成寡核甘酸点阵的高密度芯片，是世界上直接在硅片上合成寡核甘酸点阵的高密度芯片，是世界上 第一块原位合成的基因芯片。第一块原位合成的基因芯片。 •• 19971997年，美国年，美国StanfordStanford大学大学BrownBrown实验室，制作了世界上实验室，制作了世界上 第一张全基因组芯片（含有第一张全基因组芯片（含有61166116个基因的酵母全基因组芯个基因的酵母全基因组芯 片）。片）。 样品制备、标记 芯片制备 杂交信号检测 数据分析 杂交 基因芯片分析 基因芯片技术的特点基因芯片技术的特点 •• 微型化，所需试剂用量少微型化，所需试剂用量少（（ngng级级mRNAmRNA、、 μμll级杂交液）。级杂交液）。 •• 高通量性高通量性 •• 平行性平行性 •• 高度自动化高度自动化 •• 缺点：在同一温度下杂交，不同探针杂交缺点：在同一温度下杂交，不同探针杂交 效率不同；效率不同；仪器仪器、试剂昂贵。、试剂昂贵。 芯片点样仪；杂交仪；芯片扫描仪 7.2 7.2 生物芯片的分类生物芯片的分类 按载体分：按载体材料分： •• 玻璃芯片玻璃芯片：荧光背景低、应用方便，：荧光背景低、应用方便， 材料易得，应用最广泛。材料易得，应用最广泛。 •• 硅芯片硅芯片 •• 陶瓷芯片陶瓷芯片 •• 原位合成（原位合成（lociloci--synthetic DNAsynthetic DNA））芯片芯片：利用半导体光：利用半导体光 蚀刻技术原位合成一定长度（蚀刻技术原位合成一定长度（~20 ~20 bpbp））的寡核甘酸片段。的寡核甘酸片段。 •• 微阵列（微阵列（microarraymicroarray））芯片芯片：：DNADNA直接点样（针点或喷直接点样（针点或喷 点），密度高、制作方便，应用最广泛。点），密度高、制作方便，应用最广泛。 •• 电定位（电定位（microelectronicmicroelectronic））芯片芯片：利用静电吸附原理将：利用静电吸附原理将 DNADNA定位在带电材料上。制作复杂，点样密度低。定位在带电材料上。制作工艺复杂，点样密度低。 按点样方式分按点样方式分 • 测序芯片 • 表达谱芯片 • 基因差异表达分析芯片 按芯片使用功能分按芯片使用功能分 测序 芯片 表达谱芯片表达谱芯片 •• 将克隆到的基因特异的探针或其将克隆到的基因特异的探针或其cDNAcDNA片段固片段固 定在芯片上，对来源于不同的个体、组织、定在芯片上，对来源于不同的个体、组织、 细胞周期、发育阶段、分化阶段、病变及刺细胞周期、发育阶段、分化阶段、病变及刺 激细胞内的激细胞内的mRNAmRNA或或cDNAcDNA进行检测。进行检测。 •• 寻找与疾病、突变等相关的基因，对基因间寻找与疾病、突变等相关的基因，对基因间 相互作用进行研究。相互作用进行研究。 基因差异表达分析芯片基因差异表达分析芯片 •• 属于表达谱芯片的一种，目前应用最广泛。属于表达谱芯片的一种，目前应用最广泛。 •• 主要用于分析两组来源不同的主要用于分析两组来源不同的mRNAmRNA转录转录 丰度的差异。丰度的差异。 •• 两组样品分别用不同的荧光素标记两组样品分别用不同的荧光素标记（（cy3cy3、、 cy5cy5），），同比例混合并同时与同比例混合并同时与DNADNA芯片杂芯片杂 交，通过计算两组样本杂交信号的比值并通交，通过计算两组样本杂交信号的比值并通 过设立域值，来确定已知基因在不同来源样过设立域值，来确定已知基因在不同来源样 本中表达的差异的基因，甚至发现新基因。本中表达的差异的基因，甚至发现新基因。 申请 7.3 7.3 基因芯片的制备基因芯片的制备 •• 原位合成原位合成::通过特定的技术在芯片的通过特定的技术在芯片的 特定区域原位合成寡核苷酸。特定区域原位合成寡核苷酸。 •• 预合成后点样法预合成后点样法：预先合成：预先合成DNADNA或或 制备基因探针，点制备基因探针，点样系统把这些合成好样系统把这些合成好 的探针样品涂印或喷涂在载体上。的探针样品涂印或喷涂在载体上。 显微光蚀刻技术显微光蚀刻技术DNADNA合成法合成法 原位合成原位合成((In SituIn Situ Synthesis)Synthesis)法法 •• 结合半导体工业中的光蚀刻技术和结合半导体工业中的光蚀刻技术和DNADNA的化学合成的化学合成 法，在各个点上原位合成所需的法，在各个点上原位合成所需的DNADNA片段。片段。 •• 精读和密度最高，可达精读和密度最高，可达400,000400,000个点个点/1.6 cm/1.6 cm22。。 •• 制作时间长，价格昂贵。制作时间长，价格昂贵。 Light directed oligonucleotide synthesisLight directed oligonucleotide synthesis 光敏保护基团 光刻掩膜 激光点光源的照 射下，除去光敏 保护基团，使活 性基团暴露出来 单核苷酸偶联 光敏保护基团 接触点样法接触点样法 •• 将样品直接点在载体上，仪器结构简单、将样品直接点在载体上，仪器结构简单、 快速、经济，目前应用最广泛。快速、经济，目前应用最广泛。 •• 10,00010,000个点个点/3.6 cm/3.6 cm22 •• 样品需预先合成和纯化，保存好。样品需预先合成和纯化，保存好。 •• 点样针从点样针从9696孔或孔或384384孔板上吸取孔板上吸取 固定量探针溶液，把探针点到固定量探针溶液，把探针点到 玻片表面，让探针末端的化学玻片表面，让探针末端的化学 基团与玻片表面的基团形成共基团与玻片表面的基团形成共 价键。价键。 针式点样针式点样 Best!Best! •• 将样品用喷嘴喷射到载体上，喷嘴不与芯片接触。将样品用喷嘴喷射到载体上，喷嘴不与芯片接触。 •• 用微孔板装载预合成用微孔板装载预合成探针溶液探针溶液，喷头从微孔板吸取探针溶，喷头从微孔板吸取探针溶 液，由电脑依据预定的程序自动控制打印喷头在芯片支持液，由电脑依据预定的程序自动控制打印喷头在芯片支持 物上移动，并根据芯片不同位点探针序列需要将特定的物上移动，并根据芯片不同位点探针序列需要将特定的探探 针针试剂（不足纳升）喷印到特定位点。试剂（不足纳升）喷印到特定位点。 喷墨法喷墨法 Removable Tip Orifice High-Speed MicroSolenoid ValveSyringe Pump Switching Valve Reservoir Connecting Tubing Controller 孔 真空管 阀 喷墨法喷墨法 探针的固定化 • 针式或喷墨打印探针 后，要通过紫外线交联 或Schiff碱连接法，将 探针固定在支持物表面 探针探针DNADNA分子的制备分子的制备 •• mRNAmRNA反转录获得的反转录获得的cDNAcDNA文库文库 •• 利用基因组测序数据，经生物信息学分析得到利用基因组测序数据，经生物信息学分析得到 代表各个基因的序列数据，然后通过代表各个基因的序列数据，然后通过PCRPCR扩增扩增 或或DNADNA固相合成得到所期望基因的片段。固相合成得到所期望基因的片段。 •• 人工合成的寡核苷酸片段人工合成的寡核苷酸片段 •• 双链或单链的双链或单链的DNADNA或或RNARNA片段片段 •• 靶基因样品来源：靶基因样品来源： PCRPCR产物：序列分析产物：序列分析 RTRT--PCRPCR产物：基因表达分析产物：基因表达分析 •• 一般一张芯片杂交需要一般一张芯片杂交需要3 3 μμg mRNAg mRNA样品样品 •• 因个体差异、匀浆、研磨损耗等原因，送检样品应多因个体差异、匀浆、研磨损耗等原因，送检样品应多1~21~2倍。倍。 •• 样品保存时应保证避免样品保存时应保证避免RNaseRNase的分解作用的分解作用 7.4.1 7.4.1 靶基因样品的制备与标记靶基因样品的制备与标记 •• 靶基因样品被标记靶基因样品被标记后，与芯片上的探针分子杂交。后，与芯片上的探针分子杂交。 •• 荧光标记荧光标记；生物素和放射性同位素标记；生物素和放射性同位素标记 •• 双色荧光标记：常用标记物为荧光素双色荧光标记：常用标记物为荧光素Cy3Cy3和和Cy5Cy5 ，，分别用来分别用来 标记两中不同的样品（如样品和对照）。标记两中不同的样品（如样品和对照）。 •• cy3cy3：：激发波长激发波长550 nm550 nm，，发绿色荧光。发绿色荧光。 cy5cy5：：激发波长激发波长649 nm649 nm，，发红色荧光。发红色荧光。 靶基因样品的标记靶基因样品的标记 • 末端标记：在引物上标记有荧光素，在DNA扩增过程时，使新 形成的DNA链末端带有荧光素。 • 随机插入：选择四种碱基，使其中一种或几种挂有荧光素，在 PCR过程中，带有荧光素的碱基掺入到形成的DNA链中。 • 反转录标记：以mRNA（或总RNA）为模板，利用随机寡核甘 酸或oligo-dT为引物进行反转录，带有荧光素的碱基就会掺入 到新合成的单链cDNA中。 标记方法标记方法 •• 荧光标记的核苷酸非聚合酶的天然底物，掺入效率比天然底物低很荧光标记的核苷酸非聚合酶的天然底物，掺入效率比天然底物低很 多；对于两种不同的样品材料，不同的荧光素标记物在反转录过程多；对于两种不同的样品材料，不同的荧光素标记物在反转录过程 中中掺入到掺入到cDNAcDNA中的效率有可能不相同，从而造成假阳性中的效率有可能不相同，从而造成假阳性。。 •• 后标记技术：后标记技术：cDNAcDNA合成过程中，先不加入荧光素标记物，而是先合成过程中，先不加入荧光素标记物，而是先 在两种材料中都加入同一种带化学活性基团的核苷酸类似物在两种材料中都加入同一种带化学活性基团的核苷酸类似物氨基烯氨基烯 丙基丙基--dUTPdUTP(aminoallyl(aminoallyl--dUTP,aadUTP,aa--dUTPdUTP))，从而保证两种材料中标，从而保证两种材料中标 记物的掺入效率完全一致，纯化得到记物的掺入效率完全一致，纯化得到aaaa--dUTPdUTP标记标记的的cDNAcDNA后，通后，通 过过aaaa--dUTPdUTP氨基烯丙基与氨基烯丙基与Cy3Cy3和和Cy5Cy5上上NN--羟基丁二酸亚胺树脂相结羟基丁二酸亚胺树脂相结 合而标记不同的荧光素标记。合而标记不同的荧光素标记。 标记方法标记方法 •• 将杂交溶液覆盖芯片的探针，用盖玻片覆盖，即可杂交。将杂交溶液覆盖芯片的探针，用盖玻片覆盖，即可杂交。 •• 与常规分子杂交过程基本相似：封闭、预杂交、杂交、洗脱。与常规分子杂交过程基本相似：封闭、预杂交、杂交、洗脱。 •• 芯片杂交炉芯片杂交炉 （（Hybridization ovenHybridization oven，，AffymetrixAffymetrix公司）：全公司）：全 自动控制芯片的杂交过程。温度控制精确，芯片舱的转动提自动控制芯片的杂交过程。温度控制精确，芯片舱的转动提 供充分的混合。可同时处理供充分的混合。可同时处理6464张芯片。张芯片。 杂交杂交 •• 基因芯片杂交结果要用专用的激光基因芯片杂交结果要用专用的激光 共聚焦扫描系统读取共聚焦扫描系统读取 B B A C D E 放大器 数模转 换器 计算机 A:激光器 B:滤光片 C:二色镜 D:反光镜 E:关栅 杂交信号检测杂交信号检测 完全配对杂交分子荧光最强 不杂交分子背 景荧光 不完全杂交分子荧 光1/35~1/5 •• 采用氩离子激光器来激发荧光分子来产生定量的杂交信号。采用氩离子激光器来激发荧光分子来产生定量的杂交信号。 •• 可扫描芯片上成千上万的探针，扫描的同时给出高分辨率的实可扫描芯片上成千上万的探针，扫描的同时给出高分辨率的实 时的图像，同时荧光亮度的数据储存在原始文件中。时的图像，同时荧光亮度的数据储存在原始文件中。 全自动检测及分析系统全自动检测及分析系统 适用于适用于DNADNA芯片应用芯片应用 激光共聚焦扫描系统激光共聚焦扫描系统 灵敏度极高灵敏度极高 分辨率极高分辨率极高 多种激发及检测通道多种激发及检测通道 适用于多种生物标记荧光探针适用于多种生物标记荧光探针 ScanArrayScanArray扫描仪扫描仪 不同的颜色代表一个探不同的颜色代表一个探 针点杂交上的带荧光标针点杂交上的带荧光标 记的核酸分子数的差异。记的核酸分子数的差异。 基因芯片扫描结果基因芯片扫描结果 •• QuantArrayQuantArray微阵列分析软件，对芯片上的每个点进行鉴微阵列分析软件，对芯片上的每个点进行鉴 定、确定杂交背景，计算每个点的杂交信号强度。定、确定杂交背景，计算每个点的杂交信号强度。 •• 化处理标准化处理：校正荧光标记物的标记和检测效率之间的：校正荧光标记物的标记和检测效率之间的 差异，分析两个样品的差异，分析两个样品的RNARNA起始量之间的差异。起始量之间的差异。 •• 比值分析，鉴定比值分析，鉴定差异表达基因差异表达基因 •• 生物信息学分析（如生物信息学分析（如clustercluster算法、差异基因的同源性算法、差异基因的同源性 比对，差异基因的相关文献检索等）比对，差异基因的相关文献检索等） 数据处理和分析数据处理和分析 7.5 7.5 基因芯片的应用基因芯片的应用 •• 基因表达分析基因表达分析 •• 基因型及多态分析基因型及多态分析 •• 杂交测序杂交测序 •• 核酸和蛋白质相互作用的研究核酸和蛋白质相互作用的研究 •• 疾病的诊断与治疗疾病的诊断与治疗 •• 药物开发药物开发 •• 营养与食品卫生领域营养与食品卫生领域 •• 环境科学领域环境科学领域 参考书 • 马文丽 等，DNA芯片技术的方法与应用， 广东科技出版社，2002 • 马立人等，生物芯片，化学工业出版社， 1999（第一版） 第七章 基因芯片技术简介 7.1 生物芯片简介 基因芯片（gene chip） 基因芯片技术的发展简史 基因芯片分析流程 基因芯片技术的特点 7.2 生物芯片的分类 按点样方式分 按芯片使用功能分 表达谱芯片 基因差异表达分析芯片 7.3 基因芯片的制备 显微光蚀刻技术DNA合成法� 原位合成(In Situ Synthesis)法 接触点样法 针式点样 喷墨法 喷墨法 探针的固定化 探针DNA分子的制备 7.4.1 靶基因样品的制备与标记 靶基因样品的标记 标记方法 标记方法 杂交 杂交信号检测 ScanArray扫描仪 基因芯片扫描结果 数据处理和分析 7.5 基因芯片的应用 参考书