黄连上清丸微生物限度检查方法学验证

黄连上清丸微生物限度检查方法学验证 ,特玉香 刘鹏 戴翚 马仕洪 苏德模 胡昌勤 (中国药品生物制品检定所 北京 100050) 黄连上清丸为药典品种，分析进行该品种微生物限度检查方法验证实验的必要 性。按中国药典2005版的规定，采用7个生产企业生产的黄连上清丸进行该品种微 生物限度检查方法的验证。黄连上清丸对5株阳性代表菌株有不同程度的抗菌活性， 但有的批无抗菌活性；即使同一厂家的不同批产品其抗菌活性亦有差异。：1、微生物限度检查方法验证是必要的。2、中成药质量的稳定性可能与原药材质量和工艺有关。 方法验证试验、微生物限度、回收率、中药材。 Simple Analysis about Validation of Method in Microbial limit Tests for Huanglian Shangqing Wan TE Yuxiang LIU Peng DAI Hui MA Shihong SU Demo HU Changqin* (National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products,Beijing 100050) Abstract Objective: Huanglianshangqingwan has been recorded in the Chinese Pharmacopoeia. The assay tried to analyse the necessary for validation of microbial test with many batches Huanglianshangqingwan. Methods: According to the Chinese Pharmacopoeia 2005, Validate the microbiological test method of huanglianshangqingwan from 7 corporations. Results: huanglianshangqingwan is antibacterial for 5 kinds of control bacteria by different grade , but some batches are not antibacterial ; different batch appear different ability of antibacterial even from one corporation . Conclution: 1. Validation of microbiological test is necessary . 2. The stability of quality is based on the quality of medicine materials and facture of production in Chinese patent medicine. Key wordsvalidation test of method; microbial limits; recovery rate; Chinese crude drug 黄连上清丸为内科实火证类非处方药，国内有百余企业生产；含有黄连10g、桅子（姜制）80g、连翘80g、蔓荆子（炒）80g、防风 40g、荆芥穗80g、白芷80g、黄芩 80g、菊花 160g、薄荷40g、大黄（酒炒）、320g黄柏（酒炒）40g、桔梗80g、川芎 40g、石膏40g、 , 通讯作者 Email: hucq@nicpbp.org.cn Tel. (010)-67095308 1 旋覆花20g 和甘草 40g 十七味中药，其制剂有水丸、水蜜丸和大蜜丸；主治清热通便，散 风止痛；用于上焦风热所致的头晕脑胀，牙龈肿痛，口舌生疮，咽喉红肿，耳痛耳鸣，暴发 [1-2]火眼，大便干燥，小便黄赤。对中成药中污染微生物的检查是保证药品安全性质控的重 [3-6]要指标。由于黄连上清丸中的多种药材如黄连、桅子、连翘等均具有明显的抗菌活性，为保证微生物限度检查法结果的准确性，根据中国药典2005版的规定，必须采用方法学验 [2]证试验说明实验方法的有效性。本文报道我们对黄连上清丸微生物限度检查方法的验证实 验结果，用于说明微生物限度检查方法验证工作的必要性。 1.1.样品：黄连上清丸水丸（规格：6克/袋）分别为陕西香菊制药有限责任公司（批号 050401、030302）、西安正大药业有限公司（批号：050427）、宝鸡秦岭国药厂（批号：050310）、宝商集团陕西辰济集团药业药厂（批号：050118）和陕西汗王药业有限公司的产品；黄连上清 丸蜜丸（规格：6克/丸）分别为北京同仁堂股份公司（批号：4015556、4015602）和唐山天思药业有限公司（批号：040101）的产品。 1.2培养基：胆盐乳糖增菌液（批号：0504192）、玫瑰红钠琼脂（批号：050531）营养琼脂（批号：050328）、营养肉汤（批号：0050508）、改良马丁（批号：040302）、改良马丁琼脂（批号：050520）均由中国药品生物制品检定所提供。 1.3菌种：枯草杆菌 (Bacillus subtilis) [CMCC(B)63501]、金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) [CMCC(B) 26003]、大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(F) 44102]、白色念珠菌 (Candida albicans) [CMCC(F) 98001]均由中国医学细菌保藏中心提供；黑曲霉 (Aspergillus niger) [CMCC(F)98003] 由中国药品生物制品检定所提供。 参照中国药典2005版一部微生物限度检查法 [2]实验，简述之： 2.1菌液制备 2.1.1取经37?培养18~24h的金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠埃希菌的营养肉汤培养物 -5 -71ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10~10，使成50~100cfu/ml，经活菌计数后备用。 2.1.2取经25~28? 培养18~24h的白色念珠菌的改良马丁液体培养物1ml，用0.9%无菌氯 -5 -6化钠溶液10倍稀释至10~10，使成50~100cfu/ml，经活菌计数后备用。 2.1.3取经25~28?培养1周的黑曲霉改良马丁琼脂斜面培养物，用5ml 0.9%无菌氯化钠溶液洗下黑曲霉孢子，吸出孢子悬液1ml，加0.9%无菌氯化钠溶液适量稀释至与标准比浊管 -4浊度相当的孢子悬液，取1 ml孢子悬液，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10，使孢子成50~100cfu/ml，经活菌计数后备用。 2.2供试液制备：称样品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，使匀，为1:10供试液。 2 2.3验证试验： 采用培养基稀释法。取供试液（1：10）入皿，然后每皿加15~20ml营养琼脂或玫瑰红钠琼脂培养基，摇匀，即培养基稀释。如1ml/皿为1：200稀释，0.5ml/皿为1：400稀释。 对陕西香菊制药有限责任公司的1批样品，用稀释法进行验 证实验，其不同次验证实验回收率结果（见表1）显示：本品对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄 球菌有较强的抗菌作用，回收率为0-4.3%；但采用稀释法，稀释浓度大于1：700后，即可消除其抑菌作用，使枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌均能正常生长。 1 Tab 1 Recovery of dilute method in microbiological test of huanglianshangqingwan 阳性菌加入回收率（%） 实验次数 稀释浓度 (recovery of control bacteria) (experiment (concentration 大肠埃希菌 枯草芽孢杆菌 金葡球菌 白色念珠菌 黑曲霉 times) of dilute) (E. coli ) (B. subtilis) (S. aureus) (C.albicans) (A. niger) 1 100 4.3 0 90 100 1：200 2 1：200 71.9 4.3 0 80 100 3 1：200 73.1 4.3 0 88.2 75.0 4 1：400 / 0 4.3 / / 5 1：667 / 100.0 66.7 / / 6 / 93.3 93.3 / / 1：1000 七个企业的黄连上清丸分别用稀释法进行验证实 验，其回收率试验结果（见表2）显示：?的样品对大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡 萄球菌的回收率为0%；?的样品对上述3株菌的回收率分别为55%、0%、0%，?的样品其枯草芽孢杆菌回收率为43%；而?、?、?、?的回收率均在70%以上。用培养基稀释 至1：400后，?的样品对大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的回收率仍均为0%；?的样品对枯草芽孢杆菌的回收率为0%，?的样品对枯草芽孢杆菌的回收率为100%。说明不同企业的产品具有不同的抑菌活性。由于?、?的样品均为蜜丸，提示，抑菌作用与制 剂类型无关。 Tab 2 Recovery of dilute method in microbiological test of huanglianshangqingwan from 7 corporations 阳性菌加入回收率（%） 稀释浓度 生产厂家 (recovery of control bacteria) (concentration (corporation) 大肠埃希菌 枯草芽孢杆菌 金葡球菌 白色念珠菌 黑曲霉 of dilute) (E. coli ) (B. subtilis) (S. aureus) (C. albicans) (A. niger) ? 1：200 0 0 0 100 100 1：400 0 0 0 / / ? 1：200 100 100 94 100 100 ? 1：200 100 100 100 100 100 ? 1：200 55 0 0 100 100 1：400 100 0 80 / / ? 1：200 100 79 100 100 87 ? 1：200 100 43 100 100 100 100 100 100 / / 1：400 ? 1：200 100 100 100 100 87 注：?北京同仁堂制药厂、?唐山天恩药业有限公司、?陕西汉王药业有限公司、?宝商集团辰济药业有 3 限公司、?陕西香菊制药有限责任公司、?宝鸡秦岭国药厂、?西安正大制药有限公司。 同厂不同批的黄连上清丸用稀释法进 行验证实验，其回收率试验结果（见表3）显示：相同企业不同时期的产品，对大肠埃希菌、 枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的回收率可差异较大。 Tab 3 recoverice of dilute method in microbiological test of huanglianshangqingwan from different batchs in same corporation (1:200) 阳性菌加入回收率（%） 样品 (recovery of control bacteria) (sample) 大肠埃希菌 枯草芽孢杆菌 金葡球菌 白色念珠菌 黑曲霉 (E. coli ) (B. subtilis) (S. aureus) (C. albicans) (A. niger) 87.0 0.0 57.0 84.0 93.0 同仁堂4015556 0.0 0.0 0.0 100 100 同仁堂4015602 陕西香菊030302 100 4.3 0.0 90 100 100 79 100 100 87 陕西香菊050401 方法学验证是微生物限度检查的一项新工作。不同企业生产的黄连上清丸具有截然不同 的抑菌效果，进一步说明了2005版药典强调进行方法学验证实验的必要性。 按2005版中国药典的规定，验证实验应对包括细菌、霉菌和酵母菌的5株试验菌逐一 [7-9]进行回收率验证，与国外药典的一般规定相似。黄连上清丸对大肠埃希菌、枯草芽孢杆 菌、金黄色葡萄球菌有明显的抑菌作用，而对白色念珠菌、黑曲霉菌无抑菌作用（表1－2）；且对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌比对大肠埃希菌更敏感。由于验证实验的根本目的是为 了确证样品的前处理过程是否有效的去除了其抑菌活性，因此对黄连上清丸建议实际验证中 仅选用枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌作为验证菌株即可，无须再用大肠埃希菌、白色念珠 菌、黑曲霉菌进行验证，这样不仅简化了方法，也可节省人力物力。 [2]药典规定‘验证试验至少应进行三次独立的平行试验’。我们认为，在一般情况下，按药典规定做细菌、霉菌和酵母菌计数时，若各稀释级的平板菌落数随稀释级递增而10倍递减，表明供试品无抑菌作用，即按此法检验，无须做计数方法的验证。若相邻两稀释级的 菌落数乘以稀释倍数的比值大于5，表明供试品有抑菌作用。应消除其抑菌作用后（试验菌 回收率大于70%），再做细菌、霉菌和酵母菌计数。实验时可取同批样品按验证过的方法复 试2次（考察方法的重现性）；必要时，再取不同批号的二批样品，按验证过的方法分别进 行独立的平行试验（考察样品质量的稳定性）。若各稀释级的平板菌落数为0或极少，应做验证试验，以确证是抑菌作用或染菌极少。 黄连上清丸由17味中药组方，据文献报道[]2-5，其中黄连、栀子、连翘、黄柏、黄芩、 白芷等多味中药均对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌等有抗菌作用，与验证的 实验结果（表1－3）是一致的。不同企业的产品、相同企业不同时期生产的产品之间的抑 菌作用的显著差异，可能与企业采用的原药材的品质、产地、成分、含量等的不同有关，也 提示不同产品的质量有所不同。是否可以利用其抑菌活性谱评价其产品质量有待于进一步的 4 研究。 总之，通过对不同企业和同一企业不同批次的黄连上清丸的验证实验，我们认为：（1）黄连上清丸的细菌、霉菌和酵母菌计数方法学验证试验结果，不仅表明药典规定方法验证的 必要性，而且方法学验证的数据对评价药品质量又提供了科学依据；（2）本品进行细菌、霉菌和酵母菌计数方法验证时，试验菌株仅选用金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌2株菌即可；（3）无抑菌作用的样品，无须做计数方法的验证。有抑菌作用的样品，在消除其抑菌作用 后做细菌、霉菌和酵母菌计数即可。必要时，应参照验证实验结果选择最敏感菌株进行实验， 以验证实验的有效性；（4）以抗菌消炎的中草药为主要组方的品种，无论何种形式提供的方 法验证，不可简单引用作为不做验证试验的依据。 参考文献 1 ChP 2000 Vol.? 2 ChP 2005 Vol.? 3 LIU Ru-yu（刘茹玉），CHEN Shou-tao（陈守涛）．黄连等8种中药对常引起医院内感染 的条件致病菌体外抗菌活性检测．Journal for Fujian collage of TCM（福建中医学院学报），2004，14（2） 4 NIU Xin-hua（牛新华），QIU Shi-cui（邱世翠），DI Da-lin（邸大琳），et al．The in vitro Growth Inhibition Effect of Forythia suspense (THUMB) VAHI (FSV) on Bacteria（连翘体外抑菌作用的研究）．Lishizhen medicine and material medica research（时珍国医国药），2002，13（6） 5 DUAN Fei（段飞），ZHANG Shuang-min（张双民），YANG Jian-xiong（杨健雄），et al． Studies on the anti-bacteria effect of extracts from Folium Forsythia in vitro（连翘叶提取物抑菌作用的研究）．西北药学杂志，2005，02 6 QIU Shi-cui（邱世翠），RONG Xian-guo（荣先国），DI Da-lin（邸大琳），et al．The in vitro Growth Inhibition Effect of Coptis chinesis Frach (CCF) on Bacteria（黄连的体外抑菌作用研究）． Lishizhen medicine and material medica research（时珍国医国药），2002 ，13（4） 7 USP 28:2752 8 BP 2002 Apendix XVI B A315 9 JP 14th:60 5