乳酸脱氢酶检测试剂盒(二硝基苯肼微板法)

乳酸脱氢酶检测试剂盒(二硝基苯肼微板法) 北京雷根生物技术有限公司 www.leagene.com 乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒(二硝基苯肼微板法) 简介: 乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH或LD)属于氧化还原酶,能够催化氢氧原子或电子从一中底物转移到另一种底物上乳酸脱氢酶是糖酵解和糖异生的一个极其重要的酶,含有锌离子,广泛分布于人和动物组织、植物和微生物中,能可逆的催化乳酸(L)和丙酮酸(P)之间的氧化还原反应。其反应公式: ++乳酸+NAD?丙酮酸+NADH+H。 L?P为正向反应;P?L为逆向反应,通过酶标仪检测440nm处吸光度,进测得的丙酮酸钠含量计算酶的活性。该试剂盒仅用于科研领域,不宜用于临床诊断或其他用途。 组成: 编号 TE0158 TE0158 Storage 名称 50T 100T 试剂(A): 丙酮酸标准(5mmol/L) 1ml 1ml 4? 避光 试剂(B): LDH Assay buffer 1.5ml 3ml 4? 避光 试剂(C): NAD Buffer 0.3ml 0.6ml RT 试剂(D): 二硝基苯肼溶液 1.5ml 3ml 4? 避光 试剂(E): 碱性显色液 5.25ml 10.5ml RT 使用说明 1份 操作步骤(仅供参考): 1、 准备样品: ? 血浆、血清样品:血浆、血清按照常规方法制备,可以直接用于本试剂盒的测定, -70?冻存,用于LDH的检测。 ?细胞或组织样品:取恰当细胞或组织进行匀浆,低速离心取上清,-70?冻存,用于 LDH的检测。 ?高活性样品:如果样品中含有较高活性的LDH,可以使用蒸馏水稀释。 ?(选做)样品准备完毕后可以用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度,以便于后续计 算单位蛋白重量组织或细胞内的LDH含量。 2、 制作标准曲线:用LDH Assay buffer准确稀释丙酮酸标准(5mmol/L)至0.5 mmol/L, 按下表制备标准曲线。 加入物 0 1 2 3 4 5 丙酮酸标准(0.5mmol/L)(μl) 0 12.5 25 50 75 100 北京雷根生物技术有限公司 www.leagene.com LDH Assay buffer(ml) 0.25 0.2375 0.225 0.2 0.175 0.15 蒸馏水(ml) 0.055 0.055 0.055 0.055 0.055 0.055 相当于LDH活力(金氏)单位(U) 0 125 250 500 750 100 3、 配制碱性显色工作液:取适量的碱性显色液,按碱性显色液:蒸馏水=1.5:1的比例混 合,即为碱性显色工作液。 4、 LDH酶促反应:按照下表设置对照管、标准管、测定管,溶液应按照顺序依次加入, 并注意避免产生气泡。如果样品中的酶活性过高,可以减少样品用量或适当稀释后再进 行测定。 加入物 对照管 标准管 测定管 LDH Assay buffer(μl) 25 — 25 待测样品(如血清等)(μl) 5 — 5 丙酮酸标准(0.5mmol/L)(μl) — 5 — 混匀,37?水浴15min。 NAD Buffer(μl) — 5 5 混匀,37?水浴15min。 二硝基苯肼溶液(μl) 25 25 25 NAD Buffer(μl) 5 — — 混匀,37?水浴15min。 碱性显色工作液(μl) 250 250 250 5、LDH检测:混匀,室温放置。酶标仪440nm处检测吸光度,以空白管调零,读取各管吸光度值。一般应数小时内检测完毕。以酶活力单位为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。以测定管不对照管吸光度值之差查标准曲线,求得酶活力单位(U)。 计算: 以标准管活力单位为横坐标,以吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线,用(A-A)之测定对照差值在标准曲线上查出待测样品的LDH酶活力单位。 注意事项: 1、 标本严禁溶血,也不采用草酸盐、EDTA抗凝血浆。 2、 提取出来的血清样本,不宜冰箱放置,应室温放置3天有效。 3、 比色应在5-15min内完成,否则吸光度值会下降。 4、 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。