肝移植受者服用FK506期间T淋巴细胞亚群-NK-CIK细胞的分析

肝移植受者服用FK506期间T淋巴细胞亚群-NK-CIK细胞的分析 肝移植受者服用FK506期间T淋巴细胞亚群\NK\CIK细胞的分析 [摘要] 目的 分析肝移植受者服用FK506期间外周血T淋巴细胞亚群、NK细胞及CIK 细胞的变化,探讨其在移植排异监测中的作用。方法 采用流式细胞仪(FCM)检测技术对17例 服用FK506的肝移植受者及25例健康对照者进行外周血的K506QIJIANT淋巴细胞亚群、NK 细胞及CIK细胞检测,然后以健康体检者为对照进行统计学分析。FK506血药浓度的测定采用 酶联免疫分析法测定。结果 肝移植受者术后3个月组的T淋巴细胞亚群CD3值高于健康对照 组(Tamhane T2法P=0.004),术后1个月组的T淋巴细胞亚群CD4值高于健康对照组(Tamhane T2法P=0.040),术后2周组、术后1个月组、术后3个月组的NK值均低于健康对照组(LSD-t 检验P?0.023),术后1个月组的CIK值低于健康对照组(Tamhane T2法P=0.005)。结论 肝 移植受者在服用FK506期间,外周血中T淋巴细胞亚群、NK细胞、CIK细胞可作为移植排异反 应的监测指标。当FK506血药浓度恒定时,可使T淋巴细胞亚群、NK细胞、CIK细胞的值保持 在正常水平。 [关键词] 肝移植; T淋巴细胞亚群; NK细胞; CIK细胞; FK506 [中图分类号] R657.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2010)01-01-03 Peripheral Blood T-lymphocyte Subsets,NK and CIK in Liver Transplant Recipients Taking FK506 QIN Wen HU Dachun TAN Jianling Department of Laboratory,Kunming Municipal First People’s Hospital,Kunming 650011,China [Abstract] ObjectiveTo analyze the changes of T-lymphocyte subsets,NK and CIK of the peripheral blood in liver transplant recipients during their taking of FK506,and to explore its function in monitoring allograft rejection. MethodsFlow cytometry(FCM)was used to determine the changes of the peripheral blood T-lymphocyte subsets,NK and CIK of 17 liver transplant recipients during their taking of FK506 and 25healthy controls. The blood concentration of FK506 was measured by enzyme immunoassay technique. ResultsThe CD3 value of the liver transplant group was higher at 3 months after liver transplant operation than that in healthy control group(Tamhane T2 method P=0.004),the CD4 value of the liver transplant group was higher at one month after that than that in healthy control group(Tamhane T2 law P=0.040),the NK mean value of the liver transplant group was lower at two weeks,a month and 3 months after liver transplant operation than that in the healthy control group(LSD-t test P?0.023),and the CIK of the liver transplant group was lower at one month after that than that in the healthy control group(Tamhane T2 method P=0.005). ConclusionThe T-lymphocyte subsets,NK and CIK of the peripheral blood in liver transplant recipients during their taking of FK506 can act as monitoring indicators of allograft rejection,and when the blood concentration of FK506 is constant,it will enable T-lymphocyte subsets,NK and CIK to maintain at normal levels. [Key words]Liver transplantation; T-lymphocyte subsets; NK; CIK; FK506 器官移植已经成为治疗终末期器官衰竭的有效手段,但移植排异反应是影响移植受者存活的重要原因。目前控制排异反应较为有效的手段是使用免疫抑制剂。他克莫司又名普乐可复(即FK506)[1],是一种具有强大免疫抑制作用的大环内酯类免疫抑制剂,它能抑制钙调神经磷酸酶(CN),使活化T细胞核因子(NFAT)及其他核因子不能脱磷酸而向细胞核内转位,从而阻断白细胞介素(IL-2)、肿瘤坏死因子a(TNF-a)等细胞因子的转录,抑制细胞因子的产生及T细胞的活化和增殖[2]。FK506现已成功应用于心脏、肝脏和肾脏等实体器官移植,尤使用于肝移植。但肝移植受者在服用FK506后的免疫细胞变化情况如何目前此方面的报道还不多。现即为对昆明市第一人民医院17例肝移植受者服用FK506后不同时期外周血中淋巴细胞亚群、NK细胞及CIK细胞的变化进行监测,旨在为临床监测移植排异反应的发生提供客观依据。 1 材料与方法 1.1 研究对象 接受FK506治疗的肝移植受者组,为2008年1月,2009年1月在昆明市第一人民医院接受同种异体肝移植的受者,共17例,其中男性15例,女性2例,年龄29,73岁,术后检验未发现明显的宿主抗移植物排斥反应或移植物抗宿主免疫反应的临床现。健康对照组为该医院的25例健康体检者,均无相关疾病,且未使用免疫抑制剂和相关免疫调节药物,其中男性11例,女性14例,年龄20,65岁。 1.2 仪器与试剂 仪器采用FC-500流式细胞仪及ASCENT全自动酶标仪。其中流式分析试剂1(CD45-FITC/CD4-PE/CD8-ECD/CD3-PC5)及试剂2(CD45-FITC/CD56-PE/CD19-ECD/CD3-PC5) 为Beckman- Culter公司产品。酶联免疫试剂为他克莫司定量检测试剂盒,产于美国Diasorin公司。 1.3 方法 采用流式细胞仪分析外周血中T细胞亚群、NK细胞及CIK细胞的变化。于肝移植受者术后2周、1个月、3个月分别抽取外周血2mL,用肝素抗凝。将试剂1、2分别加入到2根流式管的管底,各加10μL,再加入抗凝全血标本100μL,室温避光孵育20min,然后加入NH4CL溶血剂1mL,室温避光孵育20min,待流式细胞仪稳定后即可上机检测。其中试剂1标记的标本调用NEW-CD4-CD8-CD3-CD45进行检测,试剂2标记的标本则调用NEW-CD56-CD19-CD3-CD45 方案。读取结果时,CD3+细胞代表T细胞;CD3+/CD4+/CD8-代表TH细胞(CD4);CD3+/ CD4-/CD8+ 代表TS细胞(CD8);CD3-CD56+代表NK细胞;CD3+/ CD56+代表CIK细胞。FK506血药浓度的测定,取肝移植受者抗凝血2mL采用酶联免疫法进行检测分析。 1.4 统计学分析 采用SPSS13.0统计软件对数据进行统计描述和分析。正态分布的计量用“均数?标准差”(χ?s)表示;对完全随机设计的多组样本均数比较,采用单因素方差分析(One-way ANOVA);当各总体方差齐时,用LSD-t检验进 行多个样本均数的两两比较;当各总体方差不齐时,用Tamhane T2法进行多个样本均数的两两比较。 2 结果 17例肝移植受者服用FK506后不同时期及25例健康对照者外周血T淋巴细胞亚群、NK、CIK细胞及FK506血药浓度检测结果见表1。 表1可见,FK506血药浓度在不同时期的检测结果差异无统计学意义(F=2.676,P=0.090),CD4/CD8测定值在服用FK506后不同时期的检测结果差异无统计学意义(F=1.233,P=0.308),而CD3、CD4、CD8、NK、CIK测定值的差异均有统计学意义。经多个样本均数的两两比较,术后3个月组的CD3值高于健康对照组(Tamhane T2法P=0.004),术后1个月组的CD4值高于健康对照组(Tamhane T2法P=0.040),术后2周组、术后1个月组、术后3个月组的NK值均低于健康对照组(LSD-t检验P?0.023),术后1个月组的CIK值低于健康对照组(Tamhane T2法P=0.005)。其余两两之间的差异均无统计学意义(LSD-t检验或Tamhane T2法P>0.05)。 3 讨论 3.1 FK506的变化 FK506是日本藤泽公司从放线菌属筑波链真霉菌NO1993中提取的一种代谢药物,其化学结构属23元环大环内酯类免疫抑制剂。FK506不仅抑制TcR、CD3复合体介导的T细胞活化,也可抑制其他细胞表面分子的活化。其作用机制是FK506能抑制钙调神经磷酸酶(CN),使活化T细胞核因子(NFAT)及其他核因子不能脱磷酸而向细胞核内转位,从而阻断白细胞介素(IL-2)、肿瘤坏死因子a(TNF-a)等细胞因子的转录,抑制细胞因子的产生及T细胞的活化和增殖。从而使T细胞亚群的失衡得到明显改善,CD4+T细胞表达降低,CD8+T细胞表达回升,CD4/CD8比值降低,且均恢复到正常水平[3]。本文结果中显示FK506在术后各个阶段的差异无统计学意义,提示在监测T淋巴细胞亚群、NK及CIK细胞期间,肝移植受者血液中FK506的血药浓度保持相对稳定。 3.2 T淋巴细胞亚群的变化 T淋巴细胞是机体免疫系统内功能最重要的一大细胞群。其中CD4细胞是辅助T细胞,在免疫反应中是主要反应细胞,主要功能是通过其分泌的淋巴因子,增强和扩大免疫应答过程,辅助诱导其他免疫细胞如杀伤性T细胞、B细胞等共同发挥免疫作用。CD4细胞的减少可导致免疫功能低下。在移植免疫反应中,CD4+T细胞与移植排斥反应密切相关,已有资料[4]表明CD4+TH1细胞主要参与急性排斥反应,而CD4+TH2细胞则主要参与慢性排斥反应。CD8细胞是细胞毒T细胞,在移植排斥反应中除具有对靶细胞攻击杀伤的细胞毒作用外,同时对CD4细胞还具有调节性抑制作用,CD8细胞的降低可见于自身免疫性疾病或变态反应性疾病。而CD4/CD8比值是重要的免疫状态监测指标,其比例的降低与免疫系统损害的程度相关[5]。CD4/CD8比值升高提示机体免疫功能相对活跃,当监测器官移植排斥反应时,CD4/CD8比值升高预示可能发生排异反应[6]。T淋巴细胞在诱导肝移植术后排斥反应及诱导肝移植免疫耐受方面有着十分重要的作用。有研究[7]表明在急性排斥反应临床症状出现前1,5d,T细胞总数和CD4/CD8比值均升高。本文中结果显示,术后3个月组的CD3值与术后一个月组的CD4值高于健康对照组,且服药后不同时期的均值都较健康对照组有升高趋势,提示移植后在一定时间内机体对移植物可能存在一定的排异反应。但本研究中CD4/CD8比值的差异无统计学意义,只是在3个月时均值有少许减低,提示肝移植受者对移植物虽然有一定的排异作用,但免疫抑制剂的应用能使这种排异得到有效的控制,且保持相对稳定。再次证明T淋巴细胞亚群可作为较好的移植排异反应监测指标,但T淋巴细胞亚群对移植排异反应的临床价值还待加大样本量做进一步的研究。 3.3 NK细胞的变化 NK细胞是机体天然免疫的主要承担者,是获得性细胞免疫的核心调节细胞,同时也是造血的主要调控成分,在抗感染和抗肿瘤免疫过程中发挥着重要的作用。NK细胞在移植术后发生急性排斥反应时明显升高,其被触发的第一反应是迅速分泌大量的细胞因子(IFN-r、TNF-a 等),但由于免疫抑制剂FK506对细胞因子的阻断作用,进而影响了受者机体杀伤细胞的活性。本文结果显示,肝移植受者术后2周组、1个月组、3个月组的NK值均低于健康对照组,提示FK506治疗有效,减低了NK细胞的活性。且从表中可以看出不同时期的NK细胞值均减低,提示FK506对细胞因子的抑制作用可能较抑制T淋巴细胞亚群的活化和增殖作用更有效。但本文统计例数相对较少,FK506是否对NK细胞有更大的调节作用还待加大样本量进一步研究。 3.4 CIK细胞的变化 CIK细胞是一类非主要组织相容性复合物和非T细胞受体限制性的免疫活性细胞,其主要效应细胞为CD3+CD56+,具有NK细胞一样的杀瘤作用,且据报道CIK细胞在恶性肿瘤患者外周血中的高水平较NK细胞更明显,并且不受恶性肿瘤细胞类型的影响。本文结果提示,术后一个月组的CIK值低于健康对照组,其他组的均值也显示降低趋势,提示FK506可能同样对CIK发挥调节作用。目前,CIK主要应用于肿瘤患者的研究,至于在肝移植术后的变化及FK506是否对CIK具有调节作用还待今后通过做动物试验作进一步的研究。 [参考文献] [1] 李继芳,张翠欣,梁春慧. 他克莫司药物相互作用的新进展[J]. 肝胆外科杂志,2008,12(16):472-476. 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