油菜花粉黄酮类化合物抗氧化作用

油菜花粉黄酮类化合物抗氧化作用 江西农业大学生物工程系 毕业论文 论文题目:油菜花粉黄酮类化合物抗氧化作用 专 业: 生物技术 班级学号: 02(1)班 10022610 姓 名: 王丽云 指导老师: 庞会忠高级实验师 二OO六年五月 油菜花粉黄酮类化合物抗氧化作用 姓名:王丽云 专业:生物技术 班级:生技02(1)班 指导老师:庞会忠 (江西农业大学生物工程系，江西，南昌 330045) 摘要:黄酮是多羟基，多苯环的大分子有机化合物，具有多种生物活性功能，其中抗氧化作 用尤为明显。本文通过邻苯三酚自氧化法，水杨酸法比色法分别测定了油菜花粉黄酮类化合 物清除超氧阴离子自由基(O?)，羟基自由基(?OH)的效果，以及其对HO诱导的大222 鼠血红细胞溶血作用的影响这三组实验来研究它的抗氧化作用。结果明不同浓度的油菜花 粉黄酮类化合物能显著地清除超氧阴离子自由基和羟基自由基，抑制HO对红细胞模的破22 坏而引起的溶血。随着油菜花粉黄酮类化合物浓度的升高其抗氧化性作用逐渐增强。 关键词:油菜花粉 黄酮 抗氧化性 自由基 氧化损伤 The anti-oxidation of the Rape Pollen Flavonoids Wang Li-yun Supervisor: Associate Professor Pang Hui-zhong (Department of Bioengineering，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China) Abstract:Flavonoids are macromolecular organic compound that poly hydroxy-(?OH)，poly pheny-，have the live sexual function in various living creatures ， among them the antioxygenation is particularly for obvious.This text passes pyrogallol autoxidation method，the salicylic acid method colorimetry distinguishes to measure the super oxygen in clearance in flavonoid compound in rape pollen anion free radical (O?)，the result of the hydroxyl radical (?OH)。And the inhibition 2 induces the influence of the erythrocyte，red blood cell ，RBC hemolysis to the hydroxyl radical。The result expresses the Rape Pollen flavonoid compound of the different density can show the super oxygen in a clearance anion free radicals with the free radicals of hydroxyl radical (?OH)，repressing the HO to the breakage of the 22 red cell membrane but dissolve the blood cause .Go up along with the Rape Pollen flavonoid compound density ，its function of anti-oxidation will be strengthen gradually. Key words:the Rape Pollen flavonoids anti-oxidation free radical oxidation damage 1 0前言 油菜花别名菜籽、芸苔、菜苔，植物学上属于一年或二年生草本植物，十字花科，品种甚多。油菜花是由四枚花瓣，一枚雌蕊，四枚长雄蕊和两枚短雄蕊形 [1]成的小花朵，含有很丰富的花粉。 黄酮类化合物(Flavonoids)又称生物类黄酮(Bioflavonoid),一般能溶于水、稀乙醇、乙酸乙酯等极性溶剂中，难溶于乙醚、氯仿和苯。黄酮具有显著的抗氧化性能。黄酮类化合物具有消炎、改善微循环、抑菌、抗肝炎病毒、抗肿瘤等生理功能，有很高的药用价值。其抗氧化作用早已被人们所重视。有关这类报道也 [2][9]多见于报端。 1 材料与方法 1.1 原料与试剂 油菜花粉(由江西农业大学动科院养蜂所提供) SD大鼠血液(由江西省医学院实验动物中心提供) 邻苯三酚，FeSO?7HO, 水杨酸，盐酸，过氧化氢，无水乙醇，Tris，亚硝42 酸钠，硝酸铝，氢氧化钠，芦丁，乙醚等试剂均为市售国产分析纯。 1.2 仪器 数显恒温水浴锅(HH-2)，万分之一电子天平(type 1702)，721光栅分光光度计，TU-1800紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)，HZ-841树脂(上海华晨科技贸易公司)，索氏抽提器 1.3油菜花粉黄酮类化合物样品的制备 ,,,,,,38101.3.1油菜花粉黄酮类化合物的提取纯化方法 油菜花粉黄酮类化合物的提取:准确称取一定质量的花粉，用索氏抽提器(乙醚为抽提剂，45?水浴)脱脂及除去脂溶性色素。当乙醚抽提液为无色时挥尽花粉中乙醚，将花粉末放在烧瓶中，加入体积分数为70,乙醇，乙醇的体积约为花粉质量的十倍，浸提时间为4小时，温度为70-75?。过滤除去花粉末，得到油菜花粉黄酮提取物，简称为黄酮粗提液。 油菜花粉黄酮粗提液的纯化:采用HZ-841型大孔吸附树脂，黄酮粗提液上柱至接近饱和，用水洗至流出液为无色。采用70%酒精洗脱黄酮，50%水浴中用旋转蒸发器减压浓缩成较纯的油菜花粉黄酮类化合物浆状液。 1.3.2配制不同浓度的油菜花粉黄酮类化合物样品液 取适当的浆状液，先用10 ml 30,的乙醇稀释，再分别取该稀释液1.0ml、2.0ml、3.0ml 、4.0ml、5.0ml放入10ml试管中，用30,的乙醇稀释至刻度，作为不同浓度的油菜花粉黄酮类化合物的样品液，分别标示为样品1—样品5。 ,,,,,,3481.3.3 油菜花粉黄酮类化合物样品浓度测定 绘制标准曲线:称取0.0015g芦丁标样，溶解于15ml 30,的乙醇溶液中， 2 标准芦丁浓度为0.1mg/ml，分别取0 、 1.0 、 2.0、 3.0 、 4.0、 5.0ml放入10ml容量瓶中，各补加30%乙醇溶液使成5mL体积。加5% NaNO溶液0.3ml，2摇匀，静置6min，加10% AL(NO)溶液0.3ml ，摇匀，静置6min ，加1mol/L 33 NaOH溶液4.0 ml，再加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，静置15-20min 后, 于510nm波长处测定吸光度A。 油菜花粉黄酮类化合物样品含量的测定步骤:分别取5ml样品于—10mL试管中，依次加入5% NaNO 0.3mL，静置6min，加10% AL(NO) 0.3ml , 静置2336min，加1mol/L NaOH溶液4.0 ml，再加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，静置15-20min ， 同时以30% 乙醇代替样品液配制空白试剂。在510nm 波长处测定吸光度A。 ,,51.4油菜花粉黄酮类化合物对超氧阴离子自由基(O?)的抑制率2 1.4.1配制试剂 50mmol/L PH8.2 Tris-HCl 缓冲液的配制:准确称取6.057g Tris样品，用蒸馏水定容于500ml容量瓶中，即为0.1mol/L Tris溶液，取250 ml此Tris溶液，再取114.5ml 0.01mol/L HCl溶液混合，调PH值至8.2并定容至500ml即可。 3mmol/L邻苯三酚溶液的配制:准确称取0.3783g邻苯三酚，用0.01mol/L HCl溶液溶解定容至100ml，再取10ml此溶液定容至100ml即可。 1.4.2实验原理 利用某些体系在氧化过程中有超氧阴离子自由基(O?)的生成，O?与某22些化合物的作用，产生具有特定吸收的有色物质，利用分光光度计进行测定。受试物若能清除O?，则吸光度发生变化，可间接判断受试物对O?的抑制作用。22 邻苯三酚在碱性条件下迅速自氧化，自氧化过程中产生O?，O?又加速邻22苯三酚自氧化速率，同时产生有色中间物质，有色中间产物的积累在滞后30-45s与时间成良好的线性关系，一般维持4min左右，随后减慢 。有色中间产物在322nm有强烈的光吸收。由于自氧化的速率依赖于O?的浓度，消除O?则抑制22自氧化反应，阻止中间产物的积累，从而评价受试物抑制O?的能力。2 1.4.3具体操作 邻苯三酚自氧化速率的测定:取4.5ml 50mmol/L Tris-HCl缓冲溶液(PH8.2)，4.2 ml蒸馏水混匀后在25?水浴中保温20min，取出后立即加入在25?预热过的3 mmol/L邻苯三酚0.3ml，迅速摇匀后倒入比色杯，325nm下每隔30s测定吸光度，计算线性范围内每分钟内吸光度的增加，以10 mmol/L HCl溶液配制空白管作为对照，记录结果如表3。 加入油菜花粉黄酮类化合物后邻苯三酚自氧化速率的测定:按照上述步骤在加入邻苯三酚前先分别加入0.1ml不同浓度的样品液，蒸馏水减少。同样以10 mmol/LHCl溶液配制空白管作为对照。测定吸光度，结果如表4。 1.4.4 计算抑制率 抑制率(,),(?A/?t - ?A/?t)/?A/?t*100% 121 式中: ?A/?t——邻苯三酚自氧化时反应速率; 1 3 ? A/?t——加入样品液后邻苯三酚自氧化时反应速率2 ,,61.5 油菜花粉黄酮类化合物对?OH的抑制率 1.5.1 配制试剂 0.15mol/LFeSO的配制:准确称取4.1703g FeSO，用蒸馏水溶解定容至44100ml。 6mmol/LHO的配制:准确称取2.0406g HO，先用蒸馏水稀释至100ml，2222 再吸取1ml该稀释液用蒸馏水稀释100倍，则为6mmol/L HO。22 2mmol/L水杨酸钠的配制:准确称取0.0276g水杨酸钠试剂，用无水乙醇定容至100ml。 ,,61.5.2 实验原理 按Smirnoff方法改进，用FeSO+ HO产生?OH。以?OH氧化水杨酸钠所422 得产物的吸光值表示?OH的多少，吸光度越大则?OH越多。 ,,61.5.3具体操作 4ml反应液中含0.15mol/L FeSO 1ml，6mmol/L HO1ml，2mmol/L水杨酸422钠1ml，不同浓度的油菜花粉黄酮类化合物1ml，最后加入HO启动反应。37?22反应1h，测定510nm处的吸光值。吸光值越大，则清除?OH效果越好。按下式计算抑制率: 抑制率(,),[A0-(Ai-A0i)]/A0 *100% 式中:A0——用蒸馏水代替样品的对照值; Ai——加样后的吸光度; A0i——样品本身的本底值 ,,71.6 油菜花粉黄酮类化合物对HO诱导血红细胞溶血的抑制作用22 1.6.1 配制试剂 100mmol/L HO的配制:称取0.34g HO置于100mL容量瓶中定容至刻度2222 即可。 1.6.2 实验原理 2+利用HO与Fe结合产生羟基自由基(?OH)引发氧化作用，使红细胞膜22 损伤，物质外流，HO自身也可引发氧化反应，加入油菜花粉黄酮类化合物可22 抑制氧化损伤，保护红细胞膜。 1.6.3 具体操作 SD大鼠颈动脉插管取血，肝素抗凝，3000r/min离红细胞。冰冷生理盐水洗3次，制成0.5%悬浮液。 不同浓度的油菜花粉黄酮类化合物样品液的配制:参照前述1.3.2步骤配制不同浓度的油菜花粉黄酮类化合物样品液5份，标号为样品I—样品V，并计算 4 得浓度分别为101.49、213.91、350.87、407.64、579.83µg/ml 取红细胞悬液1ml，加入不同浓度的油菜花粉黄酮类化合物样品液200µl，最后加200µl 100mmol/L HO混匀启动反应。37?作用1h，用生理盐水稀释622 倍，3000r/min离心5min。取上层清液于415nm处测吸光度，计算抑制率和溶血度: 抑制率(%)=(Ah-Ai)/(Ah-A0)*100%,溶血度=Ai/Ah 式中:A0——对照组的吸光度; Ai——加样品组的吸光度; Ah——加HO诱导组的吸光度 22 2 结果与分析 2.1 芦丁标准曲线的制作见表1和图一 表1 芦丁标样的吸光度 芦丁浓度 (µg /ml) 0 10 20 30 40 50 吸光度A 0.000 0.213 0.315 0.505 0.685 0.813 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4吸光度A0.3 0.2 0.1 0 0102030405060 芦丁浓度(ug/ml) 图一 芦丁标准曲线 实验所得标准曲线回归方程为C=61.35A-0.8812, 式中C为浓度(µg/ml),A为 2吸光度,相关系数R=0.9941. 2.2油菜花粉黄酮类化合物样品浓度测定结果 根据实验所得标准曲线回归方程为C=61.35A-0.8812,(式中C为浓度(µg/ml), A为吸光度)，计算样品液浓度，结果如表2: 表2 所配样品溶液的吸光度及浓度 样品号 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 吸光度A 0.134 0.246 0.429 0.493 0.604 5 浓度(µg/ml) 7.34 14.2 25.4 29.4 36.2 -2.3 油菜花粉黄酮类化合物对超氧阴离子自由基(O)抑制作用的效果2 每隔30s所测邻苯三酚自氧化的吸光度结果如表3: 表3 每隔30s所测邻苯三酚自氧化的吸光度 时间T(s) 0 30 60 90 120 150 180 吸光度A0.164 0.263 0.336 0.396 0.441 0.481 0.512 1 -4 由表3得邻苯三酚自氧化速率ΔA/Δt=19.33×101 每隔30s所测加入油菜花粉黄酮类化合物后邻苯三酚自氧化的吸光度结果如表4: 表4 每隔30s所测加入油菜花粉黄酮类化合物后邻苯三酚自氧化的吸光度 吸 时 30s 0s 60s 90s 120s 150s 180s 光 间 度 T A 样品 0.0 0.087 0.157 0.197 0.229 0.251 0.267 样品1 0.0 0.127 0.190 0.239 0.271 0.299 0.303 样品2 0.0 0.146 0.203 0.248 0.279 0.306 0.320 样品3 0.0 0.170 0.228 0.271 0.302 0.326 0.343 样品4 0.0 0.198 0.257 0.298 0.331 0.354 0.370 样品5 -油菜花粉提取液对超氧阴离子自由基(O )的抑制率:根据公式抑制率(%)2 =(ΔA/Δt-ΔA/Δt)ΔA/Δt*100% 121 -计算油菜花粉提取液对超氧阴离子自由基(O )的抑制率，所得结果见表2 5和图二: -表5油菜花粉提取液对超氧阴离子自由基(O )的抑制率 2 样品号 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品浓度(µg/ml) 7.34 14.2 25.4 29.4 36.2 -4ΔA/Δt(*10) 19.31 18.67 16.82 16.47 15.83 2 抑制率(%) 0.082 3.44 12.96 14.82 18.10 6 20 18 16 14 12 10 8抑制率(%) 6 4 2 0 0510152025303540 黄酮浓度(ug/ml) 加入油菜花粉黄酮后邻苯三酚的自氧化速率与黄酮浓度的关系图二 从表5和图二结果表明:在此体系中，邻苯三酚的自氧化速率较快，在加入油，，菜花粉黄酮类化合物样品液后，由于黄酮类化合物有活泼的3，4位酚羟基，能提供活泼的氢，从而阻断自由基反应。因此抗氧化是通过供氢来完成清除,5,-O的反应。且根据表5和图二可知，加入黄酮类化合物浓度越高，抑制作2 用越明显。当黄酮类化合物浓度为7.34µg/ml时，抑制率较微弱，为0.082%，而当浓度增大为36.2µg/ml时，抑制率则增至18.10%。 2.4 油菜花粉黄酮类化合物对?OH抑制作用的效果 根据公式抑制率(%)=[A-(A- Ai)]/ A*100%计算抑制率，其中Ao,0.8480i00 所得结果如表6和图三: 表6 油菜花粉黄酮类化合物对?OH抑制率 样品号 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品浓度 (µg/ml) 7.34 14.2 25.4 29.4 36.2 A 0.677 0.744 0.794 0.966 0.967 i Ai 0.010 0.091 0.184 0.361 0.401 0 A-Ai 0.667 0.653 0.610 0.605 0.566 i0 抑制率(%) 21.53 23.04 28.06 28.67 33.27 7 35 30 25 20 15 抑制率(%) 10 5 0 010203040 黄酮浓度(ug/ml) 油菜花粉黄酮类化合物抑制?OH的抑制率与黄酮浓度的关系图三 从表6和图三结果表明:油菜花粉黄酮类化合物对羟基自由基也有抑制作用， 且抑制率是随着黄酮浓度的增大而增大的。当浓度为7.34µg/ml时，抑制率为 21.53,，当浓度为36.2µg/ml时，抑制率则增至33.27,。 2.5油菜花粉黄酮类化合物对HO诱导血红细胞溶血的抑制作用的效果 22 根据公式抑制率(,),(Ah-Ai)/(Ah-A0)*100%,溶血度=Ai/Ah，计算溶 血度和抑制率，结果如表7和图四: 表7 油菜花粉黄酮类化合物对HO诱导血红细胞溶血的抑制率及溶血度22 实验组 样品浓度(µg/ml) A415nm 溶血度 (%) 抑制率(,) 101.49 1.234 94.05 43.58 HO+样品I 22 213.91 1.203 91.69 60.89 HO+样品II 22 350.87 1.198 91.31 63.69 HO+样品III 22 407.64 1.166 88.87 81.56 HO+样品IV 22 579.83 1.149 87.58 91.06 HO+样品V 22 0 80.35 对照组 (A)1.133 0 0 100 诱导组 (A)1.312 h 8 100 80 溶血度(%)60抑制率(%) 40 20 溶血度(%) 抑制率(%) 0 0100200300400500600700 黄酮浓度(ug/ml) 图四 油菜花粉黄酮浓度与溶血度和抑制率的关系 从表7和图四的结果表明:油菜花粉黄酮类化合物对红细胞溶血现象有抑制作用。抑制率随着黄酮浓度的增大而增大，当油菜花粉黄酮类化合物浓度为 µg/ml时，抑制率为43.58%，当浓度为579.83µg/ml时则增至91.06%。101.49 与之相应的溶血度则是随着油菜花粉黄酮类化合物浓度的增大而减小，当其浓度为101.49µg/ml时，溶血度为94.05%，当浓度为579.83µg/ml时减至87.58% 3小结与小论 油菜花易生长，营养价值高,对它的医疗保健作用的研究已有不少。近代，随着人们的生活水平的提高，人类对保健越来越重视，而黄酮类化合物由于其独特的保健功能而倍受人们的关注。 黄酮类化合物是存在于自然界的一大类化合物，在食品和医药工业上有广泛的应用。作为一种功效成分具有增强心血管功能，抗肿瘤，增强免疫力，延缓衰老以及治疗慢性前列腺炎等作用。在国外，近来对黄酮类化合物的研究开发十分活跃，在国内保健品市场中也相应的开发了银杏黄酮，山楂黄酮，茶叶黄酮等诸[4]多产品。 本文基于这两大背景，对油菜花粉黄酮类化合物的抗氧化性进行了三方面的 -研究。研究结果表明:油菜花粉黄酮类化合物对清除超氧阴离子自由基O,抑2制?OH和抑制HO诱导的血红细胞溶血都有明显的效果。从图二至图四的曲22 线走势我们可以看出:与油菜花粉黄酮类化合物对清除超氧阴离子自由基和抑制HO诱导的血红细胞溶血作用效果比较起来，它抑制?OH的作用效果就不那么22 明显了。 由本实验我们可以得到初步结论:油菜花粉黄酮类化合物具有抗氧化性，可成为衰老保健品辅料或功能因子。但其成分多样，结构复杂，进一步的纯化和构效关系研究需进行。 9 参考文献 [1]冯志舟.油菜花及其药用价值.[J]云南林业，2003，24(5):-23-23 [2]毛莉娟，刘学文，冉旭.苦丁茶中黄酮的提取工艺[J].食品技术，2002，11:18,21 [3]陈乃富.蕨菜黄酮类化合物的提取及抗氧化作用[J].食品与发酵工业，2003，29(11):63,66 [4]肖诗明，李勇，张忠等。苦荞麦叶中黄酮的提取工艺研究[J].西昌农业高等专科学校学报，2003，17(4):16,18 [5]赵二劳，张海容，盖青青等。沙棘黄酮的测定及其抗氧化作用[J]。化学研究与应用，2003，15(2):284,285 [6] 汪海波，刘大川，佘珠化等。大豆异黄酮类物质的提取、抗氧化性及稳定性研究[J].食品科学，2004，25(1):111,114 [7]王建华，张民，张声华。枸杞多糖组分对羟基自由基所致损伤的作用[J].营养学报，2001，23(3):279,281 [8]裴凌鹏，张帅，李文卅等。葛根黄酮的提取和抗氧化性研究[J].北京联合大学学报(自然科学版)，2003，17(3):78,81 [9]蓝航莲，孙树霞。柑橘类黄酮的生理活性研究进展[J].中国食物与营养，2003，2:44,66 [10]杨胜远，梁智群。银杏叶总黄酮提取纯化工艺的研究[J].食品科学，1998，19(2):24,25 致 谢 (Acknowledgment) 本论文从选题，，实施到论文撰写和修改都是在庞会忠老师的悉心指导下完成的。在实验期间，庞老师不仅传授给我专业知识，实验技能，还教给我做人的道理和给我生活上的关心和照顾，在此向他表示我最忠心的感谢～ 论文的实验工作主要是在江西农业大学生物工程系实验室完成，我在此要感谢全体生物 10 工程系的老师们，他们为我在实验室做实验提供了很大的方便，同时要感谢生物工程系各位领导的培养和关心～ 最后感谢动科院提供实验材料～ 11