膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价

膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 第一章 前 言 1.1 膀胱肿瘤及其治疗现状 [1][2]膀胱癌是泌尿系统较常见的肿瘤之一，其发病率呈逐年上升趋势。世界范围内，膀胱癌发病率居恶性肿瘤的第九位，在男性排名第六位，女性排在第十位左右。2008年我国膀胱癌发病率男性为3.8,10万，女性为1.4,10万。 1.1.1 膀胱肿瘤的两种类型及来源 膀胱肿瘤最主要的特点是有两种完全不同的肿瘤类型:乳头状非浸润性(表浅性)和扁平状肌肉浸润性膀胱癌，其来源、形成的分子机制、治疗和愈后都截然不同。非浸润性膀胱癌的发病率约占70%左右，由于其增殖能力有限，所以推断其主要来自于间质细胞的突变，和其他乳头状泌尿上皮肿瘤一样，存在 [3]成纤维细胞生长受体(FGFR)基因的突变。约有15%的非浸润性肿瘤可发3 [4]展为浸润性。肌肉浸润性膀胱肿瘤的发病率约为30%，这些肿瘤具有很强的增殖能力，大都与P53和Rb基因的失活有关，而与FGFR无关，常常导致远3 处转移，预后不好，复发率较高。如图1.1。 图1.1 膀胱肿瘤的两种类型及发病率 注:非肌肉浸润性膀胱肿瘤的发病率约占膀胱肿瘤的70%，其中约有15%会发展为肌肉浸润性膀胱癌;膀胱肿瘤中约30%一开始就表现为原位癌，逐渐发展为肌肉浸润性膀胱癌，最终导致远处转移。 1.1.2 膀胱肿瘤的治疗现状及存在的问题 外科手术是治疗局限期膀胱癌的主要方式，表浅性(非肌层浸润性)膀胱癌首选经尿道膀胱肿瘤切除术(transurethral resection of bladder tumor，TURBT)治疗，并根据具体的肿瘤分期和病理分级，术后采用不同的膀胱腔内灌注化疗、 1 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 放疗或免疫治疗等辅助。肌层浸润性膀胱癌首选根治性膀胱切除术，术前术后可选择性的采用全身化疗，提高疗效。对于部分无法行根治手术或有保留膀胱意愿的浸润性膀胱癌患者，可采用腔内手术，放疗以及全身化疗的保留膀胱综合治疗方案。对于转移性膀胱癌(含淋巴结转移)，全身化疗是唯一能延长患者生存的，手术、放疗或动脉介入治疗等仅起到止血、止痛等姑息性效果，以提高患者生活质量。对于非肌层浸润性膀胱癌来说，初次经尿道膀胱肿瘤电切术后5年内复发率高达50%-70%。临床治疗膀胱癌，尤其是肌肉浸润性膀胱癌，对许多化疗药物耐药，对放疗有抵抗作用，复发率高。因此研发针对膀胱癌的新的治疗手段和药物显得十分迫切。目前，有研究表明为了减少膀胱癌的复发，同时利用膀胱与体外相通的特点，将手术治疗、放化疗和膀胱内灌注溶瘤腺病毒治疗相结合，是一种很有前景的治疗策略。 1.2 基因治疗及溶瘤腺病毒 在过去二十年中，基因治疗和基因治疗药物，或溶瘤病毒的研究成为了肿 [6]瘤治疗的热点。溶瘤病毒通过感染的方式进入肿瘤细胞，对肿瘤细胞有细胞杀伤作用，却不服从于传统的药物抵抗机制，如药物流出泵和凋亡信号通路等。溶瘤病毒还可通过基因工程的方法表达特异性针对肿瘤细胞自我更新和细胞分裂的基因，从而更有效杀伤肿瘤细胞。溶瘤病毒还可引发机体抗肿瘤的免疫反应，并与其他传统治疗方法如放疗、化疗具有协同作用。另外，研究表明溶瘤 [7]病毒还可以杀伤肿瘤干细胞，从而防止肿瘤的复发和转移。因此基因治疗肿瘤是一种很有前景的治疗策略。 1.2.1 溶瘤病毒治疗肿瘤的历史与进展 病毒用于治疗癌症已经发展了一百多年。20世纪初人们发现一些癌症患者在合并病毒感染后可以在某种程度上抑制肿瘤的生长。于是科学家们用减毒的 [8]狂犬病病毒、牛痘病毒和麻疹病毒等对各种类型的癌症患者进行了一些抗癌试验。虽然当时观察到了一些疗效，但对于病毒的作用以及癌症的本质都知之甚少。在过去的十年中，随着分子生物学和病毒学的进步，人们逐渐发现病毒 [9]和致癌物质的作用机理上存在惊人的相似之处。因此，基因治疗和基因治疗 [6]药物，以及溶瘤病毒逐渐成为肿瘤治疗的研究热点。 一个病毒颗粒是由DNA或RNA的遗传物质、以及被称为衣壳的蛋白质保护外壳组成，有些病毒也有独特的脂质衣壳层。病毒不能自我复制，他们通过感染宿主细胞并利用宿主的复制原料产生新的病毒颗粒，然后病毒裂解，同时 2 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 导致宿主细胞死亡。这些特质使得开发病毒作为针对肿瘤细胞的溶瘤药物成为可能。目前应用于治疗肿瘤的溶瘤病毒可大致分为三类:第一类为动物野生型病毒，这些病毒往往不能感染人类正常细胞，但却对人类肿瘤细胞具有细胞毒性;第二类为减毒变异的人类病毒，其中与病毒复制密切相关，而对肿瘤细胞作用无关的基因被删除或突变;第三类病毒通过培养传代而稀释减毒，如一些活的病毒疫苗。这些病毒对恶性肿瘤组织有杀伤效应，而对正常组织和细胞基本无毒性作用，因而具有广阔的应用前景。已有一些溶瘤病毒在临床前研究中证实对多种肿瘤都有一定杀伤作用，并且部分已进入临床实验阶段。一些新的病毒传递方式，如以细胞为载体的方案，使得病毒可以到达远处的转移病灶， [10]从而克服了溶瘤病毒只能针对原发病灶的局限性。溶瘤病毒的另一优势是还可通过基因工程的方法在溶瘤病毒内导入治疗肿瘤的基因，从而增加溶瘤病毒的抗肿瘤作用。例如一些DNA病毒，包括腺病毒、单纯疱疹病毒和牛痘病毒等，由于具有较强的溶瘤作用，对其基因组的了解也比较充分，因此成为基因工程中使用很广泛的溶瘤病毒。 1.2.2 腺病毒载体 [9, 11]腺病毒是一类较常用的基因治疗载体，因为其能够感染所有上皮细胞，可插入较大容量的外源基因且能够高水平表达，对处于分裂期的细胞和非分裂期的细胞均可感染且相对稳定，能够高滴度地有效增殖，最重要的是腺病毒载体对人具有较低的致病性，应用于人体细胞时病毒基因组发生重排的机率较低，而且不会整合到人体基因组中，从而降低了突变的风险。此外，腺病毒介导的 [12]基因治疗用于治疗癌症的临床试验也显示较为安全，通常只出现较轻微的上呼吸道、眼睛的炎症或胃肠炎。据报道目前已有51个血清型的人体腺病毒被鉴定成功，且被划分为A、B、C、D、E、F六个亚属，这些亚属的基因组结构不尽相同，在对啮齿类动物的致瘤性和血液凝固反应等方面也不相同。目前应用最广泛的腺病毒载体大多是在Ad2和Ad5的基础上利用基因工程的方法构建的，他们属于人类腺病毒的C亚群。 腺病毒是一种基因组长约36kb、具有呈规则20面体结构的衣壳(capsid) [13]且无外壳的DNA双链病毒。衣壳的组成包括六联体(hexon，约240个)、五联体(penton，约12个)、纤毛(fiber，12根)，和其他一些小的蛋白质分子。构成病毒衣壳20面体结构的主要蛋白是六联体，而12根纤毛以五联体为基底由衣壳表面向外伸出，从而在纤毛顶端形成病毒的头节区(knob)。头节区在病毒感染细胞的过程中发挥非常重要的作用，因为其可与细胞表面的相应病毒受体结合，从而使腺病毒进入细胞。 3 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 在上皮细胞的表面存在一种特异性受体(柯萨奇/腺病毒受体，CAR，coxsackie/adenovirus receptor)，这种受体可与腺病毒的knob区域结合，从而使腺病毒感染进入细胞。腺病毒的头节区与CAR粘附后，其五联体表面由精氨酸、甘氨酸、天门冬氨酸组成的三肽结构(Arg-Gly-Asp,RGD)与细胞表面的整合素αvβ及αvβ相结合，并通过胞吞作用使腺病毒感染入细胞并进入细胞的35 溶酶体内。虽然溶酶体呈酸性，但衣壳构象发生变化的腺病毒不会被消化而是被溶酶体释放出来。接着，腺病毒颗粒转移到细胞核，通过核孔将病毒的DNA释放入细胞核内，并在细胞核内进行一系列复杂且有序的剪切和转录反应，从而使病毒进行复制且最终形成有感染能力的病毒颗粒，并导致宿主细胞裂解和病毒释放，而释放出的病毒又可以继续感染其他宿主细胞，继续发挥细胞杀伤 [14]作用。 1.2.3 溶瘤腺病毒 溶瘤腺病毒(Oncolytic adenovirus)是在腺病毒载体的基础上，用基因工程的方法构建的特异性针对肿瘤细胞的腺病毒。溶瘤腺病毒在肿瘤细胞内复制并最终导致细胞裂解，新复制的病毒颗粒可以在瘤内扩散，也可散布至肿瘤的远处转移部位。溶瘤腺病毒导致的细胞死亡是一种免疫原性的反应现象，因此可以促进肿瘤细胞的免疫识别。 根据目前研究的溶瘤腺病毒的构建策略，可将溶瘤腺病毒分为两个亚群。第一类溶瘤腺病毒是基因组内包含部分基因的功能缺失，这部分缺失由肿瘤细胞的变异来补偿。这种缺失主要针对腺病毒的早期复制基因(E1A或E1B)，从而导致相应蛋白的缺失或变异，这些蛋白就不会与诱导非肿瘤细胞内病毒复制的宿主细胞蛋白结合。然而在肿瘤细胞内，由于其自身某些蛋白的变异或缺陷，溶瘤腺病毒则可以正常复制。例如，溶瘤腺病毒Ad5-?24就是在E1A基 [15]因的恒定区2(CR2)包含一个24-bp的缺失，由此导致蛋白不能结合至Rb蛋白(retinoblastoma，视网膜母细胞瘤蛋白)，使细胞不能进入S期。因此，Ad5-?24减少了正常细胞克服G-S期检查点的能力，使病毒在正常细胞内不1 [17][16]能复制，而只能在p16/Rb通路缺陷的肿瘤细胞内复制。另外，Wang等将E1A基因区域中能够与Rb结合的8个碱基进行突变，构建了组织特异性溶瘤腺病毒dl 922-947。研究表明dl 922-947对膀胱癌细胞有一定杀伤作用，而对正常细胞没有杀伤作用。已经有研究报道在所有的人类肿瘤中都存在Rb通路的 [18]缺陷，因此这些病毒也许对许多肿瘤类型都可用。p53基因可阻止正常细胞进入S期，而腺病毒E1B区域中的 E1B-55蛋白可与p53结合而使之失活。在 [19, 20]许多肿瘤中都存在p53基因的突变，因此Hsieh等构建了E1B-55缺失的溶 4 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 瘤腺病毒AdWS，从而使这种腺病毒只能在肿瘤细胞中复制，而在正常细胞51 [17]中不表达。Wang等还构建了E1A基因突变和E1B-55缺失同时存在的溶瘤腺病毒AxdAdB-3，并证明了其对于肿瘤细胞具有更强的杀伤作用，对于正常细胞也更为安全。 第二类溶瘤病毒是通过在腺病毒基因组内插入肿瘤组织特异性的启动子[21][22]，从而使得病毒只在表达启动子特异性转录因子的肿瘤细胞内复制。肿瘤 [23]组织特异性的启动子通常用来控制E1A基因的表达，也可用来调节其他的早期转录基因。目前已用于构建溶瘤腺病毒的启动子有:肝素结合细胞因子 [24][25](midkine，MK) ，环氧化酶2(cyclooxyge-nase 2，Cox-2)，骨唾液蛋白 [26][27, 28](bone sialo-protein，BSP)，尿路上皮蛋白(uroplakins，UPs) ，人端粒 [29]酶反转录酶(human telomerasereverse transcriptase，hTERT) ，Oct-3/4反应元件 (Oct-3/4 response element，ORE)结合微小巨细胞病毒 (cytomegalovirus, [30-32]CMVmini)的启动子， E2启动子结合因子1(E2 promoter binding factor1，E2F-1)结合粒细胞-巨噬细胞-集落刺激因子(granulocyte-macrophage [33]colony-stimulating factor，GM-CSF)的启动子，缺氧启动子1(hypoxia inducible [34, 35]factor-1，HIF-1) 等。 今后提高病毒复制特异性的方法可以将以上两种病毒构建方法结合起来[36]，既通过复杂多样的作用机制提高病毒的特异性，又通过一些病毒衣壳的改造措施提高靶细胞的感染效率。 1.2.4 溶瘤腺病毒可靶向杀伤肿瘤干细胞 近几年的研究表明肿瘤的复发或许与肿瘤干细胞(Cancer Stem Cells，CSCs)或肿瘤起始细胞(Cancer-initiating Cells,CICs)的存在有关。研究表明肿瘤干细胞，或肿瘤起始细胞能够逃脱传统的治疗策略，如化疗，放疗，激素 [37]治疗和单克隆抗体疗法等，因此成为难治性的细胞克隆群体。肿瘤组织与正常组织的细胞群体一样，由处于不同层次的分化细胞组成，即静止干细胞、增殖的短暂复制细胞、分化细胞和终分化细胞。根据肿瘤干细胞的假说，分化细胞和终分化细胞或许与恶性肿瘤的进展和对药物的抵抗没有密切关系。研究表 [37, 38]明对放疗和化疗有显著抵抗作用的是肿瘤的静止干细胞群。目前研究已经表明肿瘤干细胞对放疗和化疗抵抗的作用机理有以下几个方面:第一，肿瘤干细胞在放射线照射时可以激活DNA检查点，从而比其他肿瘤细胞更加有效地 [39]修复放射线导致的DNA损伤，使得这些细胞不容易凋亡。第二，某些已鉴定的肿瘤干细胞高表达对化疗和放疗抵抗的基因，如多药抵抗基因MDR(Multiple Drug Resistance)，还有一些干细胞表达高水平的抗凋亡蛋白(如Bcl-2 5 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 和Bcl-xL)，从而使得肿瘤细胞能够抵抗放疗和化疗诱导的凋亡。第三，一些干细胞表达高水平的多药转运蛋白，如ABC转运蛋白，尤其是ABCG2家族成员，可有效驱除抗肿瘤药物，将细胞毒性的药物排出细胞外。一些脂溶性的荧光染料标记物如Hoechst33342也可被肿瘤干细胞中的多药转运蛋白清除，因此常利用此特性从细胞群体中鉴定肿瘤干细胞。第四，研究发现一些肿瘤干细胞高表达一些酶类如醛脱氢酶(ALDH1)，可中和毒性药物、药物的代谢产物、副产物如氧化剂或自由基，使得化疗抵抗。第五，由于放疗引起的氧自由基介导的DNA损伤主要影响复制中的细胞，同样化疗药物的作用机制是整合入复制中的DNA或抑制DNA复制所需的分子，而干细胞的循环非常缓慢，因此对化疗和放疗并不敏感。 然而，目前现有的许多治疗方法都主要针对肿瘤组织中的分化细胞和终分化细胞群，例如很多化疗药物和放疗方法都针对快速增殖的细胞，激素疗法和小分子抗体常常是一些细胞生长抑制剂，即阻止肿瘤细胞进入细胞循环周期。这些治疗方法对于潜在的肿瘤干细胞基本无效，虽然能暂时减小肿瘤的体积，仍然导致很高的复发率和致死率，如图1.2。 由于化疗、放疗或其他一些传统的治疗方法对肿瘤的治疗存在一定局限性，因此探索新的治疗策略，尤其是能够针对肿瘤干细胞而不是分化细胞的治疗方法就显得非常重要。溶瘤腺病毒介导的基因治疗不仅对分化细胞有作用，对肿 [9]瘤干细胞也有一定杀伤作用，同时还可提高肿瘤对放疗和化疗的敏感性。因此，溶瘤腺病毒对于目前一些难治的肿瘤和复发率较高的肿瘤(如膀胱癌)具有重大意义。 [40, 41]溶瘤病毒或许可以成为靶向治疗肿瘤干细胞的理想策略是因为:(1)溶瘤病毒具有杀伤肿瘤细胞的能力;(2)溶瘤病毒的杀伤机制是通过病毒复制，导致细胞裂解，因此不受肿瘤干细胞对化疗药物和放疗抵抗机制的制约，如上调ABC转运蛋白和抑制凋亡信号转导通路等;(3)溶瘤病毒可针对肿瘤干细 [42]胞自我更新和分化所必需的基因，通过基因工程的方法实现靶向治疗。 6 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 图1.2 针对肿瘤干细胞和分化细胞的不同治疗策略 注:前者为传统的治疗方法，仅杀伤分化细胞，使得肿瘤体积缩小，但由于肿瘤干细胞的存在使得肿瘤复发，后者杀伤肿瘤干细胞，肿瘤失去再生的能力，从而达到治愈的效果。 1.3 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒膀胱内灌注及联合治疗的优势 溶瘤腺病毒治疗肿瘤必须考虑的问题之一就是给药途径。膀胱直接与体外相通，因此溶瘤腺病毒可通过导尿管直接注入膀胱，进行膀胱内灌注，这种给药途径方便、简单而且无痛苦。此外，膀胱内灌注可避免病毒的全身播散及静脉注射带来的副反应，也排除了免疫反应的困扰。病毒膀胱内灌注可使肿瘤组织直接暴露在高滴度的病毒中，大大提高病毒的感染效率，也会相应增强病毒 [43][44][45]的溶瘤作用。溶瘤腺病毒瘤内注射、腹腔内注射、动脉内注射、静脉内 [46]注射治疗固体肿瘤的临床试验已有大量报道，研究表明肿瘤内注射的疗效明显优于全身给药，全身给药到达靶器官的病毒数量少，而且病毒全身投药会产 [47]生免疫反应从而降低病毒滴度。因此利用溶瘤腺病毒进行膀胱内灌注或瘤内注射是一种很有前景的治疗策略。同时，膀胱内灌注也可与手术治疗、化疗或放疗相结合，可望改善化疗耐药、放疗耐受，提高膀胱癌的治疗效果，减少复 [48]发和远处转移，这种联合治疗的策略将是膀胱癌根治的一把希望之剑。 1.4 溶瘤腺病毒的生物性分布和安全性评价 7 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 溶瘤腺病毒与其他新药一样，要想在临床中得到广泛应用，除了肯定的药效以外，还必须获得其在体内的生物性分布及其安全性评价的数据。近几年关于溶瘤病毒安全性评价的研究发现用于头颈部肿瘤、卵巢肿瘤和前列腺肿瘤的 [49]溶瘤腺病毒的毒性都较小，有一些溶瘤病毒载体已经完成动物体内的安全性 [50-57]评价进入临床实验阶段。 [58]首个进入临床试验阶段的溶瘤腺病毒是ONYX-015，它是针对p53通路的E1B-55KD缺失的溶瘤腺病毒，在脑部肿瘤的多中心性临床研究中， [59]ONYX-015显示出很好的安全性，虽然抗肿瘤效果不明显，但与化疗联合的作用却十分肯定。至2002年共有250位肿瘤患者接受ONYX-015治疗(?-?期临床试验)，肿瘤类型包括头颈部恶性肿瘤、胰腺癌、卵巢癌、大肠癌肝转移等。单独应用ONYX-015治疗肿瘤完全缓解率约为14%，约有40%-80%患者 [43, 60-62]的肿瘤处于稳定状态。令人感兴趣的是ONYX-015与化疗药物(如顺铂、5-Fu等)联合应用时具有明显的协同效应。迄今疗效最好的临床试验结果便是 -Fu治疗晚期头颈部肿瘤，肿瘤缓解率可达同时应用ONYX-015和顺铂以及5 63%，其中27%完全缓解，而且其他患者的病情在治疗期间都未出现进一步恶[43]化。 [63]Burke 等首次将表达GM-CSF的溶瘤腺病毒(CG0070)用于非肌肉浸润性的膀胱肿瘤患者，进行了临床I期实验研究。35名患者在单次或多次膀胱内灌注溶瘤病毒CG0070后，在尿液中均检测到高水平的GM-CSF，在给予溶瘤病毒2-5天后，58.3%的患者尿液中均可检测到CG0070病毒基因组的复制，并在体内持续平均达到10.4个月。证实溶瘤病毒CG0070膀胱内灌注有一定的抗肿瘤作用及安全性。 [64]Chang 等将表达GM-CSF的溶瘤病毒KH901用于头颈部肿瘤，进行了临床I期实验。所有受试患者除有一些轻微流感样症状外，没有出现其他毒性反应。在溶瘤病毒治疗2-4天后患者血液中检测到KH901基因组的高峰，在15天后消失。证实溶瘤病毒KH901瘤内注射具有可行性、很好的耐受性以及生物活性。 [65]Pesonen 等构建了由hTERT 启动子控制表达CD40 配体(CD40L)的溶瘤病毒(CGTG-40L)，通过刺激机体产生有益的免疫反应而达到治疗肿瘤的效果。并将这种溶瘤病毒用于9位患有实体瘤的患者的瘤内注射，没有观察到明显的副作用，且83%的患者在三个月内病情得到缓解。 [66]Kimball 等将针对Rb通路且病毒趋向性改进的溶瘤腺病毒Ad5-Δ24-Arg-Gly-Asp (RGD)用于复发的恶性卵巢癌，进行了临床?期实验研究。结果证实除了轻微的副反应(发热、疲乏和腹痛)外，没有观察到病毒载 8 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 体相关的重度副作用，且在1个月的随访中，71%的患者病情稳定。 H101是我国开发的一种E1B-55KD 和部分 E3基因缺失的溶瘤腺病毒，其结构与ONYX-015相似，主要用于头颈部的鳞状细胞癌。目前已经完成临床 [67, 68][69][70][71]前安全性评价、临床?期、?期和?期实验，结果显示H101具有很好的耐受性，且与化疗等其他临床治疗方法联合有很好的治疗效果。因此已经被FDA批准成为与化疗联合治疗头颈部肿瘤的新药。 [72]胡永超 等研究了携带自杀基因(TK)的溶瘤腺病毒(Ad-ETK)治疗实体肿瘤患者的安全性及临床疗效。结果证实Ad-ETK治疗后患者最常出现的毒副反应为流感样症状，包括寒颤、发热、乏力、肌肉酸痛，毒副反应发生的程度与给药途径有关，其中以股动脉穿刺血管内给药最容易发生，其次依次为肿瘤局部注射和腹腔灌注给药。10例患者用药期间未见用药相关的心、肝、肾等重要器官的功能损害。 [73]Breitbach 等对 23 名已发生转移的结直肠癌、皮肤癌、卵巢癌患者静脉内注射不同剂量水平的 JX-594 病毒单剂，结果显示病毒跟随肿瘤细胞到达全身成功阻止了肿瘤的继续生长，而未对正常组织造成影响，仅部分患者出现了轻微副作用，如流感样症状、发热、寒颤等。 由此可见，基因治疗的安全性成为其进入临床应用的关键问题。在临床前安全性评价中，除了常规进行的动物急性毒性实验、局部刺激实验、动物长期毒性实验、药代动力学实验等，对于用于基因治疗的溶瘤病毒，检测病毒基因的表达及病毒的复制情况对于病毒的毒性和风险性评估也是必需和至关重要的。这些数据将为溶瘤腺病毒进入临床I期研究及今后更广泛的应用提供理论基础。 1.5 前期工作、选题依据和本课题主要研究工作 由上述介绍可知，开发一种有效的膀胱组织特异性的溶瘤腺病毒，并通过研究证实其生物性分布和安全性，是一种很有前景的治疗策略。 人类5型腺病毒早期表达的E1A基因具有抑癌作用，它能双向调控多种基 [74]因的表达，如可以在转录水平抑制肺癌细胞erbB2的表达，通过增强转移抑制基因nm23的表达抑制肿瘤的转移，而且还可以通过阻断NF-κB的活性和调 [75]节细胞内基因表达增加肿瘤细胞对放射治疗的敏感性。UP ?启动子在人膀胱肿瘤细胞中都具有特异性，即使在分化极差的尿路上皮癌细胞中仍使其下游基 [27, 76]因表达。UP?基因的表达具有膀胱特异性并与膀胱上皮的分化密切相关， [27, 28]从而为膀胱肿瘤的基因靶向治疗提供了重要基础，可作为特异性启动子启 9 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 动腺病毒基因的表达，使其只在膀胱肿瘤组织内复制。同时，研究表明前列腺干细胞抗原增强子(Prostate Stem Cell Antigen Enhancer，PSCAE,327bp)不仅 [23, 77]在前列腺细胞表达，在膀胱上皮细胞也有所表达, 可强化下游基因表达， [78]是具有雄激素依赖性的顺式作用元件，因此可作为增强子增强UP?启动子的作用及其特异性。另外，一些研究表明在一些雄激素受体(AR)表达阳性的膀胱肿瘤细胞内，腺病毒E1A基因可与AR发生相互作用，从而抑制腺病毒的 [79]复制，限制了其在膀胱肿瘤中的应用。而将E1A基因与AR基因融合，共同 [79]处于UP?启动子的下游，则可促进腺病毒的复制及其活性。 因此，在前期研究中，我们用最新的基因工程的方法，分别克隆出了Ad5E1A基因、人膀胱组织特异性启动子(UP?)、前列腺干细胞抗原增强子(PSCAE)、雄激素受体基因(AR)，将它们有序定向连接到腺病毒穿梭载体，通过同源重组构建骨架载体，用膀胱组织特异性启动子UP? 控制Ad5E1A和AR基因的表达，辅以PSCAE 增强活性，经人胚肾293细胞(HEK293)包装 -E1A-AR (APU-E1A-AR), 获得一系列重组腺病毒，Ad-PSCAE-UP? Ad-PSCAE-UP?-E1A (APU-E1A)和Ad-PSCAE-UP?-Luc (APU-LUC)。研究表 [23]明PSCAE 及UP? 具有膀胱肿瘤组织特异性，重组腺病毒Ad-UP?-E1A 感染膀胱肿瘤细胞后Western blot 检测E1A 显著表达。体外研究病毒Ad-PSCAE-UP?-E1A-AR 对膀胱肿瘤细胞如EJ、5637、BIU87 有较强杀伤作 [80]用，其抗肿瘤机制可能与促进凋亡有关。体内对裸鼠皮下膀胱癌移植瘤模型也有显著抗肿瘤效能，动物实验证实Ad-PSCAE-UP?-E1A-AR 能够显著抑制AR阳性膀胱癌细胞的增殖并且抑制膀胱实体肿瘤的生长达50%，显著延长荷 [80]瘤鼠的寿命。 在以上理论基础及前期研究工作的基础上，本学位论文主要针对我们自己构建的膀胱肿瘤特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物性分布和安全性评价，完成了以下几方面的研究工作，技术路线如图1.3: (1) 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒的扩增、纯化、鉴定及滴度测定; (2) 建立膀胱肿瘤皮下移植瘤动物模型，给予溶瘤腺病毒瘤内注射后，观察动物的一般状况、体重及行为学的变化; (3) 检测注射了不同剂量溶瘤腺病毒后，动物血液学和肝脏生化相关指标的变化; (4) 注射了不同剂量溶瘤腺病毒后，对动物各脏器进行组织病理学检查，包括脏器系数的变化、各主要器官大体的观察、组织H&E染色及针对溶瘤腺病毒 E1A基因的免疫组化染色的观察; (5) 用PCR的方法检测病毒 E1A基因在动物体内各组织中的表达，并 10 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 用Western blot 的方法检测E1A 蛋白的表达; (6) 利用腺病毒Ad-PSCAE-UP?-Luc (APU-LUC)瘤内注射，通过LUC的表达进一步检测病毒在动物各主要器官中的复制和分布情况。 通过以上几个方面的研究，全面评估溶瘤腺病毒在不同剂量下瘤内注射后，在动物体内的生物性分布和初步安全性，为下一步进行长期毒性实验，及临床实验等提供理论基础，也为开发溶瘤腺病毒作为治疗膀胱癌的新型基因药物提供可能。 图1.3 技术路线图 11 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 第二章 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒的扩增、纯化及鉴定 我们课题组利用前列腺干细胞抗原增强子(PSCAE)和人尿路特异性蛋白 )启动子插入到雄激素受体(AR)与腺病毒基因 E1A 的融合基因上游，(UP? 构建了一系列具有膀胱癌特异性的重组腺病毒: Ad-PSCAE-UP?-E1A (APU-E1A), Ad-PSCAE-UP?-E1A-AR(APU-E1A-AR), Ad-PSCAE-UP?-LUC(APU-LUC)。这种溶瘤腺病毒是一种新型的、在膀胱肿瘤组织内特异性表达的、并能在膀胱癌细胞中高效复制的重组溶瘤腺病毒。通过增强溶瘤腺病毒在膀胱癌细胞中复制的特异性，可减少对正常细胞的毒性作用，从而增强膀胱癌基因治疗的靶向性和安全性。 [23, 28, 79]膀胱组织特异性溶瘤腺病毒的构建方法:将起始穿梭载体 P-Shuttle CMV 内在的 BamHI 位点切除，再在该切除位点处重新引入含有 AgeI，NheI, BamHI 和 NotI 位点的多克隆位点，将 E1A 与 AR 用 BamHI 和 EcoRV 双酶切，保留酶切后得到的 E1A-AR 融合片段，将膀胱组织特异性UP? 启动子插入到穿梭载体质粒的 NheI 和 BamHI 位点，将前列腺干细胞抗原增强子 PSCAE 插入到穿梭载体相应的AgeI和NheI位点，构建得到质粒Rp-PSCAE-UP?-E1A;将5’末端磷酸化后的 AR 编码序列与 Rp-PSCAE-UP?-E1A 质粒载体连接，得到载体 Rp-PSCAE-UP?-E1A-AR;再将 Rp-PSCAE-UP?-E1A-AR 与 pAdEasy-1 质粒在大肠杆菌(BJ51832)中进行同源重组，重组产物在人胚肾293细胞(HEK293)中进行包装得到特异性重组腺病毒Ad-PSCAE-UP?-E1A，Ad-PSCAE-UP?-E1A-AR，其组织结构如图2.1。为了方便检测病毒在动物体内的复制情况，我们还构建了效应检测病毒Ad-PSCAE-UP?-LUC，通过 LUC 的检测实时观察病毒的复制情况。我们将得到的重组腺病毒在 HEK293 中扩增，收集后用氯化铯梯度离心法进行纯化。然后用 PCR 的方法分别对溶瘤腺病毒中 E1A、UP?、PSCAE、AR、UP?-E1A和 UP?-LUC 基因的表达进行检测，从而对我们构建的溶瘤病毒进行鉴定。最后用 TCID(50% Tissue Culture Infective Dose，50% 组织培养感染病毒的剂量)50 的方法确定溶瘤腺病毒的滴度。为下一步研究溶瘤腺病毒在动物体内的生物性分布和安全性评价提供基础。 12 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 图2.1 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒的组织结构简图 注:APU-E1A 是在野生型腺病毒的基础上插入前列腺干细胞抗原增强子(PSCAE，327bp),并且由人类泌尿上皮特异性蛋白?(UP?)作为启动子插入到内源性 E1A 启动子的位置。在 APU-E1A-AR 中, 用 E1A-AR 的融合基因取代 E1A 基因。在 APU-LUC 中，在 UP? 启动子的下游插入 LUC，用来检测腺病毒的复制和分布。 2.1 实验材料 2.1.1 主要病毒、细胞株及试剂 (1)溶瘤腺病毒:Ad-PSCAE-UP?-E1A-AR(APU-E1A-AR), Ad-PSCAE-UP?-E1A(APU-E1A), Ad-PSCAE-UP?-Luc(APU-LUC) 由本课题组构建完成并于-80?低温冰箱中保存; (2)细胞株:HEK293(由兰州大学第二医院泌尿外科研究所冻存); (3)细胞培养基:(DMEM，Dulbecco’s modified Eagle’s medium，高糖):购自Gibco 公司(美国); (4)氯化铯病毒纯化试剂盒:购自美国 Sigma 公司; (5)二甲基亚砜(DMSO):购自美国 Sigma 公司; (6)胎牛血清(无支原体):购自四季青生物工程公司(中国杭州); (7)PCR 试剂盒:购自大连宝生物公司(TAKARA); (8)琼脂糖:购自大连宝生物公司(TAKARA); (9)溴化乙锭(EB): 购自 Promega 公司,美国; 13 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 (10)DNA maker: 购自大连宝生物公司(TAKARA)。 2.1.2 主要溶液的配制 1)细胞培养液:将1袋 DMEM(高糖)粉剂加入新鲜超纯水(ddHO) (2800mL，磁力搅拌器搅拌至完全溶解，加入 NaHCO 粉剂 2.0g，调节 pH 值至 3 7.4 左右，用容量瓶定容至1000mL，再在溶液中加入青霉素、链霉素溶液(100U/mL)。用过滤装置在超净工作台内一次性过滤，用高压灭菌过的 250mL玻璃瓶分装，在 4?冰箱内保存备用。 (2)D-Hanks 缓冲液(pH 7.4, 0.01mol/L):在 800mL ddHO 中完全溶解 2KHPO0.24g，NaCl 8g, KCl 0.2g，NaHPO.2HO 1.44g，用盐酸调节溶液 pH 值24 242 为 7.4 左右，用容量瓶定容至1000mL，然后分装，在高压条件下，蒸汽灭菌，并保存于4?条件下。 (3)胰酶消化液(0.25%):将胰蛋白酶干粉 0.25g 溶于配置好的100mL D-Hanks 缓冲液中，在磁力搅拌器上搅拌使其完全溶解，然后用装有 0.22µm 微孔滤膜的一次性滤器过滤除菌，分装，于4?保存。 (4) PBS 磷酸盐缓冲液:(0.01mol/L, pH值 7.4):称取NaCl 8g, KCl 0.2 g, NaHPO.12HO 1.43g， KHPO0.24g，加入ddHO 800mL，使其完全溶解，24224 2 用盐酸在 pH计中调节溶液 pH 值为 7.4 左右，0.22µm 微孔滤膜一次性过滤，100mL灭菌容器内分装，高压蒸汽灭菌，保存于4?。 (5)细胞冻存液(10% DMSO):1mL DMSO 内加入 9mL 胎牛血清，然后混匀并保存于4?冰箱内。 (6)透析用缓冲液:准确称取蔗糖 50g，溶解于10mL 的 Tris-HCl(1mol/L ，pH 8.0)缓冲液及 2mL 的 MgCl(1mol/L) 溶液中，混匀，用ddHO 在容量22瓶中定容至1000 mL，然后用盐酸调节溶液的 pH 值至 7.4，用滤器过滤除菌，分装，在4?条件下保存。 2.1.3 主要仪器和设备 (1)PCR 基因扩增仪:MJ PTC 220型，美国; (2)二氧化碳培养箱:MCO-15AC，日本三洋; (3)三恒多用水平电泳仪:DYY-III-12B 型，北京六一仪器厂; (4)凝胶成像系统:SYNGENE ChemiGenius 2，英国; (5)电子天平:Satorious BS 400S-WE1，美国; (6)三用电热恒温水浴箱:SHH.W21600，中国上海跃进医疗器械厂; (7)标准型pH 计:Satorius PB-20型，德国; 14 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 (8)台式低温离心机:Biofuge 15R，德国; (9)超速冷冻离心机:贝克曼库尔特 Optima XL-100K，德国; (10)倒置相差显微镜:CK40-F200型，奥林巴斯，日本; (11)紫外分光光度计:UV-2550型，日本岛津; 12)定时、恒温磁力搅拌器:JB-3型，上海雷磁新注射仪器有限责任公司。 ( (13)细胞冻存用液氮生物容器:YDS-30-125型，中国成都金凤液氮生物容器有限责任公司，美国; (14)微量移液器(0.1-10mL,10-100mL,100-1000mL):HTL LM型，荷兰; (15)超低温冰箱:MDF-V332型，日本三洋; (16)净化工作台:YJ-900型，中国苏州。 2.2 实验方法 2.2.1 HEK293 细胞的复苏 1)准备37?水浴; ( (2)将冻存的 HEK293 细胞自液氮灌中取出，检查封口，并立即投入37?水浴中，使之在1min 内完全溶解; (3)在超净工作台内，将 5mL 的 DMEM 细胞培养液加入 10mL 离心管中，然后将溶解的 HEK293 细胞转移至离心管内，短暂离心(800rpm)，弃去上清液; (4)在离心管中加入 10% 的 DMEM 高糖培养液 10mL，轻轻吹打细胞沉淀使之重悬，然后转移至已灭菌的细胞培养瓶中，置于37?，5% CO 培养箱2中培养。 2.2.2 HEK293 细胞的培养和传代 (1)观察细胞生长状况，包括细胞密度、形态，HEK293 细胞为贴壁细胞，待细胞铺满培养瓶底约 80% 时，即对细胞进行传代; (2)轻轻倒去细胞培养瓶内的培养液，加入适量 D-Hanks 缓冲液，轻轻晃动培养瓶，将细胞冲洗 2-3 次; (3)轻轻倒去细胞培养瓶内的 D-Hanks 缓冲液，将 0.25% 的胰酶加入1mL，并轻摇培养瓶，使胰酶与细胞均匀接触，然后放置于37?，5% CO培养2箱中; (4)约 10-20s 后将细胞培养瓶从培养箱中取出，放在倒置显微镜下观察，如果细胞回缩、变圆，并开始悬浮时，立即加入含 10% 胎牛血清的 DMEM 培 15 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 养液 10mL 以终止胰酶的消化作用; (5)用吸管轻轻吹打，避免细胞成团，用离心机短暂离心(800rpm，3min); (6)弃去上清液，再加入含 10% 血清的 DMEM 细胞培养液，分装至各培养瓶中进行传代，置于37?，5% CO 培养箱中继续培养。 2 2.2.3 HEK293 细胞的冻存 1)当细胞处于对数生长期时，细胞培养至铺满培养瓶底约 80%，轻轻倒( 去培养瓶中的培养液，加入适量的 D-Hanks 缓冲液洗涤细胞，轻缓摇动培养瓶，再将培养瓶内的 D-Hanks 液弃去; (2)在培养瓶中加入胰酶溶液 1mL，然后轻轻晃动培养瓶使胰酶与细胞均匀接触，再将培养瓶放置于37?，5% CO培养箱内; 2 (3)约 10-20s 后将培养瓶从培养箱中取出，放在倒置显微镜下观察，待细胞逐渐脱离瓶底，并出现回缩、变圆的现象时，立即终止消化，方法是将含 10%胎牛血清的 DMEM 培养液加入到细胞培养瓶中; (4)用吸管沿着培养瓶的瓶壁轻轻吹打细胞，使细胞溶解于培养液中并完全脱壁，然后转移至 10mL 离心管中，800rpm 短暂离心，并弃去上清培养液，保留细胞沉淀。如所需的细胞数量不足，可同时收集两到三瓶的细胞进行冻存; (5)将配置好的细胞冻存液加入离心管中，轻轻吹打均匀，吸取适当容积分装于灭菌的冻存管内，用胶布封口，标记细胞种类、冻存时间，于 4? 放置 1h，-20? 放置 2-3h， -80? 过夜后即可放至液氮灌中。 2.2.4 溶瘤腺病毒的扩增 2(1)在 75cm 的细胞培养瓶中大量培养 HEK293 细胞，镜下观察待细胞处于对数生长期且生长状态良好时，轻轻倒去培养瓶内的培养液，并将腺病毒上清液加入其中，轻轻摇晃培养瓶 3 次，使之充分混匀，然后放于培养箱中培养 2-3h; (2) 加入含 5% 胎牛血清的 DMEM 培养基 8mL，置于37?，5%CO 培2养箱继续培养; (3)在倒置显微镜下观察细胞的变化情况，如绝大部分的细胞出现变圆、回缩、细胞间接触消失、脱壁等现象时，即停止培养，并轻轻吹打细胞，使细胞完全脱壁，加入 50mL 离心管中，即可进行下一步的纯化操作。 2.2.5 重组腺病毒的纯化 (1)将扩增后的腺病毒细胞溶液短暂离心; (2) 弃去上清液，将试剂盒中的清理液A 5mL 加入沉淀中，然后放入 16 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 -80?冰箱孵育15min; (3)置于 37? 恒温水浴箱中融化，然后涡旋震荡 30s; (4)继续重复以上冻融步骤 4-6 次; (5)在离心机中，4?条件下，3000rpm 离心 5min; 6)将离心后的澄清病毒上清液转移到新的 10mL 锥形离心管中; ( (7)在离心管中加入试剂盒中的离心液 B 4.5mL，然后涡旋震荡15s; (8)将上述混合液移至 16.5mL 的超速离心管中; (9)如果液体不足 16.5mL，则在其中加入适量试剂盒中的补充液 C ，直到 16.5mL，从而使超速离心管充满; (10)将上述超速离心管放入超速离心机中，在10?，44000 rpm 条件下，离心 24h; (11)离心结束后轻轻取出离心管，并对病毒带进行照相; (12)取 5mL 的一次性注射器及相应大小的针头，缓慢插入至肉眼可见的 下缘; 乳白色病毒离心带的 (13)将所有白色离心带中的病毒溶液完全抽吸，用配置好的透析缓冲液进行去盐和浓缩，为去盐充分，使透析缓冲液的体积为病毒溶液的 200 倍，共透析 3 次，每次 1h，每一次透析时均使用新的透析缓冲液，以便使溶液中的氯化铯完全去除; (14)将最终纯化完成的病毒溶液放入 2mL 冻存管中，并加入保存液 D 1mL，充分混匀后在 -80? 冰箱中储存，备用。 2.2.6 溶瘤腺病毒滴度的测定 2.2.6.1 溶瘤腺病毒颗粒滴度(VP)的测定 将重组腺病毒和 buffer (生理盐水)分别用裂解液在 56? 水浴中裂解 10min，放置至室温，以 buffer 为空白对照，用紫外分光光度计测定腺病毒样品的 OD、OD，按以下计算VP，得到的数值为 VP 浓度(每mL): 260280 12VP=OD×样品稀释倍数×1.1×10 260 2.2.6.2 溶瘤腺病毒感染性颗粒滴度的测定(TCID 法) 50 (1)取一瓶正常培养的 HEK293 细胞，待其呈生长状态良好且细胞数呈对数增长时，用胰酶消化，收集，并进行细胞计数; 5(2)取 20mL(10个/mL)HEK293 细胞，加入含 2% 血清的 DMEM 培养基; (3)在 2 块 96 孔板中每孔加入100μL 细胞悬液; 17 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 (4)稀释病毒溶液:准备数个 Eppendorf 管，分别标记，在第 1 管中加入 0.45mL 含 2% 血清的 DMEM 培养基，其余Eppendorf 管加入0.9mL -1DMEM 培养基。再向第 1 管中加入 0.05mL 病毒保存液，使病毒稀释度为10，上下吹打使其混匀;接着从第 1 管中吸取 0.1mL 溶液加入第 2 个 Eppendorf -2管中，从而使第二管的病毒稀释度为10;再从第 2 管中吸取 0.1ml 溶液加入到第 3个 Eppendorf 管中，依照此种方法，依次将病毒溶液进行10倍的梯度稀释; -3-10(5)取最后 8 个稀释液(10-10)加入96 孔板，每孔 0.1mL，每个稀释度重复加 10 个孔，阴性对照为加入胎牛血清的细胞 DMEM 培养基，加在最后两列; (6)将 96 孔板置于37?，5% CO 培养箱中培养; 2 (7)每天于倒置显微镜下观察 96 孔板，并记录出现细胞病变效应(CPE) 的孔数及具体时间，待细胞病变不再发展后，观察记录结果。阳性结果的判断方法:与阴性对照组比较，在每个孔中只要有细胞出现 CPE 现象即为阳性; (8)本测试有效的判定方法:阴性对照组和最高稀释度组中细胞生长良好且无 CPE现象，最低稀释度组中的 CPE 阳性率为 100%; (9)计算病毒滴度及换算成 pfu 的公式: T (TCID)=10-[L-d×(s-0.5)]+1 50 T (pfu/mL)=10×lgTCID-0.7 50 式中:L— 最高稀释率的对数 d— 稀释对数之差 s— 阳性孔数的总和 2.2.7 溶瘤腺病毒的鉴定 2.2.7.1 提取溶瘤腺病毒 DNA (苯酚氯仿法) (1)取以上扩增纯化后的腺病毒溶液 0.45mL，加入3μL DNA 酶(DNAse，10mg/mL)，37? 水浴 1h; (2)终止酶切反应，加入0.5mol/L EDTA(PH8.0)22μL，10% SDS 28μL，25mg/mL 蛋白酶K 3μL，混匀，56? 1h; (3)冷却至室温，加入10mg/mL RNA酶(RNAse)1μL，37?水浴 30min; (4)加入等体积的苯酚-氯仿(1:1)缓慢抽提5min，12000rpm 离心6min; (5)将上清液移入新的 2 mL离心管中，加入等体积氯仿-异戊醇(24:1)缓慢抽提 5min，12000rpm 离心 6min; (6)将上清液移入新的 2 mL离心管中，并加入 1/10 体积 3mol/L 的醋酸 18 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 钠(pH3.0)溶液和 2 倍体积的预冷的无水乙醇，在-20?条件下放置 20min ，然后在超速离心机中离心 10min，转速 12000rpm，温度 4?; (7)弃去上清，在沉淀中加入 500μL 70% 的乙醇，12000rpm 离心6min; (8)弃上清，将沉淀置于 37? 恒温箱中干燥 30min; 9)待腺病毒 DNA 干燥后，在其中加入适量 ddHO 使腺病毒 DNA溶解，(2 在4?(短期)或 -20?(长期)保存。 2.2.7.2 引物的设计与合成 引物设计根据查找相关文献以及我们的前期研究工作完成，引物合成由大连宝生物公司(TAKARA)完成。设计的引物序列如表2.1所示。 表2.1 溶瘤腺病毒关键基因片段的引物序列 2.2.7.3 PCR 反应体系和反应条件 按照大连宝生物公司提供的 PCR 反应试剂盒，在25μL 反应体系中进行，其构成如表2.2所示: 表2.2 PCR 反应体系 19 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 PSCAE、UP?、E1A、AR、UP?-E1A、UP?-Luc 反应条件分别如表2.3所示: 表2.3 溶瘤腺病毒各基因片段的 PCR 反应条件表 2.3 实验结果 2.3.1 溶瘤腺病毒在 HEK293 细胞中的扩增及导致的细胞病变效应 正常生长的 HEK293 细胞为单层贴壁细胞，镜下呈纤维条索形(图2.2a)。在细胞中加入溶瘤腺病毒(APU-E1A-AR)后，随着病毒的不断复制和扩增，在 HEK293 细胞内观察到细胞出现典型的病变效应(CPE)，即细胞形态发生改变，细胞回缩、变圆，呈葡萄状聚集，包涵体出现，甚至出现脱壁、崩解，且随着时间的延长，观察到的细胞 CPE 现象越明显(图2.2b,c,d)。 20 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 图2.2 溶瘤腺病毒感染HEK293细胞后的细胞病变效应 注:A.正常HEK293细胞(×40)B.C.D分别为溶瘤腺病毒(APU-E1A-AR)感染HEK293细胞24h,48h和72h后细胞的变化。随着病毒感染时间的延长，HEK293细胞逐渐出现回缩、变圆，呈葡萄状聚集，包涵体出现，甚至出现脱壁、崩解。 2.3.2 溶瘤腺病毒纯度和滴度的测定结果 TCID 法检测病毒感染颗粒滴度结果示意图如表2.4 所示，检测得到的各50 种重组腺病毒的滴度如表 2.5 所示。 我们用紫外分光光度计检测得到的各种腺病毒 OD/OD均在 1.20-1.30之260280 间，TCID/VP 在0.98%-1%之间(表2.5)，说明腺病毒纯度符合要求。 50 21 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 表2.4 TCID 法检测溶瘤腺病毒感染颗粒滴度结果示意图 50 12 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 (control) (control) -10 - - - - - - - - - - - - A 10 -9B 10 - - - - - - - - - - - - -8稀C 10 - - - - - - - - - - - - -7释D 10 - + - - - + - + + - - - -6比E 10 + + + + - + + + - + - - -5例 F 10 + + + + + + + + + + - - -4G 10 + + + + + + + + + + - - -3H 10 + + + + + + + + + + - - 注:- 表示阴性，+ 表示阳性 表2.5 溶瘤腺病毒的纯度与滴度检测结果 OD/OD TCID(IU/mL) TCID/VP 2602805050 11Ad-PSCAE-UP?-E1A-AR 1.23 3.8×10 1% 12Ad-PSCAE-UP?- E1A 1.2 1.2×10 1% 11Ad-PSCAE-UP?-Luc 1.24 5.7×10 0.98% 2.3.3 溶瘤腺病毒的鉴定结果 我们用 PCR 的方法对构建、扩增、纯化的溶瘤腺病毒中主要基因片段(E1A、PSCAE、UP?、AR、UP?-E1A、UP?-Luc)进行扩增，用琼脂糖凝胶电泳(1×TAE电泳缓冲液，1.5%琼脂糖凝胶,电泳条件:80-90V,30-40min)检测基因条带的有无和出现的位置。结果显示经过扩增纯化后的溶瘤腺病毒基因表达稳定，均在相应位置出现了与预计大小相当的DNA条带，腺病毒中E1A基因(图2.3A,B)、UP?基因(图2.3C)、PSCAE基因(图2.3D)、AR基因(图2.3E)、UP?-E1A(图2.3F)、UP?-Luc(图2.3G)均表达稳定。表明我们构建的重组腺病毒在扩增、纯化后没有出现基因的改变和条带的丢失，符合实验要求，可以进行下一步实验研究。 22 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 541bp 注:A1:DL2000DNA Marker;A2-A6: Ad-PSCAE-UP?-E1A-AR; B1:DL2000 DNA Marker;B2-B7: Ad-PSCAE-UP?-E1A; B8:Ad-PSCAE-UP?-LUC C UP? 314bp 注:C1:DL2000 DNA Marker;C2,C3: Ad-PSCAE-UP?-E1A-AR; C4,C5:Ad-PSCAE-UP?-E1A; C6,C7:Ad-PSCAE-UP?-LUC 1 2 3 4 5 6 7 PSCAE 327bp 注:D1:DL2000 DNA Marker;D2,D3: Ad-PSCAE-UP?-E1A-AR; D4,D5:Ad-PSCAE-UP?-E1A; D6:Ad-PSCAE-UP?-LUC; D7:Ad-UP?-E1A 23 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 1 2 3 4 5 6 AR 870bp 注:E1:DL2000DNA Marker;E2: Ad-PSCAE-UP?-E1A; E3,E4,E5: Ad-PSCAE-UP?-E1A-AR; E6:Ad-PSCAE-UP?-LUC 1 2 3 4 5 6 7 8 UP?-E1A 注:F4:DL2000DNA Marker;F1,F2,F3: Ad-PSCAE-UP?-E1A;F5,F6,F7,F8: Ad-PSCAE-UP?-E1A-AR 1 2 3 4 5 6 7 8 UP?-LUC 注:G1,G2,G3,G4,G5: Ad-PSCAE-UP?-LUC;G6,G7:Ad-PSCAE-UP?-E1A; G8:Ad-PSCAE-UP?-E1A-AR 图2.3 溶瘤腺病毒主要基因片段的鉴定 注:A,B: E1A基因的鉴定;C: UP?基因的鉴定;D: PSCAE基因的鉴定 E: AR基因的鉴定 F: UP?-E1A基因的鉴定 G: UP?-LUC基因的鉴定。 24 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 2.4 讨论 2.4.1 溶瘤腺病毒的扩增和纯化时需注意的问题 目前的研究中常用的用于包装和扩增腺病毒的工具细胞是人胚肾293细胞(HEK293)，因为 HEK293 细胞具有使用方便、永生化、培养条件低、增殖周期短等诸多优点，但该细胞也存在一些缺点，如在培养过程中不容易贴壁，生长活力低，易于损伤，且随着传代次数的增加会导致包装病毒的生物学特性的丢失等。我们在 HEK293 复苏培养的过程中也发现了一些问题，如对胰酶消化反应较敏感、进行离心吹打等机械操作时对细胞损伤较大、传代次数较多的细胞活性较差等问题，对实验结果造成一定的影响，因此在对 HEK293 细胞进行操作的过程中须注意以下几点:(1)尽量使用传代次数较少的 HEK293 细胞，以保证细胞具有良好的活力，并使产生突变型病毒的可能性大大降低;(2)细胞复苏速度要快，尽量在1 min 内使冻存的细胞完全融化，否则会造成细胞的损伤;(3)在复苏传代的过程中尽量少用离心法沉淀细胞，以免离心力对细胞造成的破坏作用;(4)HEK293 细胞本身贴壁并不十分牢固，因此在传代的过程中需缩短胰酶消化时间，并避免直接而有力的吹打等操作;(5)冻存细胞时应选择处于对数生长期的细胞，使保存的细胞具有较高的活性;(6)DMSO在常温下对细胞有毒副作用，因此应将冻存液在 4? 条件下放置 40-60 min后再使用。 HEK293细胞被溶瘤腺病毒感染后，镜下观察当细胞出现变大、变圆、甚至脱落等 CPE 现象时即可收集细胞，但操作过程中有以下问题仍需要注意:由于细胞的生长速度不同，细胞出现 CPE 现象的时间也不一致，因此对感染溶瘤腺病毒的 HEK293 细胞进行收集时，会出现不同步的问题。如果分批收集 HEK293 细胞，一次得到的病毒量较少，且反复冻融还会影响溶瘤腺病毒的质量。为避免这一问题的出现，为了使细胞生长基本同步，并保证各培养瓶内的细胞数量基本一致，在进行HEK293 细胞传代时，须进行严格的细胞计数，这样可在细胞融合度达 80% 左右时，在每个培养瓶中均加入相同量的病毒，培养 5-7d 后即可同时收集，以保证病毒的数量和质量。 在溶瘤腺病毒扩增后还必须对其进行纯化和浓缩。因为用于体内实验研究的腺病毒需要具备较高的滴度和纯度，因此必须对腺病毒进行纯化，以去除多余的杂质蛋白，最大限度降低其对机体的免疫原性。氯化铯密度梯度离心法可去除约 [81]99%的杂质蛋白 ，因此为目前人们所公认的病毒纯化方法。纯化后还需对溶瘤腺病毒进行浓缩，其目的是尽可能地完全去除氯化铯，以排除氯化铯对病毒特 12性的影响。本课题中使用的溶瘤腺病毒在纯化和浓缩后的最高滴度约1.2×10 IU/mL，TCID/VP 在0.98%-1%之间，完全符合实验所需的要求。 50 25 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 2.4.2 溶瘤腺病毒的滴度分析 溶瘤腺病毒的滴度通常有三种不同意义上的表示形式:VP(vector particles)、 颗粒滴度，单位是vp/mL，IU(Infection unit)和 PFU(plaque forming unit)。VP 指 采用紫外分光光度计测量 OD进行计算，指每mL病毒溶液中所含有的病毒颗260 粒数;IU 是感染性颗粒滴度，单位IU/mL，采用TCID法(50%组织培养感染剂50 量法)进行测定，指每mL病毒溶液中所含的有感染能力的病毒颗粒，因此TCID50的数值比VP更具有说服力。PFU 指空斑形成单位，多用于单纯疱疹病毒载体、痘病毒载体、腺病毒载体等能够导致细胞溶解、空斑形成等病变的病毒载体。 TCID与VP的比值(TCID/VP)可用以衡量腺病毒的有效纯度。该比值越5050 高，说明有感染活性的病毒越多。在检测病毒滴度的同时，还可用 OD/OD260280 来表示腺病毒的纯度，其正常值为 1.20-1.45。脱离此范围说明腺病毒的纯度不够。我们用紫外分光光度计检测得到的各种腺病毒 OD/OD均在 1.20-1.30260280 之间，且TCID/VP 在 0.98%-1% 之间，说明经过扩增、纯化后的溶瘤腺病毒50 (APU-E1A、APU-E1A-AR)纯度符合要求，且基本全部具有感染活性。 2.4.3 溶瘤腺病毒的鉴定分析 溶瘤腺病毒感染 HEK293 细胞后，如果出现了 CPE，基本就能确定腺病毒扩增成功。但为了避免腺病毒在传代过程中出现突变，仍需要对腺病毒进行鉴定。主要有三种鉴定的方式:(1)检测腺病毒基因组 DNA;(2)检测腺病毒中目的基因的转录水平，即mRNA的表达。提取病毒液的 RNA，用 RT-PCR 的方法检测目的基因的转录;(3)检测腺病毒目的蛋白的表达，即蛋白质水平。浓缩或者纯化腺病毒(滴度高也可以不用)经 SDS-PAGE 电泳-转膜-封闭-一抗-二抗-显色-X片曝光-显影-定影。其中第一种方法最为简便，直接，易于操作。故本课题采用第一种方法直接检测腺病毒基因组中的 DNA 片段，针对本课题设计构建的溶瘤腺病毒，我们检测了腺病毒 E1A、UP?、PSCAE、AR、UP?-E1A 和 UP?-LUC基因片段，均在预期的位置出现了相应的条带，证实了溶瘤腺病毒基因组的正确性和稳定性，可用于下一步的实验研究。 2.5 结论 (1)我们课题组构建的膀胱癌特异性的溶瘤腺病毒 (APU-E1A,APU-E1A-AR)感染 HEK293 细胞后，出现了明显的 CPE 现象，确定了腺病毒扩增方法的正确及成功。 (2)扩增后的溶瘤腺病毒，用氯化铯密度梯度离心的方法进行纯化，用 26 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 12TCID的方法进行病毒感染滴度的测定，最高感染滴度为1.2×10 IU/mL，纯度50 (TCID/VP)在0.98%-1%之间，OD/OD均在 1.20-1.30之间，说明病毒纯50260280 化和滴度测定的方法正确、可行，由此得到的溶瘤腺病毒滴度较高，纯度较好，可进行下一步的实验研究。 (3)我们用 PCR 的方法对病毒基因组各核心基因片段 DNA 进行检测，从而对扩增和纯化后的溶瘤病毒(APU-E1A,APU-E1A-AR,APU-LUC)进行鉴定，E1A、UP?、PSCAE、AR、UP?-E1A和 UP?-LUC 基因各片段均在相应位置出现条带，证实了这种鉴定方法的可行，也证实了这些溶瘤腺病毒基因结构的正确和稳定，在病毒传代、扩增、纯化后没有出现突变，可用于下一步的实验研究。 27 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 第三章 裸鼠皮下移植瘤模型的建立及溶瘤腺病毒瘤内注 射后动物一般情况的观察 在膀胱组织特异性溶瘤腺病毒(APU-E1A-AR，APU-E1A，APU-LUC)构建、扩增、纯化及鉴定的基础上，我们课题组已经完成了溶瘤病毒在动物体外及 [80]体内的抗肿瘤效应的研究。结果表明溶瘤腺病毒可有效抑制膀胱癌细胞(EJ、5637、BIU87、T24)的增殖，且随着剂量的增加和作用时间的延长，对细胞的增殖抑制作用增强，同时发现这些溶瘤腺病毒具有膀胱肿瘤特异性，对正常膀胱上皮细胞及非膀胱癌细胞没有观察到细胞杀伤效应。在体内实验中，重组腺病毒可有效抑制荷瘤鼠的肿瘤生长，并延长了荷瘤鼠的寿命。为了进一步完善和推进这些溶瘤腺病毒的研究，在以上药效学研究的基础上，本课题着重于溶瘤病毒在动物体内的生物分布和近期安全性评价。因此，本课题中利用人膀胱癌 EJ 细胞建立了裸鼠皮下移植瘤模型，通过瘤内注射的途径给予不同剂量的溶瘤腺病毒，通过动物体重的变化、动物行为学改变、非自主性运动等观察溶瘤腺病毒瘤内注射后动物的一般表现，以初步确定溶瘤腺病毒的安全性。 3.1 实验材料 3.1.1 实验动物及其饲养环境 BALB/c nu-nu 裸鼠，100 只，雌雄各半，购自斯莱克实验动物有限责任公司(上海)，动物合格证号为:2007000509860。SPF级(specific pathogen-free, 无特定病原体)，4-5 周龄，15-18g，健康状况良好，无其他疾病。 所有动物均饲养在 SPF 级实验动物设施内(甘肃中医学院实验动物中心，万级进化系统，设施使用许可证号:SCXK (甘) 2011-0001)。饲养室温度 20-23?，湿度 40-60%，鼠盒、垫料、饮水均经过高压蒸汽灭菌，饲料经过钴 60 照射。所有动物均自由采食和饮水，昼夜节律为 12h:12h。每天清理粪便一次，以免氨浓度过高诱发支原体肺炎。 适应性观察:动物于分组后适应、观察1w，然后进行实验。观察期间，每天记录饲料消耗量、体重等基础数值，对鼻孔有分泌物(呼吸道感染)、斜颈(中耳炎)、体重不增的小鼠予以淘汰，换以同性别、同周龄小鼠。 3.1.2 溶瘤腺病毒及膀胱肿瘤细胞 28 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 (1)溶瘤腺病毒:三种本课题前期构建、扩增、纯化、鉴定后符合要求的膀胱组织特异性溶瘤腺病毒:Ad-PSCAE-UP?-E1A-AR(APU-E1A-AR)， Ad-PSCAE-UP?-E1A(APU-E1A)，Ad-PSCAE-UP?-Luc(APU-LUC)。 (2)人膀胱肿瘤 EJ 细胞:为兰州大学第二医院泌尿外科研究所冻存。 3.1.3 主要试剂 1)RPMI-1640 培养基:美国 Gibco 公司产品，将每袋RPMI-1640(10.4g)( 溶解于800mL 超纯水中，并加入碳酸氢钠 2.0g, 青霉素 100 U/mL, 链霉素 100 U/mL，在磁力搅拌器中充分溶解，用氢氧化钠或盐酸调节溶液的 pH 值为7.2-7.4，加入超纯水在容量瓶中定容至1000mL, 用装有微孔滤膜(0.22µm)的过滤装置过滤除菌后分装。 (2)无支原体胎牛血清(FBS):杭州四季青生物工程公司产品。 3.1.4 主要仪器设备 (1)二氧化碳培养箱:MCO-15AC，日本三洋; (2)电子分析天平:Satorious BS 400S-WE1，美国; (3)游标卡尺:VWR International, Cat# 62379-531，美国; (4)三用电热恒温水浴箱:SHH.W21600，中国上海跃进医疗器械厂; (5)台式低温离心机:Biofuge 15R，德国; (6)倒置相差显微镜:CK40-F200型，奥林巴斯，日本; (7)细胞冻存用液氮生物容器:YDS-30-125型，中国成都金凤液氮生物容器有限责任公司; (8)净化工作台:YJ-900型，中国苏州; (9)坐式自动压力蒸汽灭菌锅:ZDS-35-BI型，上海申安医疗器械厂; (10)超低温冰箱:MDF-V332型，日本三洋; (11)微量移液器(0.1-10mL,10-100mL,100-1000mL):HTL LM型，荷兰。 3.2 实验方法 3.2.1 膀胱癌皮下动物模型的建立 (1)EJ 细胞的培养:用含 10% 胎牛血清的 RMPI-1640 培养基培养人膀胱癌 EJ 细胞，培养条件为 37?，5% CO的培养箱，当细胞生长铺满培养瓶底2 约 80% 时，用0.25% 胰酶消化，1:2 传代。 (2)EJ 细胞接种至裸鼠皮下:待 EJ 细胞生长状态良好，且呈对数增长时， 29 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 6进行短暂离心收集，并进行细胞计数，使细胞数达到至 5×10 时，将所有细胞全部溶于100μL PBS 溶液中，用装有28号针头的微量注射器一次性接种于裸鼠右侧背部皮下。 (3)移植瘤的观察和测量:注射肿瘤细胞后，每日观察裸鼠的一般状况及 [24]肿瘤生长状况，并用游标卡尺测量瘤体的最长径和最短径，依照以下公式计算出移植瘤的体积: 2V=M×M×0.5236 12 式中: M—瘤体最长轴 1 M—瘤体最短轴 2 3.2.2 动物分组及给药方式 将人膀胱癌 EJ 细胞一次性注射到裸鼠背部皮下后，每日观察肿瘤生长情 3况，并进行测量，待肿瘤生长至体积约为 150mm 左右时，用完全随机的方法将所有生长状态良好的荷瘤动物分为8组，每组10只。A 组为 PBS 对照组，B 组 8 7给予 APU-LUC 5×10pfu，C 组给予 APU-E1A 5×10 pfu，D 组给予 89APU-E1A 5×10 pfu，E 组给予APU-E1A 5×10 pfu，F 组给予 APU-E1A-AR 5 789×10 pfu，G 组给予 APU-E1A-AR 5×10 pfu，H 组给予 APU-E1A-AR 5×10 pfu。每组动物给药方式均为瘤内注射，溶瘤腺病毒用 PBS 稀释，连续五天给药，共给药5次。具体分组及给药方式和剂量如表3.1. 表3.1 动物分组及给药方式 给药总量 给药种类 剂量(μL) 浓度(pfu) 给药次数 (pfu) A PBS 60 - 5 - 88B APU-LUC 60 1×10 5 5×10 77C 60 1×10 5 5×10 88D APU-E1A 60 1×10 5 5×10 99E 60 1×10 5 5×10 77F 60 1×10 5 5×10 88G APU-E1A-AR 60 1×10 5 5×10 99H 60 1×10 5 5×10 3.2.3 动物观察方法与指标 注射了不同剂量溶瘤腺病毒 APU-E1A、APU-E1A-AR和APU-LUC的动物隔天观察其一般行为学表现，并进行记录，主要观察指标有一般观察、感觉 30 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 神经检查、运动神经检查、四肢的检查、植物神经检查以及局部反应检查。所有指标均采用双盲的方法进行观察和记录。 3.2.3.1 一般观察 注意小鼠是否有异常竖尾、是否出现多动、惊厥、震颤、痉挛、僵直、攻击行为。是否对刺激反应迟钝或过敏，有无蜷缩、活动减少、嗜睡及拒食、体重下降，有无腹泻或出现扭体反应。 3.2.3.2 感觉神经检查 痛觉检查:针刺检查面部、颈部、躯干、四肢、尾巴部位皮肤，每个部位每次至少刺激2点。以肌肉回缩或躲避反应为指标观察有无痛觉反应迟钝或过敏现象。 3.2.3.3 运动神经检查 (1)眼:注意瞳孔大小有无变化(每次观察的光线强弱应一致)，有无眼睑下垂，测瞳孔对光反应是否灵敏，角膜反射是否正常。 (2)口:有无啃咬食物困难，有无口腔溃疡，门牙过长。 (3)前庭功能:观察是否出现旋转，步态是否正常。 (4)颈:是否出现颈强直，颈后仰，斜颈或其他强迫性头位。 (5)呼吸肌运动:观察呼吸频率及幅度有无明显变化。 3.2.3.4 四肢 (1)一般观察:是否出现步态不稳、跛行、行走困难，是否出现刻板样运动，是否有姿势异常。 (2)四肢检查:与正常对照组动物比较观察。弯曲前后肢关节，检查肌张力的变化。牵拉后肢，以回缩反应为指标，观察肌力变化。观察是否出现肌强直，肢体抽搐，肌束颤动现象，是否出现肌萎缩。 3.2.3.5 植物神经检查 (1)眼睑:注意两侧睑裂，是否对称，观察是否有眼睑下垂。 (2)腺体分泌检查:将滤纸放口角旁，接触口角，收集唾液，观察是否有流涎过多现象。观察是否出汗(皮毛湿润)，是否流泪。 (3)皮肤及粘膜:观察皮肤是否有异常脱毛，有无皮肤水肿或溃疡，有无脱趾或足底溃疡形成。 (4)膀胱:按压下腹部，检查膀胱膨胀程度，是否有尿潴留现象。 31 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 (5)胃肠运动:是否有腹胀、腹泻。如有消化系统症状，应排除其他原因引起的消化功能紊乱。 3.2.3.6 局部反应 局部反应在第一次给药后及其后每日给药前观察。 观察注射部位皮肤表面是否出现皮疹、硬结，有无肿胀和出血点。触摸注射部位，观察是否有痛觉过敏现象。 3.2.4 动物处死 所有动物在溶瘤病毒注射完后观察满 7w 后，用颈椎脱臼的方法处死。进行下一步的实验。如动物存活时间达不到 7w, 则记录死亡时间，并随时处死取材。 3.2.5 统计分析 实验数据用“”的方式表示，结果用 SPSS15.0 进行统计学处理，用单因x,s 素方差分析进行统计学分析，显著性差异定义为 p<0.05, 并在图中用 * 标明。结果分析图用 Sigmaplot 11.0 合成制作。 3.3 实验结果 3.3.1 膀胱癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立 6 我们用培养的生长状况良好的人膀胱癌细胞 EJ 细胞 5×10一次性在裸鼠背部皮下注射，95% 的裸鼠均在 1w 后长出肿瘤。如图3.1。 图3.1 膀胱癌皮下移植瘤模型 32 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 3.3.2 动物一般状况观察 膀胱癌皮下移植瘤模型建立成功后，每日测量并记录肿瘤体积，待肿瘤体积 3-150mm 时，按照随机分组的结果，进行不同剂量溶瘤腺病毒的瘤内注达到100 射。隔日观察动物一般状况，按照标准操作规程设计表格，并详细记录。结果表 明，在给予溶瘤腺病毒后 7w 的时间里，两种效应溶瘤腺病毒 789(APU-E1A-AR,APU-E1A)的三个剂量组(5×10pfu,5×10pfu,5×10pfu)注射后 的动物一般状况良好，动物没有异常的中枢兴奋行为，如躁动、跳跃、震颤、惊 厥等表现，也没有异常的中枢抑制反应，如反应迟钝、嗜睡、昏迷等反应，共济 运动协调，眼、腺体分泌正常，骨骼肌活动正常，皮肤、消化道、泌尿系统、痛 觉反射、呼吸运动均属正常。见表3.2，表3.3. 表3.2 动物一般临床症状观察记录表-1 编 中枢兴奋 中枢抑制 共济运动 眼 腺体 号 刻 反共平步瞳瞳眼板 躁跳竖惊震蜷嗜昏昏应旋济衡态斜孔孔睑流流多 样动 跃 尾 厥 颤 缩 睡 睡 迷 迟转 失失不颈 散缩下泪 涎 汗 运 钝 调 调 稳 大 小 垂 动 1 × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × 2 × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × 3 × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × 4 × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × 5 × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × 6 × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × 7 × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × 8 × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × 备注:无 33 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 表3.3 动物一般临床症状观察记录表-2 编 骨骼肌 皮肤 尿 消化道 痛觉 呼吸运动 号 肌肌 肌机肌异痛痛呼呼呼张张尿不 力体束常竖溃脱皮尿便扭腹黑觉觉吸吸吸 力力潴规减抽颤脱毛 疡 趾 疹 血 秘 体 泻 便 过迟加减加 增减留 则 退 搐 动 毛 敏 钝 快 慢 深 强 弱 1 × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × 2 × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × 3 × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × 4 × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × 5 × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × 6 × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × 7 × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × 8 × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × 备注:无 注:对以上症状，有划“?”，无划“×”。如需特别说明，则在备注栏中另填写。对阳性表现， 应记录出现时间、消失时间。也可根据实验内容自行添加栏目。由于篇幅所限，本文中只列 出8只动物的编号，具体试验中需对每只动物列表记录。 3.3.3 动物体重的变化评估 每组动物给予溶瘤腺病毒(APU-E1A-AR、APU-E1A)的三个剂量组 7898(5×10pfu,5×10pfu,5×10pfu)及APU-LUC(5×10pfu)注射后，隔日称重，观 察动物体重的变化情况。结果显示注射了APU-E1A-AR，A PU-E1A的动物，随 着剂量和时间的增加，动物体重均稳步上升，而注射了 PBS 和 APU-LUC的动 物在最初三周内体重增加，而在第21天之后体重开始下降。如图3.2。 34 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 8 PBS APU-LUC 5×10 pfu 77APU-E1A-AR 5×10 pfu pfu APU-E1A 5×108 8APU-E1A-AR 5×10 pfu APU-E1A 5×10 pfu 3089APU-E1A-AR 5×10 pfu APU-E1A 5×10 pfu 28 26 24 22 20 18 16 Body weight (g) after adenovirus injection0714212835424956 Day 图3.2 溶瘤腺病毒注射后动物体重变化图 注:图中表示的是从溶瘤腺病毒注射开始到56天，动物的平均体重变化。每组5-10只动物，用 “” 的方式表示，PBS (Phosphate-buffered saline)作为对照。 x,s 3.4 讨论 3.4.1 膀胱癌动物模型的建立 基于道德、伦理、人道及法律的理由，许多研究不可能、也不允许在人体进行实验，需要借助动物模型来进行初期的实验研究。建立膀胱癌动物模型，可以避免对人体造成危害，且可在较短的时间里复制出足够数量的研究对象，简单而又方便地获得各种测试样品。使用动物肿瘤模型可以更全面地认识肿瘤的本质，并且能够在人工控制的条件下进行，通过对动物及实验影响因素的控制，可增加方法学上的可比性，使人们对膀胱癌的发病机理及治疗手段有进一步的认识。膀胱癌动物模型的建立方法主要有三种:诱发型动物模型、自发性动物模型和移植瘤动物模型。 (1)自发性动物模型:一些动物在自然条件下由于基因突变等原因会自然出现类似人类肿瘤的表现，这些自然获得性动物模型的优点是其完全在自然条件 35 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 下发病，排除了人为的因素，疾病的发生、发展与人类相应的遗传性疾病十分相[82, 83]似。但这类动物模型发现的种类有限，来源困难，而且疾病动物饲养条件较高，存在费时、费力、成本较高、重复性较差等不足。另外，自然获得性动物肿瘤与人类肿瘤所发生的类型和发病机制有的也有差异。 2)诱发型动物模型:最常使用的诱导肿瘤的方法是化学致癌剂诱导法，( 常用的致癌剂为硝胺类诱发剂，如亚硝胺(BBN)、甲硝铵(FANFT)、甲基 [84]亚硝基脲(MNU)等。Yamamoto 等选用了14 只 7 周龄的小鼠，分为四组(第一组:4 只嵌合体雄性小鼠;第二组:10 只嵌合体雌性小鼠;第三组 10 只 CH 小鼠;第四组:8 只BLAB/c 小鼠)，分别给予含有 0.05% 亚硝胺的饮用3 水进行喂养，第一组在喂养后 20 w 处死，第二组在喂养后 21-25 w 处死，第三组在喂养后 26 w 处死，第四组在饮用亚硝胺水 30 w 后处死。所有动物处死后均进行组织病理分析，结果表明饮用亚硝胺水时间较短的第一组表现为膀胱组织单纯性增生;在第二组中已经观察到组织癌变，包括肾癌及膀胱癌，组织类型 移行细胞癌;在第三组和第四组中，几乎全部动物都出现了分期有鳞状细胞癌和 与分级较高的膀胱肿瘤，可能与摄入亚硝胺的量较多有关。 [85]Steinberg 等用一定剂量的 MNU 膀胱内灌注，成功诱发出大鼠膀胱肿瘤模型。研究结果表明灌注 MNU 13 w 的大鼠病理表现以膀胱内II 级或 III 级的不典型增生或乳头状移行细胞癌为主，灌注 MNU 20 w 后的大鼠病理表现为肌肉浸润性膀胱肿瘤的几率高达 83% ，且大鼠死亡率高。化学因素诱发的动物模型方法简便，致瘤率高，但诱发的动物模型与自然条件产生的疾病有所不同，如诱发性肿瘤与自发肿瘤对药物的敏感性有一定差异。故使用诱发性动物模型有一定的局限性。 (3)移植瘤动物模型:将肿瘤细胞或肿瘤组织移植到动物体内，建立移植瘤动物模型在肿瘤学的研究中也比较常用，尤其在抗肿瘤药物的药效学研究、肿瘤机制的研究中较为常用。根据移植途径及部位的不同，常用的有皮下移植和原位移植。根据移植方式可将移植瘤动物模型分为两种:将动物来源的肿瘤细胞移植到动物体内的同种移植瘤模型，以及将人体来源的肿瘤细胞移植到动物体内的异体移植瘤模型。 同种移植瘤模型是肿瘤化疗研究中最常用的模型，已经有研究报道的鼠源性膀胱肿瘤细胞株有MB49、AY-27、BTT-T739、WYH929及MBT-2，将其移植于小鼠，可成功建立相应的膀胱肿瘤模型。这种移植方法可避免异种间严重的免疫排斥反应，因此成功率较高，同时可在同一品系动物中连续移植，且试验周期较 [86]5短。Jiang等报道将 1×10/20μL 膀胱癌细胞 MBT-2 细胞注射入 C3H/He 小鼠的膀胱黏膜下层，建立原位膀胱肿瘤模型，成功率在 4 w 后即为 100%。而 36 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 且病理结果证实这种肿瘤组织与人类膀胱肿瘤的生物学特性类似，即表现为自黏 [87]膜下层逐渐侵袭至膀胱肌层和浆膜层。Vandepitte J 等在灌注鼠源膀胱癌细胞 AY-27前，预先灌注一定量的化学药物，破坏大鼠的膀胱黏膜组织，大大增加了成瘤率，并使出现肿瘤的时间显著缩短，形成肿瘤的恶性度也相应增加，病理结 [88]果证实以非肌肉浸润性膀胱肿瘤为主。李凌 等用鼠源性膀胱癌细胞株 8BTT-T739 分别移植在 T739 小鼠膀胱壁粘膜内(2×10/20μL)和腿部皮下 6(1×10/50μL)，成功建立了皮下及原位膀胱肿瘤模型。两种模型的成功率约为 90%，在接种肿瘤细胞 1 w 后即可观察到肿瘤，且皮下肿瘤模型组动物的生存期(4-5 w) 比原位肿瘤模型组略长(3 w)。 异种移植瘤模型:由于免疫排斥反应的存在，异种移植瘤模型须将人体肿瘤组织或细胞移植于免疫缺陷动物，最常用的是裸鼠。裸鼠是一种无毛、无胸腺、T淋巴细胞缺陷的小鼠，其在肿瘤学、毒理学、免疫学等各个领域应用广泛，为 [89]人类肿瘤的研究建立了良好的平台。Li 等将三种人类膀胱癌细胞(EJ、BIU87、T24)注射到裸鼠皮下，建立皮下肿瘤模型，结果证实三种肿瘤细胞均能够成瘤，但形成肿瘤的能力不尽相同。其中 EJ 细胞的成瘤率最高，随着肿瘤的增大，会出现肿瘤部位的坏死;T24 细胞形成肿瘤的能力较弱，BIU87 的成瘤能力最弱。 [90]Hadaschik 等用 LUC 基因标记人膀胱癌细胞 KU-7 ，直接灌注打入裸鼠的膀胱内，建立了原位膀胱肿瘤模型。结果表明 4 w 后成瘤率为 96% 。 在本课题中，膀胱特异性溶瘤腺病毒依赖人尿路上皮启动子UP?而构建，因此我们选用人膀胱肿瘤细胞 EJ ，为避免异种免疫排斥反应，以裸鼠为移植对象，建立皮下膀胱肿瘤模型。结果表明 95% 的裸鼠在接种肿瘤细胞 1w 后长出肿瘤，证实了这种膀胱肿瘤模型建立的可行性。由于裸鼠的膀胱较小，建立原位肿瘤模型的难度较大，成功率较低，故在本课题中未建立膀胱癌原位肿瘤模型，待日后课题经费允许、设备齐全时可考虑利用 LUC 标记膀胱肿瘤细胞，在预先破坏膀胱粘膜内皮的情况下，建立原位肿瘤模型，利用小动物活体荧光成像系统实时监测肿瘤的生长情况。 在本课题的生物性分布和安全性评价中，我们选用瘤内注射的方式，因为瘤内注射将是今后溶瘤腺病毒进入临床实验中最主要的给药方式之一。故这种评价能够给日后的临床实验提供一定理论依据。 3.4.2 溶瘤腺病毒 APU-E1A-AR,APU-E1A 瘤内注射后的一般行为学表现和体重变化分析 我们构建的膀胱组织特异性的溶瘤腺病毒 APU-E1A-AR,APU-E1A在前期的细胞分子及动物体内研究中均已证实对膀胱肿瘤的杀伤效应，且对于 AR 阳 37 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 性的膀胱肿瘤细胞，APU-E1A-AR 的溶瘤效应强于 APU-E1A。APU-E1A-AR 中主要有四处基因改造以实现了膀胱肿瘤的靶向性和抗肿瘤效应:E1A 是腺病毒复制及发挥溶瘤作用的主要元件;UP?启动子使得腺病毒只在膀胱肿瘤细胞内复制而在其他部位正常细胞内不复制，从而实现了治疗的靶向性;PSCAE 作为增强子用于增强 UP? 启动子的活性;将 AR 和 E1A 基因融合至于 UP? 启动子的下游，可以使溶瘤腺病毒在 AR 阳性的膀胱肿瘤细胞内发挥进一步的溶瘤效应。在前期研究中已经证实这两种溶瘤腺病毒对膀胱肿瘤细胞 T24，5637，BIU87及EJ的杀伤作用，同时通过流式细胞仪和TUNEL的分析证实了溶瘤病毒感染肿瘤细胞后存在的凋亡反应，揭示了可能存在的机制。另外，前期研究也证实 7了这两种溶瘤病毒在动物体内的抗肿瘤效应。结果表明 5×10 pfu的溶瘤腺病毒即可产生明显的抗肿瘤作用，并延长裸鼠的寿命。 在本课题的研究中，我们对溶瘤病毒在动物体内的生物性分布和安全性评价 7进行研究，溶瘤腺病毒的剂量增加至有效剂量的10倍和100倍，即采取 5×10 pfu、 895×10 pfu 三个剂量梯度，在成功建立裸鼠皮下移植瘤的基础上，给 pfu、5×10 予瘤内注射，按照新药临床前安全性评价实验准则，设计相关表格，进行安全性评价。结果显示三个剂量组的动物在为期 7w 的观察时间内一般状况均良好，动物没有异常的中枢兴奋行为，如躁动、跳跃、震颤、惊厥等表现，也没有异常的中枢抑制反应，如反应迟钝、嗜睡、昏迷等反应，共济运动协调，眼、腺体分泌正常，骨骼肌活动正常，皮肤、消化道、泌尿系统、痛觉反射、呼吸运动均属正常。而未给予溶瘤腺病毒的对照组动物随着时间的增长，肿瘤体积不断增大，逐渐出现恶病质，死亡率高。 在对裸鼠的体重进行监测后发现，随着时间的增加，APU-E1A-AR,APU-E1A 注射组的动物平均体重均有所上升，而 APU-LUC 和 PBS 注射组的动物平均体重在前 3w 内有所增加，而在 3w 后开始下降。这一现象可能与 APU-LUC 和 PBS 没有抗肿瘤作用有关，随着动物皮下移植瘤体积的增加(部分移植瘤甚至出现破溃，流血，结痂)，动物于 3w 后开始出现恶病质，极度消瘦，所以体重下降。 3.5 结论 (1)用人膀胱癌 EJ 细胞建立裸鼠皮下移植瘤模型可行，方法简便，成瘤 6率高，5×10 个 EJ 细胞背部皮下注射后 1 w 的成瘤率为 95%。可为瘤内注射提供一种可靠的膀胱癌动物模型。 7(2)膀胱癌组织特异性溶瘤腺病毒 APU-E1A-AR,APU-E1A 在 5×10 pfu、 38 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 895×10 pfu、5×10 pfu 剂量瘤内注射后，动物一般状况良好，没有异常的中枢兴奋行为，如躁动、跳跃、震颤、惊厥等表现，也没有异常的中枢抑制反应，如反应迟钝、嗜睡、昏迷等反应，共济运动协调，眼、腺体分泌正常，骨骼肌活动正常，皮肤、消化道、泌尿系统、痛觉反射、呼吸运动均属正常。 39 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 第四章 动物的血液学和病理学检测 溶瘤腺病毒瘤内注射后，除了在一段时间内观察动物的一般行为学表现和体重变化外，为了评价动物在给予受试物后由于蓄积作用而对机体产生的毒性反应和其严重程度，提供毒性反应的靶器官，本课题对动物进行了系统的血液毒理学和病理学研究，通过血液学中淋巴细胞占白细胞的百分比、血小板(PLT)检测、血液生化中谷草转氨酶(AST)谷丙转氨酶(ALT)的检测，以及观察各主要脏器的大体形态学变化、脏器系数(各种脏器占动物体重的百分比)的计算、H&E和免疫组化染色后镜下形态学的变化，系统评价溶瘤腺病毒不同剂量注射后在血液学及病理学方面的安全性。 4.1 实验材料 4.1.1 主要试剂 (1)AST 和 ALT 检测试剂盒(Merit Choice Bioengineering, Beijing, China)。 (2)4% 多聚甲醛(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，中国)。 (3)鼠抗人 5型腺病毒 E1A多克隆抗体，antiadenovirus-5 E1A (santa Cruz Bioctechnology)。 (4)免疫组化染色试剂盒(通用型):SP-9000，北京中山金桥生物科技有限公司。 (5)二氨基联苯胺:DAB,3, 3-diaminobenzidine (Sigma)。 (6)DAB 显色试剂盒:博士德生物有限公司。 (7)枸橼酸盐缓冲液(0.01M,pH6.0):北京中山金桥生物科技有限公司。 4.1.2 主要仪器和设备 (1)离心机:Biofuge 15R, Heraes,德国; (2)动物全自动生化分析仪:Auto Biochemical Analyzer (Hitachi 7060, 日本); (3)动物血液分析仪:Animal blood analyzer (HEMAVET 950, 美国); (4)轮转式切片机:RM2015,LEICA,德国; (5)组织包埋机:EG1160，LEICA,德国; 40 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 (6)显微镜:Olympus AX80,日本; (7)图像分析系统:Image-Pro Plus (IPP 5.1)，美国; (8)动物解剖所需器械:毛剪，组织钳，组织剪，组织镊，眼科剪，眼科镊等各若干把; 9)电子分析天平:BS400S-WEI，北京赛多利斯。 ( 4.2 实验方法 4.2.1 动物血液的采集和血液学分析 (1)各组动物在给予不同剂量溶瘤腺病毒和 PBS 注射后 7w，用乙醚吸入法进行麻醉。 2)用摘眼球法采集裸鼠血液:待动物麻醉好后，徒手固定使一侧眼球突( 出，用眼科弯镊迅速摘下小鼠眼球，并分别收集 2 管血液到 2 mL eppendorf 管中，其中一管预先加入抗凝剂(KEDTA或KEDTA)，放置15-20min，并在15min32 冰到4h 内测试，用于血液细胞学分析;另一管不加抗凝剂，分别标记并置于 4?箱中进行下一步生化分析。 (3)血液细胞学分析:收集到的动物抗凝血用全自动动物血液分析仪分析淋巴细胞占白细胞的百分比、血小板(PLT)的数量。 (4)血液生化分析:收集到的动物血液用离心机 1000rpm 离心 10 min，用微量移液器收集 0.2 mL 上层血清，用动物全自动生化分析仪分析血液生化中谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)的含量。 4.2.2 动物主要脏器的采集和大体观察 (1)动物血液采集完成后，颈椎脱臼处死动物，并立即解剖，解剖时注意分别使用不同的器械和不同的容器，以免出现交叉污染。解剖时从最不容易感染腺病毒 E1A 基因的器官开始，最后解剖皮下移植瘤组织。基本顺序为:睾丸、精囊腺、肾、脾、胃、心、肺、脑、甲状腺、膀胱、肝、肿瘤。这些组织均被分成两部分置于不同的容器内，一部分置于 4% 多聚甲醛中进行固定，用于 H&E 染色和免疫组化染色后的镜下观察，另一部分置于冻存管中，放置于液氮罐中，用于组织中 RNA 及蛋白的提取。 (2)大体检查:动物处死后，在收集各主要器官的同时，肉眼观察各器官的大体形态学变化。头颈部的解剖时注意:甲状腺有无出血，脑表面有无出血，坏死，有无脑萎缩，垂体有无出血，视神经有无萎缩;胸腔解剖时注意:胸腔内有无渗液，如有渗液，应估计渗液量，描述颜色、性质。心、肺有无肿大，有无 41 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 出血，有无感染灶。腹腔解剖病检要点:腹腔内有无渗液，如有渗液，应估计渗液量，描述颜色、性质。肾及肾上腺有无肿大、出血、或体积缩小，肾表面有无坏死，有无结节，肾色泽是否正常。肝是否肿大，色泽是否正常，表面是否有结节、出血、坏死，是否发黄。阴囊是否有水肿，睾丸是否出血，有无坏死，萎缩。膀胱内有无出血，精囊腺是否肥大，萎缩，出血。胃肠的解剖需注意:胃内有无出血，粘膜表面有无溃疡，肠壁有无出血、坏死，淋巴结有无肿大，是否有肿瘤转移灶等。 4.2.3 动物脏器系数的计算 各组动物在处死后取心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、睾丸、精囊腺、甲状腺、膀胱等器官称重，除以动物体重，计算脏器系数。 4.2.4 动物脏器的镜下观察 4.2.4.1 H&E染色 (1)脱水、透明:取已用 4% 多聚甲醛固定好的动物各主要脏器，依次用 %、80%、95%乙醇?、95%乙醇?、无水乙醇?、无水乙醇?溶液对浓度为 70 组织块进行脱水，尽量完全除去组织块中的水份。将脱水后的组织先用乙醇-二甲苯混合液处理10 min，再浸入透明剂二甲苯中20 min, 将组织透明。 (2)浸蜡包埋:标本经过三道熔化的石蜡浸渍，使组织中的透明剂完全被置换出来。包埋在全自动组织包埋机上进行。先将蜡液注入包埋模具中，迅速将组织块平放入蜡液内，摆正并取平，然后移至冷却台，将组织块同蜡液凝固在一起。 (3)切片与贴片:将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，厚度一般为5-8μm。 (4)脱蜡染色:用二甲苯脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度酒精，最后入蒸馏水，即可染色:先将切片放入苏木精水溶液中染色10min;在酸水及氨水中分色，各10s;用流水冲洗切片1h 后放入蒸馏水5 min;加入70%和90%的酒精，脱水各10min;最后用酒精伊红染色液染色3min。 (5)脱水透明:染色后的切片经无水乙醇脱水，再经二甲苯使切片透明。 (6)封固:将已透明的切片滴上加拿大树胶，盖上盖玻片封固。待树胶略干后，贴上标笺，置于显微镜下观察。 4.2.4.2 免疫组化染色 (1)脱蜡:将浸蜡包埋的切片放置于60?的烤箱中，烘烤过夜; 42 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 (2)二甲苯脱蜡及梯度酒精水化:将切片分别置于二甲苯?中10min，二甲苯?中 10min，无水酒精?中5min，无水酒精?中 5min，95% 酒精?5min，95% 酒精?5min，85% 酒精5min。用pH7.4的PBS冲洗3次，每次3 min; (3)抗原修复:在微波盒中加入一定量的枸橼酸钠缓冲液(pH6.0)，置 炉中将其加热至沸腾，将切片置于沸腾的枸橼酸钠缓冲液中，在微波炉于微波 中继续加热10min，待其自然泠却后，从缓冲液中取出切片，用ddHO将切片2连续冲洗3次，再用配置好的PBS缓冲液冲洗切片3次，每次3min; (4)阻断内源性过氧化物酶的活性:在每张切片上滴加3% HO，并放置22在室温下孵育10min。然后用PBS缓冲液漂洗切片3次，每次3min; (5)封闭:在每张切片上滴加适量山羊血清封闭液，放置于室温下孵育20min。然后用PBS缓冲液漂洗切片3次，每次3min; (6) 抗原抗体反应:吸干切片上的PBS缓冲液，在切片上滴加适量相应的第一抗体(polyclonal antibody antiadenovirus-5 E1A，1:50稀释)，置于湿盒，4?过夜。 (7)取出湿盒，在室温下放置40min。然后用PBS缓冲液漂洗切片3次，每次5min。 (8)二抗反应:吸干切片上的PBS缓冲液，并滴加二抗(生物素标记的羊抗鼠IgG)，在37?条件下孵育15min。然后用PBS缓冲液漂洗切片3次，每次5min; (9)将适量辣根酶标记的链酶卵白素工作液(1:500稀释)滴加至每张切片上，在37?条件下孵育15min, 然后用PBS缓冲液漂洗切片3次，每次5 min; (10)显色:吸干切片上的PBS缓冲液，将适量DAB显色液(二氨基联苯胺)滴加至每张切片上，并在显微镜下观察5-10min; (11)复染和分化:先用ddHO冲洗切片，然后滴加苏木素进行切片的复2 染，再用0.1%HCl脱去多余的颜色进行分化; (12)返蓝:用ddHO冲洗完全除去酸而中止分化后，再加入0.1%氨水将2 切片进行蓝化，使苏木素染上的细胞核呈蓝色; (13)干燥封固:用梯度酒精将以上染色完全的切片脱水干燥，并再次用二甲苯透明，然后用中性树胶进行封固，最后在室温条件下晾干，即可在显微镜下观察并采集图像。 4.2.5 统计学分析 实验数据用“”的方式表示，结果用 SPSS 15.0 进行统计学处理，用单x,s 因素方差分析进行统计学分析，显著性差异定义为 p<0.05, 并在图中用 * 标明。 43 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 结果分析图用 Sigmaplot 11.0 合成制作。 4.3 结果 4.3.1 动物的血液学分析 789 不同剂量(5×10 pfu、5×10 pfu、5×10 pfu)的溶瘤腺病毒 APU-E1A、 8APU-E1A-AR 及APU-LUC(5×10 pfu)瘤内注射裸鼠后7w，动物麻醉后采血进行血液学(淋巴细胞占白细胞的百分比、血小板)和血液生化(谷草转氨酶、谷丙转氨酶)分析。结果显示与对照组(PBS)相比，各剂量组溶瘤腺病毒注射后的动物淋巴细胞占白细胞的百分比、血小板数值均在正常范围(图4.1A,B)。 78低剂量和中剂量溶瘤腺病毒注射组(5×10 pfu、5×10 pfu)动物的谷草转氨酶 9(AST)、谷丙转氨酶(ALT)在正常范围，而高剂量注射组(5×10 pfu)两者出现了轻微的升高(图4.1C)。 8PBS pfu APU-LUC 5×1010077APU-E1A-AR 5×10 pfu pfu APU-E1A 5×10 88APU-E1A-AR 5×10 pfu APU-E1A 5×10 pfu A 99APU-E1A-AR 5×10 pfu APU-E1A 5×10 pfu 80 60 % 40 20 0 Lymphocytes 8 pfu APU-LUC 5×10PBS 77 pfu APU-E1A 5×10APU-E1A-AR 5×10 pfu 8008 8APU-E1A 5×10pfu APU-E1A-AR 5×10 pfu 99APU-E1A 5×10 pfu APU-E1A-AR 5×10 pfu B 600 400K/ul 200 0 Platelets 44 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 8PBS pfu APU-LUC 5×1010077 pfu APU-E1A-AR 5×10APU-E1A 5×10 pfu C 88 pfu APU-E1A-AR 5×10 pfu APU-E1A 5×1099 pfu APU-E1A-AR 5×10 pfu APU-E1A 5×10 80*** * 60 U/L 40 20 0 ASTALT 图4.1 不同剂量溶瘤腺病毒注射后动物的血液学分析 注:A.白细胞中淋巴细胞的平均百分比;B.血小板的平均数值;C. 谷草转氨酶(AST)、 x,s谷丙转氨酶(ALT)的平均值。PBS组作为对照。每组5-10只动物，检测结果用“”来表示，P<0.05 表示差异有统计学意义，在图中用*表示。 4.3.2动物主要脏器的大体观察及脏器系数 789不同剂量(5×10 pfu、5×10 pfu、5×10 pfu)的溶瘤腺病毒 APU-E1A、 8APU-E1A-AR 及APU-LUC(5×10 pfu)瘤内注射裸鼠后7w，处死动物取其主要脏器。通过解剖和大体观察未发现心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、睾丸、精囊腺、甲状腺、膀胱等器官有出血、坏死、肿大等异常现象。 称量各组动物体重和主要器官重量，计算平均脏器系数，与对照组相比，统计没有显著性差异，如图4.2。 45 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 6 PBS APU-LUC 5×1058 pfu 7 pfu APU-E1A-AR 5×108 pfu APU-E1A-AR 5×104 9 pfu APU-E1A-AR 5×107 pfu APU-E1A 5×10 8 pfu APU-E1A 5×1039 pfu APU-E1A 5×10 2 1 Organ weight relative to body size (%) organ weight (g)/body weight (g)*100%0 Heart Liver Spleen Lung 图4.2 不同剂量溶瘤腺病毒注射后动物的脏器系数 Kidney(L) Kidney(R)789注:不同剂量(5×10 pfu、5×10 pfu、5×10 pfu)的溶瘤腺病毒 APU-E1A、APU-E1A-AR 8Brain及APU-LUC(5×10 pfu)瘤内注射后动物的心(heart)、肝(liver)、 脾(spleen)、肺 Stomach( lung)、左肾( kidney(L))、右肾( kidney(R))、脑(Brain)、胃( Stomach)左 Testies(L)侧睾丸( Testies(L))、右侧睾丸( Testies(R))、膀胱(Bladder)和精囊腺(seminal vesicle) Testies(R)分别占体重的百分比。PBS 作为对照。每组5-10只动物，检测结果用“”来表示，P<0.05x,s Bladder 表示差异有统计学意义，在图中用*表示。 seminal vesicle4.3.3动物脏器的镜下观察(H&E染色和免疫组化染色) 789 不同剂量(5×10 pfu、5×10 pfu、5×10 pfu)的溶瘤腺病毒 APU-E1A及APU-E1A-AR瘤内注射后动物的各主要脏器分别用H&E和免疫组化染色，在显微镜下观察其变化。结果显示与对照组相比，溶瘤腺病毒 APU-E1A、APU-E1A-AR 瘤内注射后导致不同程度的肿瘤组织坏死(图4.3B)，用IPP5.1分析平均坏死面积，与对照组相比，有统计学差异，且溶瘤腺病毒的剂量越大，坏死的范围越大(图4.3A)。各剂量组溶瘤腺病毒注射后的动物其他主要脏器(肝、肺、脑)H&E染色结果均为正常(图4.3C、D、E)。免疫组化结果显示肿瘤组织内 E1A表达阳性，且溶瘤腺病毒的剂量越大，阳性反应越明显(图 94.4 A、B、C)。高剂量(5×10 pfu)APU-E1A-AR注射后动物其他主要器官(肝、肺、心、脑、脾、肾)免疫组化染色未检测到腺病毒E1A的表达(图4.4 D、E、F、G、H、I)，如图4.3，4.4所示。 46 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 A 图4.3 溶瘤腺病毒注射后动物主要脏器的H&E染色观察(×400) 789注:A. 不同剂量(5×10 pfu、5×10 pfu、5×10 pfu)的溶瘤腺病毒 APU-E1A、APU-E1A-AR 瘤内注射后导致不同程度的肿瘤组织坏死，用IPP5.1分析平均坏死面积;B、C、D、E分 9别为5×10 pfu APU-E1A-AR注射后动物的移植瘤组织、肝、肺、脑的H&E染色的镜下观察。B图中的肿瘤坏死区域用圆圈标出。PBS 作为对照。每组5-10只动物，检测结果用“”来表示，P<0.05表示差异有统计学意义，在图中用*表示。 x,s 47 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 图4.4 溶瘤腺病毒注射后动物主要脏器的免疫组化观察(×400) 8注:A、B、C分别为对照组、溶瘤腺病毒APU-E1A-AR(5×10 pfu)注射组、APU-E1A-AR 99(5×10 pfu) 注射组的肿瘤组织免疫组化染色结果;D、E、F、G、H、I分别为高剂量(5×10 pfu)APU-E1A-AR注射后动物的肝(Liver)、肺(Lung)、心(Heart)、脑(Brain)、脾(Spleen)、肾(Kidney)的免疫组化染色结果。 4.4 讨论 4.4.1动物各主要脏器的大体形态学变化、脏器系数分析 在新药的临床前安全性评价中，对受试动物进行解剖、尸检，肉眼观察各 7脏器的变化是必不可少的一个环节。在本课题中，我们用不同剂量(5×10 pfu、 895×10 pfu、5×10 pfu)的溶瘤腺病毒 APU-E1A及APU-E1A-AR瘤内注射裸鼠后7w,处死动物取其主要脏器。通过解剖和大体观察未发现心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、睾丸、精囊腺、甲状腺、膀胱等器官有出血、坏死、肿大等异常 9现象。说明溶瘤腺病毒APU-E1A和APU-E1A-AR 在5×10 pfu剂量范围以内瘤内注射没有造成各主要器官肉眼可见的损害。 脏器系数即脏体比，是动物某种脏器的重量与其体重的比值。正常情况下各脏器与其体重的比值为一恒定数值。在动物染毒后，脏器受损，其重量发生改变，因此脏器系数也随之改变。脏器系数增加，一般表示脏器水肿、充血或 48 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 肥大增生等;脏器系数减小，一般表示脏器萎缩或其他退行性改变。在安全性评价实验中一般选用肝、脑、肾、脾、肺、心、睾丸等主要脏器组织计算其脏器系数，也可根据具体实验要求进行选择。评价实验结果时应与对照组进行比较，并进行相应的统计学处理。脏器系数是安全性评价的毒理学实验中常用的指标。此法简便易行，而且较为敏感。在本课题中，我们测量计算了不同剂量 789(5×10 pfu、5×10 pfu、5×10 pfu)的溶瘤腺病毒 APU-E1A、APU-E1A-AR 及 8APU-LUC(5×10 pfu)瘤内注射后动物的心、肝、 脾、肺、左肾、右肾、脑、胃、左侧睾丸、右侧睾丸、膀胱和精囊腺的脏器系数。与对照组相比，统计学差异没有意义，这一结果与我们肉眼观察到的表现一致。 4.4.2 血液学分析 有研究报道瘤内注射溶瘤腺病毒后会导致一定程度的血清中转氨酶的升 [91, 92]高，肝脏的损伤以及体重的下降。本课题中，在一般临床表现、行为学观察、主要脏器的肉眼观察、脏器系数及淋巴细胞占白细胞的百分比、血小板检测方面，我们没有检测到三个剂量组溶瘤腺病毒造成的毒性反应。但是，在高 9剂量组(5×10 pfu)溶瘤腺病毒APU-E1A-AR、APU-E1A注射后，动物血液生化中谷草转氨酶(AST)谷丙转氨酶(ALT)的指标发生了变化，与对照组(PBS) [93, 94]相比，约升高了两倍。这一结果与其他研究报道相一致。因此我们推测溶 78瘤腺病毒APU-E1A-AR、APU-E1A 在5×10 pfu、5×10 pfu瘤内注射后没有出现与病毒复制相关的毒性反应，是动物可以耐受的安全剂量范围。我们分析高剂量组的AST及 ALT的升高可能与腺病毒主要在肝脏代谢有关。 4.4.3 H&E和免疫组化染色后镜下形态学的变化分析 为了进一步观察溶瘤病毒对动物脏器的影响，我们利用不同剂量溶瘤腺病毒注射后的动物主要脏器，分别进行了H&E染色和针对腺病毒E1A基因的免疫组化染色，并在显微镜下观察。结果显示在H&E染色中，动物的移植瘤组织出现了细胞坏死，且坏死面积与溶瘤病毒的剂量呈正相关。而在动物其他主要脏器(肝、肺、脑)等中没有观察到异常。说明我们构建的溶瘤腺病毒APU-E1A-AR及APU-E1A可选择性在肿瘤组织内复制，并有效杀伤肿瘤细胞，而对其他脏器没有作用，显示一定的靶向性和安全性。在免疫组化染色结果中， 9同样在动物移植瘤中E1A表达阳性，且与腺病毒剂量呈正相关。高剂量(5×10 pfu)APU-E1A-AR注射后动物其他主要器官(肝、肺、心、脑、脾、肾)免疫组化染色未检测到腺病毒E1A的表达，进一步证实了UP?启动子和PSCAE增强子控制的溶瘤腺病毒只在膀胱肿瘤细胞中复制并发挥作用，在其他脏器中不 49 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 表达，显示了溶瘤腺病毒APU-E1A-AR及APU-E1A的靶向性和安全性。 4.5 结论 789(1)不同剂量(5×10 pfu、5×10 pfu、5×10 pfu)的溶瘤腺病毒 APU-E1A、APU-E1A-AR瘤内注射裸鼠后，动物的主要脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、睾丸、精囊腺、甲状腺、膀胱等)肉眼观察均正常，没有出血、坏死、肿大、萎缩等异常现象;脏器系数与对照组相比统计学无差别。 789(2)不同剂量(5×10 pfu、5×10 pfu、5×10 pfu)的溶瘤腺病毒 APU-E1A、APU-E1A-AR瘤内注射裸鼠后，动物血液中淋巴细胞占白细胞的百分比及血小 78板的数量均正常。血液生化检测中低剂量和中剂量组(5×10 pfu、5×10 pfu) 9谷草转氨酶(AST)谷丙转氨酶(ALT)正常，而高剂量组(5×10 pfu)AST和ALT升高了约两倍，提示在高剂量溶瘤腺病毒可能造成一定的肝脏毒性。 789(3)不同剂量(5×10 pfu、5×10 pfu、5×10 pfu)的溶瘤腺病毒 APU-E1A、APU-E1A-AR瘤内注射裸鼠后，动物主要脏器的H&E染色和针对腺病毒E1A的免疫组化染色结果证实溶瘤腺病毒APU-E1A、APU-E1A-AR只在膀胱移植瘤组织内复制和表达，在其他器官中不复制，进一步显示了溶瘤腺病毒的靶向性和安全性。 50 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 第五章 溶瘤腺病毒E1A 基因在动物体内的分布 E1A 基因是腺病毒复制并发挥溶瘤作用的关键基因，检测E1A基因及蛋白在动物各主要器官中的分布是一项评估溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布和安全性评价的主要措施。因此，在本课题中，我们采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR) 的方法检测了注射溶瘤腺病毒 APU-E1A和APU-E1A-AR的动物各主要器官中的 E1A 基因的表达情况，并采用 Western blot 的方法检测了E1A蛋白的表达情况，从而对病毒在裸鼠体内的分布进行安全性评价。此外，我们采用萤火虫荧光素酶(Luc)构建了检测病毒 Ad-PSCAE-UP?-LUC(APU-LUC), 通过检测注射了APU-LUC 的动物各主要器官组织中Luc 基因的表达，对重组溶瘤腺病毒在动物各器官内的复制情况进行检测。这种检测方法灵敏，简便，能够迅速、有效地反映重组腺病毒是否复制和表达。 5.1 实验材料 5.1.1 主要试剂 (1)RNA提取试剂盒:SV Total RNA Isolation System (Promega); (2)Trizol:Invitrogen 公司产品; (3)反转录 RT 试剂盒:PrimeScript? RT reagent Kit，大连宝生物工程有限公司; (4)Real-time PCR 扩增试剂盒:SYBR? Premix Ex TaqTM Perfect Real Time Kit，大连宝生物工程有限公司; (5)ONE-Glo荧光素酶检测试剂盒:美国Promega 公司; (6)PVDF 膜: 美国Millipore 公司; (7)BCA 蛋白定量试剂盒:北京Applygen 公司; (8)Western blot 用一抗: Adenovirus Type 5 E1A antibody 购自Abcam，美国;二抗:抗小鼠、抗大鼠IgG(博士德生物)。 (9)琼脂糖: 购自大连宝生物公司(TAKARA); (10)TEMED(四甲基二乙胺):碧云天，中国; (11)DEPC(焦碳酸二乙酯):上海生工生物科技有限公司; (12)100bp DNA Maker: 购自大连宝生物公司(TAKARA); 51 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 (13)上样缓冲液:购自大连宝生物公司(TAKARA); (14)SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液(5X):Beyotime，中国; (15)RIPA 裂解液:北京百泰克生物技术有限公司，中国。 5.1.2 主要溶液配制 (1)凝胶电泳缓冲液(50×TAE):称取Tris碱 242g，冰乙酸 57.1mL，0.5mmol/L EDTA (pH8.0) 100mL，加入 ddHO 至 1000mL，制成储存液。在使2 用时稀释成 1×TAE。 (2)溴化乙锭(EB)溶液(10mg/mL):在 20mL ddHO 中溶解 0.2g EB 2 干粉，保存于棕色瓶中，备用。 (3)琼脂糖溶液(1.0%):量取 50×TAE 10mL，用 ddHO 稀释成 500mL，2 量取 50mL 溶解 0.5g 琼脂糖，微波炉加热至沸腾，使琼脂糖完全融化，冷却至 50-60? 时加入 10mg/mL EB 2.5μL，使其终浓度为 0.5μg/mL。将梳子插入电泳槽，再将琼脂糖溶液缓慢均匀倒入，避免气泡的产生。等琼脂糖完全凝固后，轻轻拔出梳子，在加样孔中加样电泳; (4)聚丙烯酰胺溶液(30%):在 37? 条件下，在 100mL ddHO 中充2分溶解 29.0g 丙烯酰胺和 1.0g N, N-亚甲双丙烯酰胺，置于棕色瓶内，保存于室温，备用。 (5)SDS溶液(10%):在 10mL ddHO 中完全溶解 SDS干粉 1g，在室2 温条件下保存。 (6)过硫酸铵(10%，AP):ddHO 1.0mL 内溶解 0.1g AP，4?保存。 2 (7)分离胶(10%，10mL):30%丙烯酰胺3.3mL，ddHO 4.0mL，1.5mol/L 2 Tris-Cl (pH 8.8) 2.5mL，10% SDS 0.1mL，10% AP 0.1mL，四甲基二乙胺 4μL。 (8)浓缩胶(5%，5mL):30%丙烯酰胺溶液 0.83mL，ddHO 3.4mL，1.0mol/L 2 Tris-Cl (pH6.8) 0.63mL，10% AP 0.05mL，10%SDS 0.05mL，四甲基二乙胺 5μL。 (9)Tris-甘氨酸电泳缓冲液:在 1000mL ddHO 中充分溶解 30.3g Tris，2 10g SDS 和188g 甘氨酸(电泳级，pH8.3)，稀释10倍在电泳前使用。 (10)转膜缓冲液:在 800 mL ddHO 中溶解 SDS 0.37g，甘氨酸 2.9g以2 及 Tris 5.8g，再加入 200mL 甲醇溶液。 (11)丽春红染液:在 100mL ddHO 中完全溶解丽春红S 2g，三氯乙酸 2 30g，在使用前将其稀释10倍。 (12)脱脂奶粉(5%):在 100mL ddHO 中充分溶解脱脂奶粉5g，在 4?2 条件下保存。 (13)Tris-HCl缓冲盐溶液(TBS):10mmol/L Tris，0.9%(w/v) NaCl，用 52 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 HCl 调pH为7.4。 (14)Tween 20/TBS(TTBS):将Tween 20 溶液与 TBS缓冲液 1:1 混合。 5.1.3 主要仪器和设备 (1)qRT-PCR 仪:ROTOR-GEN 3000 (Cobette, 澳大利亚)。 (2)qRT-PCR 结果分析软件: Rotor-Gene Real-Time Analysis Software 6.1。 (3)水平电泳仪:DYY-III-12B，北京六一仪器厂，中国。 (4)垂直电泳仪:北京六一仪器厂，中国。 (5)脱色摇床:美国GE。 (6)三用电热恒温水浴箱:SHH.W21600，上海跃进医疗器械厂，中国。 (7)低温高速离心机:Biofuge 15R, Heraes,德国。 (8)磁力搅拌器:90型，上海沪西，中国。 (9)半干转膜装置:Hoefer TE70XP，美国。 (10)快速化学光成像系统: ImageQuant 350 GE Healthcare，美国。 (11)全自动酶标仪:BIO-TEK POWERWAVE X型，美国。 5.2 实验方法 5.2.1 qRT-PCR检测溶瘤腺病毒E1A基因在动物各脏器中的表达 5.2.1.1 引物设计 用引物设计软件(Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, Calif)针对溶瘤腺病毒 E1A 基因进行引物设计，用 GAPDH 基因作为 PCR 反应的内参。引物合成由大连宝生物公司合成。引物基因序列如下: 5.2.1.2 组织 RNA 的提取 (1)称取适量的动物组织(50-100mg); 53 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 (2)在研钵内加液氮进行充分研磨，直至成为粉末状; (3)向粉末状样品中加入1 mL trizol，充分匀浆，室温静置5min; (4)将匀浆液转移至1.5 mL的离心管中，室温静置5min; (5)加入1/3体积的氯仿，用手轻轻震荡混匀，在室温下静置5min; 6)12000g 4?离心15min，分为3层，将最上层 (水相)转移至新的( 1.5 mL离心管中; (7)加入与上清液等体积的异丙醇(0.5 mL)，上下颠倒使离心管充分混匀，室温静置10min; (8)12000g 4?离心10 min，可得少量白色沉淀, 弃上清，向沉淀中加入-20?预冷的75,乙醇1mL清洗沉淀; (9)7500g 4?离心5min，弃上清保留沉淀; (10)干燥(室温干燥5-10 min)，溶解于适量的DEPC水中(约10-20,L); (11)将RNA溶液保存在-80?冰箱中。 5.2.1.3 cDNA 的合成 用 PrimeScript? RT reagent Kit试剂盒，按照下列组分在冰上配制 RT 反应液: 反转录反应条件:37? 15min(反转录反应); 85? 5s(反转录酶的失活反应) 5.2.1.4 qRT-PCR 反应 荧光实时定量 PCR 反应按照下列组分在冰上进行配制 PCR 反应液: 54 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 Real Time PCR 反应条件如下: 95? 30s，95? 5s、60? 30s、72? 1min。30 个循环。 5.2.1.5 qRT-PCR 扩增产物的鉴定 用1.0%琼脂糖凝胶电泳，设置电压为100v，电泳 30min 后用紫外凝胶成像系统分析鉴定。 5.2.2 Western Blot检测溶瘤腺病毒E1A蛋白在动物各脏器中的表达 5.2.2.1 总蛋白的提取 (1)称取适量的动物组织(50-100mg); (2)将动物组织放在研钵内内，加入适量液氮，快速充分研磨，将组织块研磨至粉末状; 3)将组织粉末移入离心管中，加入1mL RIPA 蛋白裂解液和适量苯甲基( 磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)，在漩涡振荡器上混匀，在4?条件下静置10min。 4)10300rpm 4?离心10min，使溶液分为两相，两相中间为蛋白膜。将上( 层相和下层相的溶液轻轻吸除，将两相中间的蛋白絮状物保留。如果分层不明显，可再加入 50,L ddHO 再次离心。 2 (5)蛋白洗涤:在离心管中加入无水乙醇 1mL，在 10300rpm 4?条件下离心10min，弃上清，保留蛋白沉淀。 (6)打开离心管管口，放置于室温下，使之自然干燥，如需长期保存则置于-20?冰箱内。 5.2.2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) (1)灌胶:将两块干净的玻璃平板和 0.75 mm 的垫片组装成电泳装置中的玻璃平板夹层，固定于灌胶支架上。将 TEMED 加入到配好的 10% 的分离胶中，摇匀，立即将其沿夹层中一条垫片的边缘加入于玻璃平板夹层中，至凝胶约11 cm 高为止。然后在夹层的分离胶液面顶部缓缓加入一层水饱和异丁醇(厚约1cm)，让凝胶在室温聚合 30-60min。待胶完全凝固后，倾倒去顶层的异丁醇，并用1×Tris?Cl/SDS 缓冲液冲洗凝胶顶部表面。将配制好的 5% 的浓缩胶与 TEMED 的混匀，沿一条垫片加入到玻璃平板夹层，直至离夹层的顶部约1 cm 高为止。将 0.75 mm 厚的 Teflon 梳子插入夹层的浓缩胶液体中，让浓缩胶在室温下聚合30-45 min。待浓缩胶完全凝固后，小心拔出 Teflon 梳子，避免撕裂聚丙烯酰胺凝胶加样孔。用电泳缓冲液冲洗，并用此缓冲液充满加样孔。将凝胶板 55 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 固定到电泳装置的上缓冲液室(上槽)，同时往下缓冲液室(下槽)加入电泳缓冲液。再将上槽的凝胶板放入下槽中，并往上槽加入缓冲液直至淹没加样孔。 (2)上样:将适量蛋白溶液与 SDS 蛋白上样缓冲液混合，加入 Eppendorf 管中，并将蛋白置于100?煮沸3-5 min;用微量移液器吸取蛋白样品，缓慢加入加样孔中，使样品在孔的底部形成一薄层。 (3) 电泳:在上槽中再加入一些电泳缓冲液，使上槽的铂金电极完全被淹没。连接电源，在电压为 60V 条件下进行电泳，电泳时间根据溴酚兰指示剂的位置而定，观察当蓝色移动到分离胶底部时即可终止电泳。 (4)转膜:电泳结束后，打开玻璃板将分离胶轻轻剥下，用滤纸吸干表面电泳缓冲液，在凝胶的一角切去一小块以便在染色及干胶后仍能认出加样次序。量取凝胶的大小，并按照相应尺寸剪取相同大小的 PVDF 膜一张和滤纸若干张，将 PVDF 膜置于甲醇溶液中半小时以将其活化。转膜装置的顺序为:由下向上依次为滤纸、PVDF 膜、凝胶、滤纸，避免膜的上下与滤纸直接接触导致转膜不 2大小为(0.8mA/cm膜面积)，电压为恒压(30V)，转膜充分。转膜时的电流 时间为 1h。转膜结束后，将 PVDF 膜放置于丽春红染液中，将其染色 5min，然后用蒸馏水将膜冲洗片刻，即可在相应位置观察到膜上的蛋白条带。 (5) 免疫反应:将 PVDF 膜用 TBS 浸湿后，转移至有封闭液的平皿中，用 5%脱脂奶粉室温封闭 2h。滴加 1:1000 稀释的 E1A一抗(Adenovirus Type 5 E1A)于37?孵育2 h , TPBS 洗膜5 min ×3 次，滴加荧光标记1:2000 稀释的二抗 37? 孵育 1 h , TPBS 洗膜 5min ×3 次。ImageQuant 350 快速化学光成像系统扫描检测(GE Healthcare)。 5.2.3 LUC基因的表达检测 8(1)选取溶瘤腺病毒 APU-LUC (5×10 pfu) 瘤内注射后的动物移植瘤组织及主要器官(心、肝、脑、肺、膀胱、肾、脾、睾丸、精囊腺)，称取适量的动物组织(20-50mg); (2)加液氮进行充分研磨，直至成为粉末状; (3)加入 1×Luciferase Cell Culture Lysis Reagent (Promega, USA)，混匀; (4)以上组织液在 1000 rpm 离心10min 后，弃沉淀，将上清液移至 96 孔板中，按照 ONE-Glo 荧光素酶检测试剂盒的操作步骤，在酶标仪上进行 LUC 的检测。 5.3 结果 56 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 5.3.1 溶瘤腺病毒 E1A 基因在动物各主要脏器中的表达分析 为了评价溶瘤腺病毒 E1A 基因在动物组织内的分布，我们从不同剂量 789 pfu、5×10 pfu)的溶瘤腺病毒 APU-E1A、APU-E1A-AR 瘤(5×10 pfu、5×10 内注射后的动物主要器官(肿瘤、肝、肺、脑、心、脾、肾)中提取了总 RNA，反转录成为 cDNA，再用实时荧光定量 PCR 的方法检测了溶瘤腺病毒 E1A 基因的表达情况。用实时荧光定量 PCR 仪中的分析软件 (Rotor-Gene Real-Time Analysis Software 6.1) 分析E1A基因的相对表达量。qRT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图5.1 所示。通过软件分析对 E1A 基因进行定量的结果分析如图5.2 所示。结果表明与对照组(PBS)相比，肿瘤组织内高表达 E1A 基因(图5.1)，且随着溶瘤腺病毒剂量的增加，E1A 基因的表达量也随之增加(图5.2)，APU-E1A-AR 组 E1A 基因的表达量高于APU-E1A 组(图5.2)。在注射了溶瘤腺病毒的动物肝脏组织中，也检测到 E1A 基因的少量表达(图5.1，5.2)，但统计学分析，与对照组相比没有显著性差异。同时，在其他器官组织中，如脑、心、肾、肺、脾中，E1A 基因的表达为阴性(图5.1，5.2)。 9图5.1 高剂量组(5×10 pfu)溶瘤腺病毒注射后动物的移植瘤组织及其他主要器官组织中 E1A基因qRT-PCR扩增后的电泳图 注: A: E1A; B:GAPDH; M.Maker; 1.Tumor; 2.Liver; 3.Lung; 4.Brain; 5.Heart; 6.Spleen; 7.Kidney; 8.Tumor. 57 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 Brain 1000 Lung * Liver *800Spleen Tumor * * 600 ** 400 200 0 5×109 pfu5×108 pfu5×107 pfu5×109 pfu5×108 pfu5×107 pfuPBSRelative mean number of copies/ug DNA APU-E1A-ARAPU-E1A 图5.2 E1A 基因在动物的移植瘤组织及各主要器官(脑、肺、肝、脾)中的相对表达量 x,s注:PBS 作为对照。每组5-10只动物，检测结果用“”来表示，P<0.05表示差异有统计学意义，在图中用*表示。 5.3.2 E1A 蛋白在动物各主要器官中的表达分析 为了进一步评估病毒在不同器官中的复制和分布情况，我们用Western blot 9的方法分析了高剂量(5×10 pfu)溶瘤腺病毒注射后动物的移植瘤组织及主要器官(心、肺、肝、脑)中E1A蛋白的表达情况。结果显示只有肿瘤组织内检测到E1A蛋白的表达，在其他组织内(肝、肺、脑)均未表达，如图5.3。 图5.3 E1A 蛋白在动物各主要器官中的表达 9注:两种溶瘤腺病毒(5×10 pfu)给动物瘤内注射后的移植瘤组织(tumor)、肝(Liver)肺(Lung)、脑(Brain)中E1A蛋白的表达情况。GAPDH作为内参。 58 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 5.3.3 LUC 基因的表达分析 为了更精准、方便评价溶瘤病毒在动物体内的生物分布和安全性，我们利用 85×10 pfu)给动物瘤内LUC 构建了溶瘤腺病毒 APU-LUC。利用 APU-LUC ( 注射，通过 Luciferase Assay System 检测注射了动物的肿瘤组织及各主要器官(心、肝、肺、脑、膀胱、肾、脾、睾丸、精囊腺)中 LUC 的表达情况， 从而评估病毒的复制和在体内的分布。结果表明在肿瘤组织中 LUC 的活性较高，得到的 RLU 数值较高，而在其他组织内较低，如图5.4。 70 Firefly Luciferase 60* 50 40 30 RLU/mg Tissue20 10 0 Tumor Heart Liver Brain Lung Bladder图5.4 LUC 基因的表达 Kidney 8Spleen注:APU-LUC (5×10 pfu)给动物瘤内注射后的肿瘤组织及各主要器官(心、肝、脑、肺、 Testis膀胱、肾、脾、睾丸、精囊腺)中 LUC 的表达情况。每组动物5-10只，每次实验重复3次， Seminal Vesical 检测结果用“”来表示，P<0.05表示差异有统计学意义，在图中用*表示。 x,s 5.4 讨论 5.4.1 溶瘤腺病毒 E1A 基因和蛋白在动物体内的表达结果分析 与一般化学新药临床前安全性评价不同，在基因治疗中，除了对一般临床表 59 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 现、血液学、血液生化、组织病理学等进行评估外，还必须对相关基因的表达进行测定。实时荧光定量PCR技术在检测病毒转基因的生物分布中应用十分广泛[95]。腺病毒的 DNA 复制分为早期和晚期两个阶段。E1A 基因是腺病毒早期复制过程中最重要的转录因子之一，它与腺病毒的复制密切相关。因此，用反转录 PCR 检测 E1A RNA的表达，而不是 DNA 的表达，不仅可以说明腺病毒的存在，而且可以揭示腺病毒的早期转录和复制的状态。 因此，在本课题中，我们分别用 qRT-PCR 和 Westernblot 的方法检测了不同剂量溶瘤腺病毒注射后动物各主要脏器中 E1A 基因和蛋白的表达情况。结果表明 E1A 基因和蛋白主要在裸鼠移植瘤中表达，在动物肝脏中有 E1A 基因的少量表达(这可能与溶瘤病毒主要在肝脏代谢有关)，而在动物其他主要器官中均未表达。同剂量的溶瘤腺病毒 APU-E1A-AR 的 E1A基因的表达量比 APU-E1A 的 E1A 基因的表达量高(图5.3)，说明 APU-E1A-AR 的溶瘤效果比 APU-E1A 好，这可能与 E1A-AR 融合基因在不影响各自活性的前提下能够有效地克服两者之间的竞争性抑制作用有关。 以上实验结果进一步证实了我们构建的溶瘤腺病毒具有膀胱组织特异性，也 78初步说明了溶瘤腺病毒APU-E1A-AR、APU-E1A在 5×10 pfu、5×10 pfu 剂量瘤内注射后的近期安全性。 5.4.2 LUC 基因在溶瘤腺病毒生物分布和安全性评价研究中的应用 萤火虫荧光素酶(LUC)是能够催化不同底物氧化发光的一类酶，其灵敏度高，检测线性范围宽达7-8个数量级。因哺乳细胞无内源性荧光素酶，故最常用于哺乳细胞的报道基因。LUC 的检测简便，用荧光比色计即可检测酶的活性，因而适用于高通量筛选。 我们在溶瘤腺病毒的构建过程中使用了检测报告基因即萤火虫荧光素酶基因Luc。该基因是通过 BamHI 和 NotI 双酶切质粒 Pbk-CMV-Luc(由Ronald Rodriguez，James Buchanan Brady Urological Institute, School of Medicine，Johns Hopkins University提供)获得。此外Luc基因的序列亦可通过GenBank查询或商业途径获得。利用 LUC基因我们构建了实验所需的对照载体和特异性检测载体，即含有荧光素酶基因(Luc)的载体Rp-PSCAE-UP?-Luc。具体步骤为:?起始穿梭载体P-Shuttle CMV源于AdEasy System (Strata gene, Inc)，切除该穿梭载体内在的BamHI(1bp处)位点;?在切除位点处重新引入含有 AgeI(10298bp处),NheI(10611bp处), BamHI(1bp处)和NotI(1689bp处)位点的多克隆位点(MCS);?将 UP? 启动子插入质粒的NheI和BamHI位点, Luc插入BamHI和NotI位点，构建得到Rp-UP?-Luc;?将 PSCAE 插入到Rp-UP?-Luc 的AgeI和NheI位点构建 60 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 成载体 Rp-PSCAE-UP?-Luc。载体构建成功后，我们将Rp-PSCAE-UP?-Luc 与 pAdEasy质粒在大肠杆菌 BJ5183 菌株中进行同源重组，并在HEK293细胞中进行包装，得到 Ad-PSCAE-UP?-Luc(APU-LUC)。 8在本课题中，我们利用 APU-LUC (5×10 pfu)给动物瘤内注射，通过 Luciferase Assay System 检测注射了动物的肿瘤组织及各主要器官(心、肝、肺、脑、膀胱、肾、脾、睾丸、精囊腺)中 LUC 的表达情况，从而评估病毒的复制和在体内的分布。结果表明在裸鼠移植瘤组织中 LUC 的活性较高，得到的 RLU 数值较高，而在其他组织内较低，统计学分析有显著性差异。由此进一步说明了溶瘤腺病毒对膀胱肿瘤细胞的靶向性，也初步证实了其安全性。利用 LUC 构建检测病毒用于其生物性分布和安全性评价具有可行性和实用性，且操作简便，结果判定直观。因为这一方法在国内外的关于安全性评价的研究中未见报道，因此我们的研究结果为将这一技术应用于基因治疗的安全性评价提供理论基础和应用前景。 5.4.3 溶瘤病毒治疗肿瘤尚存在的问题及前景展望 近15年来，对于膀胱肿瘤基因治疗的研究方兴未艾。利用溶瘤腺病毒进行膀胱内灌注安全、有效、给药方便，因此，利用腺病毒载体的基因治疗对于一些对现有的治疗模式抵抗及复发率较高的膀胱肿瘤是一种很有前景的治疗策略。并且将溶瘤腺病毒与现有的治疗手段，如手术、放疗、化疗等相结合可望取得良好的治疗效果。然而，对于基因治疗仍有一些问题需要解决。最主要的 [96]影响因素就是腺病毒携带的基因能否有效转导至肿瘤靶组织。有研究已经证实病毒基因对大部分肿瘤细胞的无效或低效转染是限制溶瘤腺病毒临床疗效的主要的因素之一。 导致腺病毒转染率低的主要原因是许多肿瘤细胞表面 CAR 的表达较低。腺病毒感染细胞首先是通过CAR将病毒连接并吸附于细胞表面，然后病毒纤维蛋白中的Arg-Gly-Asp(RGD) 肽链进一步与细胞结合素结合使病毒进入细胞内。研究表明，CAR在正常上皮细胞表达丰富，而在肿瘤细胞表达稀少、完全 [97]缺乏或表达在其他的位置。膀胱癌细胞株CAR的表达与腺病毒的感染效率 [98]密切相关，CAR表达低的细胞株对腺病毒不敏感。在膀胱肿瘤中，CAR的表达与膀胱癌的分期与分级相关，分级、分期越高的肿瘤，CAR的表达水平则 [99]越低。膀胱癌的CAR表达下降将降低溶瘤腺病毒的感染能力，进而限制了 [98][99]腺病毒依靠感染肿瘤细胞而治疗癌症的能力。Li ，Sachs 等研究发现，RT4和253J膀胱癌细胞株易于感染腺病毒，而TCC和T24膀胱癌细胞株却抵抗腺病毒感染，而后检测到RT4细胞的CAR的水平是T24的20倍左右。因此如何 61 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 促进CAR的表达是溶瘤腺病毒用于有效治疗膀胱癌的瓶颈。 近几年研究表明通过对病毒结构的改造可促进其对于CAR缺陷的肿瘤细胞的感染效率。?可通过改造腺病毒纤毛的头节区从而改变腺病毒的趋向性。例如腺病毒假病毒Ad5/3就是将Ad5的头节区替换成Ad3的头节区，从而可通 [100]过不同的受体进入细胞。这种假病毒Ad5/3载体显示为CAR非依赖性感染，从而提高了CAR表达较低或不表达细胞的感染效率。?还有其他一些改变病毒对于肿瘤细胞趋向性的方法，如修饰腺病毒基因组来改变腺病毒衣壳的结合特 [101]异性，即在腺病毒纤维部分插入三肽RGD(精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸)，RGD可直接与结合素结合而进入细胞，大大提高了腺病毒的感染效率，因为大 [102, 103]多数肿瘤都表达结合素 V3和 V5 ，三肽RGD分子可结合到纤毛头节区 [104, 105]的HI环上(Ad5-?24RGD);或者在甘氨酸-丝氨酸连接序列与Ad5的头 [106]节区的C端中插入七个带正电荷的赖氨酸残基(Ad5.pK7-?24)等。?还有一 [107]种改造是在腺病毒的衣壳上衔接一个具有特异性结合亲和力的耦联蛋白，也 [108]取得了一定效果。有研究报道在间质干细胞表面CAR表达较低，提示在其他类型干细胞中，包括肿瘤干细胞，CAR的表达也较低。因此当用腺病毒载体杀伤肿瘤干细胞时，经过病毒衣壳改造的腺病毒如Ad5/3-?24，Ad5-?24RGD-4C, 或Ad5.pK7-?24等也许能够克服CAR表达较低的缺陷，从 [109, 110]而更有效进行基因传递和基因治疗。 构建嵌合型重组腺病毒载体也是一种促进溶瘤腺病毒靶向性的方法。5型腺病毒对于低表达CAR的肿瘤细胞的感染能力明显降低。而人35型(Ad35)腺病毒属于B族腺病毒，病毒受体为CD46分子而不是CAR。Zhao等将嵌合 [110]型腺病毒载体Ad5/Ad35- TRAIL转染膀胱肿瘤细胞获得了较好的溶瘤效应。 [111]另外，近几年研究发现一些辅助药物如依托泊苷，组蛋白去乙酰化酶抑 [112]制剂等可以上调膀胱癌的CAR表达水平，从而促进腺病毒对肿瘤细胞的感染。也有学者提出利用分泌性的治疗因子的策略，不要求感染所有的肿瘤细胞，因此可能比细胞内的效应更有吸引力。 近几年有研究报道应用一种新的病毒包装系统pFex进行条件复制性溶瘤 [113]腺病毒的研究，该系统与普通的pAdEasy-1系统相比，多了含有SacB区的Lox m2/66和Lox71位点，能够将较大的病毒基因组高效的包装进腺病毒纤毛区，克服了多个病毒共转染一个细胞的困难。先利用?TAYT序列敲除CAR，然后通过同向Cre/loxP位点特异性重组将六邻体多肽文库导入腺病毒基因组，在不影响其他病毒衣壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽与衣壳蛋白融合表达，融合蛋白随腺病毒的重新组装而展示在表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。然后转染 62 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 HEK 293细胞，肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，筛选阳性重组体，筛选的重组体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮筛选，经过3-5轮筛选后，可得到不依赖于CAR的高亲和力的新型溶瘤腺病毒AdTrack-FBR2-A3和AdTrack-FBR2-A4，转染CAR低表达的前列腺癌PC-3细 [113]胞，能够明显提高转染效率。而且，经过特别的病毒衣壳展示肽系统筛选后，可以增加腺病毒对肿瘤细胞的特异性，减少肝脏毒性和免疫反应。 [114, 115]同时，一些物理的屏障，如膀胱上皮的氨基葡聚糖层，基底细胞，细胞间基质，坏死组织，缺氧和高气压组织等均可影响病毒在肿瘤细胞间的有效扩散。目前已有一些研究报道了如何提高肿瘤细胞的转导效率:1)实质性地提高注射病毒后的生物利用度，即病毒在系统循环中能检测到的滴度。与病毒在体外的转导不同，腺病毒载体在血管内的分布受腺病毒受体表达的影响不太大。给小鼠静脉注射腺病毒后发现病毒主要聚积在肝脏、脾、心、肺和肾脏，最后大部分 [116]在肝脏内代谢;2)排除一些组织特异性的巨噬细胞对病毒的影响，如肝脏中的Kupffer细胞可以清除血液中的腺病毒。 另一个限制溶瘤病毒作用的因素就是体内针对病毒蛋白的中和抗体的激活，这些中和抗体可以阻碍腺病毒再次系统注射后的作用。可能的解决方法有:1)用另一种血清型的腺病毒进行二次系统注射;2)通过腺病毒纤毛头节区的细微改造使其逃脱已经存在的特异性的中和抗体;3)采用免疫摄取的方法，用特异性的病毒衣壳蛋白收集柱来清除抗病毒抗体;4)加入抗CD20的抗体或环磷酰胺 [12]来阻止病毒诱导生成中和抗体。 自1990年首次进行人类疾病的基因治疗试验以来，基因和细胞疗法作为一种全新的医疗手段日益引起了人们的重视，特别是对于那些使用传统医疗手段不能治愈的疾病。目前基因治疗研究主要集中在具有细胞特异靶向性、安全、高效表达、低毒、稳定、长效使用的载体的研发和目的基因的筛选上。基因治疗目前基本上还处于动物实验及部分临床实验阶段，再临床推广尚须解决以下问题:1)建立高效的传递系统，大量获取扩增和运载细胞，这是更好地筛选足够量的基因导入细胞和满足治疗效应的双重需求;2)携带有外源基因溶瘤病毒如何准确定向病变细胞所在的区域，即靶向性，以及如何维持其存活和持续分泌外源基因的表达产物，目的基因的表达如何调控;3)多种基因的联合应用以哪几种最佳，是否交叉抑制;4)如何恰当地与其他治疗措施相结合及基因治疗方案的选择优化;5)如何控制宿主免疫反应。 今后基因治疗将向两个方向发展:其一是基础研究更加深入，以解决在临床中遇到的一些困难及基因治疗本身需要解决的一些难点(如靶向性差、可控性弱、目的基因少)为主要研究内容;其二是临床实验项目的增多，实验方案更加优化， 63 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 判断标准更加客观，评价效果更加精确。成功的基因治疗应以安全、有效、简便、实用为目的。随着人类基因组的顺利实施和完成，新的人类疾病基因的发现和克隆，基因治疗的研究和应用将不断取得突破性进展。 5.4.4 本课题的工作局限及今后的研究方向 由于时间的局限，本课题虽然获得了一些关于溶瘤腺病毒 APU-E1A-AR及APU-E1A在动物体内的生物分布和安全性评价方面的数据，初步证实了其近期安全性和较小的毒性反应，但仍然有很多问题没有解决。目前关于溶瘤腺病毒基因治疗的报道很多，但大多是关于基础研究的报道，临床研究很少，目前国内外尚没有一种膀胱组织特异性的溶瘤腺病毒进入临床实验阶段。因此针对膀胱癌的溶瘤腺病毒的安全性评价疗仍然是今后研究的课题。我国基因治疗品种审批中对安全性的基本要求是:1)必须确保安全及有效，要充分估计可能遇到的风险性，并充分提出相应的质控要求;2)要促进基因治疗的研究，并加强创新。在药学研究中要求严格质量控制，杜绝危险物质进入机体，对复制性病毒必须进行检测，需提供外源基因的检测结果，热原质检测结果，基因表达活性及导入后宿主基因的稳定性，无重排或突变的证据等。对于基因治疗，必须进行分子遗传学的评估，即载体及目的基因导入靶组织与非靶组织的分布情况、基因的存在状态及表达情况等。还要进行毒性反应的评估和免疫学的评估。在临床研究中，须对临床研究的全过程进行严密监控，提供基因导入后是否导入非靶组织的分子生物学检测的项目、方法及指标。若导入病毒或可能改变机体免疫状态的制剂，须针对性地提供观察人体免疫学方面的相关检测指标及对可能发生的免疫学反应的必要处理措施。还须制定随访计划及实施办法，包括需要检测的项目等。 因此，针对我们课题组构建的膀胱肿瘤特异性溶瘤腺病毒，今后的研究方向主要有以下几个方面: (1)建立裸鼠膀胱癌原位模型，采用溶瘤腺病毒膀胱内灌注，并与化疗、放疗相结合，进一步证实其体内的有效性，进一步完善药效学研究和近期生物安全性分布;并进一步完善病毒的稳定性试验、热源实验、内毒素试验及病毒在临床保存条件的研究。 (2)针对溶瘤腺病毒进行临床前安全性评价研究，进一步完善急性毒性实验和三致实验，并进行长期毒性试验，选用至少两种动物(啮齿类和非啮齿类大动物如Beagle犬或猴)，采用与临床给药途径一致的给药方法(膀胱内灌注)，通过临床观察、血液学评估(检测RBC、Hb、Platlet等)、临床生化指标检测(ALT、AST、BUN、Cr等)、尿液分析、组织病理学分析及心电图分析等来探讨病毒的毒性剂量、安全范围、毒性反应的具体表现(如性质、程度、量毒 64 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 关系、产生时间、达峰时间、持续时间、反复产生毒性反应时间、迟发性、蓄积性及耐受性等)、毒性反应靶器官及毒性反应是否可逆等的研究。 (3)针对溶瘤腺病毒进行药代动力学研究，以探讨病毒在体内的量变过程，采用数学的方法定量地研究病毒在体内的吸收、分布、代谢和排泄消除等量变特征，为临床合理用药和安全用药(最佳药物剂量、给药途径、给药间隔时间和剂型等)提供依据。 (4)与相关合作单位联合，对组织特异性溶瘤病毒进行中试，即在正式投产前对溶瘤腺病毒进行中等产量实验，通过小量中试、放量中试和小批量生产对病毒的合成、纯化、鉴定等工艺流程和工艺路线进行验证，并对装配工装、测试工装、生产设备、生产测试环境、测试程序、工作程序进行验证，形成中试总结报告，并组织研发产品经理等评委进行转产评审会，形成最终评审意见，判定产品能否满足大批量生产要求。 (5)形成溶瘤病毒的生产流程和标准:通过中试，对发现的问题及时、准确反馈并解决，对病毒结构和可靠性进行验证，以形成溶瘤病毒的生产流程和标准，获得稳定制剂。 (6)设定合理的临床试验方案及联合治疗方案，包括临床?期、?期及?期试验方案，并提供基因导入后是否导入非靶组织的分子生物学检测的项目、方法及指标，可能出现的免疫反应的相关检测指标及处理措施，制定随访计划及检测项目指标等，为开发出国内首个治疗膀胱癌的溶瘤腺病毒制剂，申请新药审批提供基础和理论依据。同时制定合理可行的联合治疗方案，为今后将传统手术治疗、放疗和化疗与这种溶瘤腺病毒的基因治疗联合，降低药物的副作用，在临床中提高膀胱癌，尤其是肌肉浸润性膀胱癌的治疗效果，减少复发率提供一种切实可行的治疗策略。 最后，溶瘤腺病毒治疗膀胱癌还需要大量的临床前研究及临床试验，将溶瘤腺病毒用于临床治疗膀胱癌还有一段距离。相信，随着科学的进步，对膀胱癌研究的深入和生物工程、基因工程的发展，总有一天人们会攻克膀胱癌。 5.5 结论 (1)瘤内注射膀胱组织特异性溶瘤腺病毒 APU-E1A-AR 及 APU-E1A 后 7w, E1A 基因和蛋白主要在裸鼠移植瘤组织中表达，在动物肝脏中有 E1A基因的少量表达(可能与溶瘤病毒主要在肝脏代谢有关，统计学无差异)，而在动物 78其他主要器官中均未表达, 提示了这两种溶瘤腺病毒在5×10 pfu、 5×10 pfu剂量范围内较为安全，未观察到对除肿瘤组织外其他主要脏器的毒性反应。 65 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 (2)利用我们构建的检测病毒 APU-LUC，通过对 LUC 的检测进一步证实了溶瘤腺病毒 APU-E1A-AR 及 APU-E1A 瘤内注射后，病毒主要在肿瘤组织中复制，而在其他主要脏器中没有复制和表达。 (3)利用 LUC 构建检测病毒用于其生物性分布和安全性评价具有可行性和实用性，且操作简便，结果判定直观。 66 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 参考文献 [1] Jemal A, Siegel R, Ward E, et al. Cancer statistics, 2008. CA Cancer J Clin, 2008, 58(2): 71-96. [2] 温登瑰,单保恩,张思维, et al. 2 0 0 3 —2 0 0 7 年中国肿瘤登记地区膀胱癌的发病与 死亡分析. T U M O R, 2012, 32(4): 256-262. [3] Zieger K, Dyrskjot L, Wiuf C, et al. Role of activating fibroblast growth factor receptor 3 mutations in the development of bladder tumors. Clin Cancer Res, 2005, 11(21): 7709-7719. [4] Chan KS, Espinosa I, Chao M, et al. Identification, molecular characterization, clinical prognosis, and therapeutic targeting of human bladder tumor-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009, 106(33): 14016-14021. [5] Babjuk M, Oosterlinck W, Sylvester R, et al. EAU guidelines on non-muscle-invasive urothelial carcinoma of the bladder, the 2011 update. Eur Urol, 2011, 59(6): 997-1008. [6] Liu TC, Kirn D. Gene therapy progress and prospects cancer: oncolytic viruses. Gene Ther, 2008, 15(12): 877-884. [7] Mahller YY, Williams JP, Baird WH, et al. Neuroblastoma cell lines contain pluripotent tumor initiating cells that are susceptible to a targeted oncolytic virus. PLoS One, 2009, 4(1): e4235. [8] Kelly E, Russell SJ. History of oncolytic viruses: genesis to genetic engineering. Mol Ther, 2007, 15(4): 651-659. [9] Kanerva A, Hemminki A. Adenoviruses for treatment of cancer. Ann Med, 2005, 37(1): 33-43. [10] Power AT, Bell JC. Cell-based delivery of oncolytic viruses: a new strategic alliance for a biological strike against cancer. Mol Ther, 2007, 15(4): 660-665. [11] Raki M, Rein DT, Kanerva A, et al. Gene transfer approaches for gynecological diseases. Mol Ther, 2006, 14(2): 154-163. [12] Kanerva A, Raki M, Hemminki A. Gene therapy of gynaecological diseases. Expert Opin Biol Ther, 2007, 7(9): 1347-1361. [13] Russell WC. Update on adenovirus and its vectors. J Gen Virol, 2000, 81(Pt 11): 2573-2604. [14] Wickham TJ, Mathias P, Cheresh DA, et al. Integrins alpha v beta 3 and alpha v beta 5 promote adenovirus internalization but not virus attachment. Cell, 1993, 73(2): 309-319. [15] Fueyo J, Gomez-Manzano C, Alemany R, et al. A mutant oncolytic adenovirus targeting the Rb pathway produces anti-glioma effect in vivo. Oncogene, 2000, 19(1): 2-12. [16] Heise C, Hermiston T, Johnson L, et al. An adenovirus E1A mutant that demonstrates potent and selective systemic anti-tumoral efficacy. Nat Med, 2000, 6(10): 1134-1139. [17] Wang H, Satoh M, Abe H, et al. Oncolytic viral therapy by bladder instillation using an E1A, E1B double-restricted adenovirus in an orthotopic bladder cancer model. Urology, 67 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 2006, 68(3): 674-681. [18] Sherr CJ. Cancer cell cycles. Science, 1996, 274(5293): 1672-1677. [19] Hsieh JL, Wu CL, Lee CH, et al. Hepatitis B virus X protein sensitizes hepatocellular carcinoma cells to cytolysis induced by E1B-deleted adenovirus through the disruption of p53 function. Clin Cancer Res, 2003, 9(1): 338-345. [20] Hsieh JL, Wu CL, Lai MD, et al. Gene therapy for bladder cancer using E1B-55 kD-deleted adenovirus in combination with adenoviral vector encoding plasminogen kringles 1-5. Br J Cancer, 2003, 88(9): 1492-1499. [21] Nakashima H, Kaur B, Chiocca EA. Directing systemic oncolytic viral delivery to tumors via carrier cells. Cytokine Growth Factor Rev, 2010, 21(2-3): 119-126. [22] Saukkonen K, Hemminki A. Tissue-specific promoters for cancer gene therapy. Expert Opin Biol Ther, 2004, 4(5): 683-696. [23] Wang D, Wang Z, Tian J, et al. Prostate stem cell antigen enhancer and uroplakin II promoter based bladder cancer targeted tissue-specific vector. Urol Oncol, 2010, 28(2): 164-169. [24] Terao S, Shirakawa T, Kubo S, et al. Midkine promoter-based conditionally replicative adenovirus for targeting midkine-expressing human bladder cancer model. Urology, 2007, 70(5): 1009-1013. [25] Shirakawa T, Hamada K, Zhang Z, et al. A cox-2 promoter-based replication-selective adenoviral vector to target the cox-2-expressing human bladder cancer cells. Clin Cancer Res, 2004, 10(13): 4342-4348. [26] Melquist JJ, Kacka M, Li Y, et al. Conditionally replicating adenovirus-mediated gene therapy in bladder cancer: an orthotopic in vivo model. Urol Oncol, 2006, 24(4): 362-371. [27] Zhang J, Ramesh N, Chen Y, et al. Identification of human uroplakin II promoter and its use in the construction of CG8840, a urothelium-specific adenovirus variant that eliminates established bladder tumors in combination with docetaxel. Cancer Res, 2002, 62(13): 3743-3750. [28] He XD, Wang ZP, Wei HY, et al. Construction of urothelium-specific recombinant adenovirus and its inhibition in bladder cancer cell. Urol Int, 2009, 82(2): 209-213. [29] Lanson NA, Jr., Friedlander PL, Schwarzenberger P, et al. Replication of an adenoviral vector controlled by the human telomerase reverse transcriptase promoter causes tumor-selective tumor lysis. Cancer Res, 2003, 63(22): 7936-7941. [30] Gidekel S, Pizov G, Bergman Y, et al. Oct-3/4 is a dose-dependent oncogenic fate determinant. Cancer Cell, 2003, 4(5): 361-370. [31] Atlasi Y, Mowla SJ, Ziaee SA, et al. OCT-4, an embryonic stem cell marker, is highly expressed in bladder cancer. Int J Cancer, 2007, 120(7): 1598-1602. [32] Wu CL, Shieh GS, Chang CC, et al. Tumor-selective replication of an oncolytic adenovirus carrying oct-3/4 response elements in murine metastatic bladder cancer models. Clin Cancer Res, 2008, 14(4): 1228-1238. [33] Ramesh N, Ge Y, Ennist DL, et al. CG0070, a conditionally replicating granulocyte macrophage colony-stimulating factor--armed oncolytic adenovirus for the treatment of 68 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 bladder cancer. Clin Cancer Res, 2006, 12(1): 305-313. [34] Hu J, Xuan X, Han C, et al. Anti-tumor function of double-promoter regulated adenovirus carrying SEA gene, in the treatment of bladder cancer. Cell Biochem Biophys, 2012, 62(2): 353-359. [35] 李怀富. 表达金黄色葡萄球菌肠毒素A基因的高靶向、双调控溶瘤腺病毒载体的构 建、鉴定及其抗膀胱肿瘤作用. 中华实验外科杂志, 2009, 26(8): 1052-1054. [36] Bauerschmitz GJ, Guse K, Kanerva A, et al. Triple-targeted oncolytic adenoviruses featuring the cox2 promoter, E1A transcomplementation, and serotype chimerism for enhanced selectivity for ovarian cancer cells. Mol Ther, 2006, 14(2): 164-174. [37] Dean M, Fojo T, Bates S. Tumour stem cells and drug resistance. Nat Rev Cancer, 2005, 5(4): 275-284. [38] Rich JN. Cancer stem cells in radiation resistance. Cancer Res, 2007, 67(19): -8984. 8980 [39] Bao S, Wu Q, McLendon RE, et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature, 2006, 444(7120): 756-760. [40] Fukazawa T, Matsuoka J, Yamatsuji T, et al. Adenovirus-mediated cancer gene therapy and virotherapy (Review). Int J Mol Med, 2010, 25(1): 3-10. [41] Alonso MM, Jiang H, Gomez-Manzano C, et al. Targeting brain tumor stem cells with oncolytic adenoviruses. Methods Mol Biol, 2012, 797(111-125. [42] Hoti N, Chowdhury WH, Mustafa S, et al. Armoring CRAds with p21/Waf-1 shRNAs: the next generation of oncolytic adenoviruses. Cancer Gene Ther, 2010, 17(8): 585-597. [43] Khuri FR, Nemunaitis J, Ganly I, et al. a controlled trial of intratumoral ONYX-015, a selectively-replicating adenovirus, in combination with cisplatin and 5-fluorouracil in patients with recurrent head and neck cancer. Nat Med, 2000, 6(8): 879-885. [44] Vasey PA, Shulman LN, Campos S, et al. Phase I trial of intraperitoneal injection of the E1B-55-kd-gene-deleted adenovirus ONYX-015 (dl1520) given on days 1 through 5 every 3 weeks in patients with recurrent/refractory epithelial ovarian cancer. J Clin Oncol, 2002, 20(6): 1562-1569. [45] Reid T, Galanis E, Abbruzzese J, et al. Hepatic arterial infusion of a replication-selective oncolytic adenovirus (dl1520): phase II viral, immunologic, and clinical endpoints. Cancer Res, 2002, 62(21): 6070-6079. [46] Nemunaitis J, Senzer N, Sarmiento S, et al. A phase I trial of intravenous infusion of ONYX-015 and enbrel in solid tumor patients. Cancer Gene Ther, 2007, 14(11): 885-893. [47] Demers GW, Johnson DE, Tsai V, et al. Pharmacologic indicators of antitumor efficacy for oncolytic virotherapy. Cancer Res, 2003, 63(14): 4003-4008. [48] Kumar S, Gao L, Yeagy B, et al. Virus combinations and chemotherapy for the treatment of human cancers. Curr Opin Mol Ther, 2008, 10(4): 371-379. [49] Hemminki A. From molecular changes to customised therapy. Eur J Cancer, 2002, 38(3): 333-338. [50] Burke J. Virus therapy for bladder cancer. Cytokine Growth Factor Rev, 2010, 21(2-3): 99-102. 69 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 [51] Ganly I, Kirn D, Eckhardt G, et al. A phase I study of Onyx-015, an E1B attenuated adenovirus, administered intratumorally to patients with recurrent head and neck cancer. Clin Cancer Res, 2000, 6(3): 798-806. [52] Jiang H, Gomez-Manzano C, Lang FF, et al. Oncolytic adenovirus: preclinical and clinical studies in patients with human malignant gliomas. Curr Gene Ther, 2009, 9(5): 422-427. [53] Freytag SO, Stricker H, Peabody J, et al. Five-year follow-up of trial of replication-competent adenovirus-mediated suicide gene therapy for treatment of prostate cancer. Mol Ther, 2007, 15(3): 636-642. [54] Freytag SO, Khil M, Stricker H, et al. Phase I study of replication-competent adenovirus-mediated double suicide gene therapy for the treatment of locally recurrent prostate cancer. Cancer Res, 2002, 62(17): 4968-4976. [55] Small EJ, Carducci MA, Burke JM, et al. A phase I trial of intravenous CG7870, a replication-selective, prostate-specific antigen-targeted oncolytic adenovirus, for the treatment of hormone-refractory, metastatic prostate cancer. Mol Ther, 2006, 14(1): 107-117. [56] DeWeese TL, van der Poel H, Li S, et al. A phase I trial of CV706, a replication-competent, PSA selective oncolytic adenovirus, for the treatment of locally recurrent prostate cancer following radiation therapy. Cancer Res, 2001, 61(20): 7464-7472. [57] Page JG, Tian B, Schweikart K, et al. Identifying the safety profile of a novel infectivity-enhanced conditionally replicative adenovirus, Ad5-delta24-RGD, in anticipation of a phase I trial for recurrent ovarian cancer. Am J Obstet Gynecol, 2007, 196(4): 389 e381-389; discussion 389 e389-310. [58] Dobbelstein M. Replicating adenoviruses in cancer therapy. Curr Top Microbiol Immunol, 2004, 273(8): 291-334. [59] Chiocca EA, Abbed KM, Tatter S, et al. A phase I open-label, dose-escalation, multi-institutional trial of injection with an E1B-Attenuated adenovirus, ONYX-015, into the peritumoral region of recurrent malignant gliomas, in the adjuvant setting. Mol Ther, 2004, 10(5): 958-966. [60] Ries S, Korn WM. ONYX-015: mechanisms of action and clinical potential of a replication-selective adenovirus. Br J Cancer, 2002, 86(1): 5-11. [61] Mulvihill S, Warren R, Venook A, et al. Safety and feasibility of injection with an E1B-55 kDa gene-deleted, replication-selective adenovirus (ONYX-015) into primary carcinomas of the pancreas: a phase I trial. Gene Ther, 2001, 8(4): 308-315. [62] Nemunaitis J, Cunningham C, Tong A, et al. Pilot trial of intravenous infusion of a replication-selective adenovirus (ONYX-015) in combination with chemotherapy or IL-2 treatment in refractory cancer patients. Cancer Gene Ther, 2003, 10(5): 341-352. [63] Burke JM, Lamm DL, Meng MV, et al. A first in human phase 1 study of CG0070, a GM-CSF expressing oncolytic adenovirus, for the treatment of nonmuscle invasive bladder cancer. J Urol, 2012, 188(6): 2391-2397. [64] Chang J, Zhao X, Wu X, et al. A Phase I study of KH901, a conditionally replicating 70 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 granulocyte-macrophage colony-stimulating factor: armed oncolytic adenovirus for the treatment of head and neck cancers. Cancer Biol Ther, 2009, 8(8): 676-682. [65] Pesonen S, Diaconu I, Kangasniemi L, et al. Oncolytic immunotherapy of advanced solid tumors with a CD40L-expressing replicating adenovirus: assessment of safety and immunologic responses in patients. Cancer Res, 2012, 72(7): 1621-1631. [66] Kimball KJ, Preuss MA, Barnes MN, et al. A phase I study of a tropism-modified conditionally replicative adenovirus for recurrent malignant gynecologic diseases. Clin Cancer Res, 2010, 16(21): 5277-5287. [67] Yuan ZY, Zhang L, Li S, et al. Safety of an E1B deleted adenovirus administered intratumorally to patients with cancer. Ai Zheng, 2003, 22(3): 310-313. [68] Lu W, Zheng S, Li XF, et al. Intra-tumor injection of H101, a recombinant adenovirus, in combination with chemotherapy in patients with advanced cancers: a pilot phase II clinical trial. World J Gastroenterol, 2004, 10(24): 3634-3638. [69] Yu W, Fang H. Clinical trials with oncolytic adenovirus in China. Curr Cancer Drug Targets, 2007, 7(2): 141-148. [70] Xu RH, Yuan ZY, Guan ZZ, et al. Phase II clinical study of intratumoral H101, an E1B deleted adenovirus, in combination with chemotherapy in patients with cancer. Ai Zheng, 2003, 22(12): 1307-1310. [71] Xia ZJ, Chang JH, Zhang L, et al. Phase III randomized clinical trial of intratumoral injection of E1B gene-deleted adenovirus (H101) combined with cisplatin-based chemotherapy in treating squamous cell cancer of head and neck or esophagus. Ai Zheng, 2004, 23(12): 1666-1670. [72] 胡永超. 溶瘤腺病毒治疗实体瘤安全性及临床疗效的初步评价. 中华临床医师杂志 (电子版), 2011, 5(9): 2537-2542. [73] Breitbach CJ, Burke J, Jonker D, et al. Intravenous delivery of a multi-mechanistic cancer-targeted oncolytic poxvirus in humans. Nature, 2011, 477(7362): 99-102. [74] Chang JY, Xia W, Shao R, et al. Inhibition of intratracheal lung cancer development by systemic delivery of E1A. Oncogene, 1996, 13(7): 1405-1412. [75] Shao R, Karunagaran D, Zhou BP, et al. Inhibition of nuclear factor-kappaB activity is involved in E1A-mediated sensitization of radiation-induced apoptosis. J Biol Chem, 1997, 272(52): 32739-32742. [76] Zhu H, Zhang ZA, Xu C, et al. Targeting gene expression of the mouse uroplakin II promoter to human bladder cells. Urol Res, 2003, 31(1): 17-21. [77] Latham JP, Searle PF, Mautner V, et al. Prostate-specific antigen promoter/enhancer driven gene therapy for prostate cancer: construction and testing of a tissue-specific adenovirus vector. Cancer Res, 2000, 60(2): 334-341. [78] Jain A, Lam A, Vivanco I, et al. Identification of an androgen-dependent enhancer within the prostate stem cell antigen gene. Mol Endocrinol, 2002, 16(10): 2323-2337. [79] Hoti N, Li Y, Chen CL, et al. Androgen receptor attenuation of Ad5 replication: implications for the development of conditionally replication competent adenoviruses. Mol Ther, 2007, 15(8): 1495-1503. [80] Zhai Z, Wang Z, Fu S, et al. Antitumor effects of bladder cancer-specific adenovirus 71 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 carrying E1A-androgen receptor in bladder cancer. Gene Ther, 2012, 19(11): 1065-1074. [81] Kanegae Y, Makimura M, Saito I. A simple and efficient method for purification of infectious recombinant adenovirus. Jpn J Med Sci Biol, 1994, 47(3): 157-166. [82] Vail DM, MacEwen EG. Spontaneously occurring tumors of companion animals as models for human cancer. Cancer Invest, 2000, 18(8): 781-792. [83] Knapp DW, Waters DJ. Naturally occurring cancer in pet dogs: important models for developing improved cancer therapy for humans. Mol Med Today, 1997, 3(1): 8-11. [84] Yamamoto S, Tatematsu M, Yamamoto M, et al. Clonal analysis of urothelial carcinomas in C3H/HeN<-->BALB/c chimeric mice treated with N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine. Carcinogenesis, 1998, 19(5): 855-860. [85] Steinberg GD, Brendler CB, Ichikawa T, et al. Characterization of an N-methyl-N-nitrosourea-induced autochthonous rat bladder cancer model. Cancer Res, 1990, 50(20): 6668-6674. [86] Jiang F, Zhou XM. A model of orthotopic murine bladder (MBT-2) tumor implants. Urol Res, 1997, 25(3): 179-182. [87] Vandepitte J, Maes J, Van Cleynenbreugel B, et al. An improved orthotopic rat bladder tumor model using Dil-loaded fluorescent AY-27 cells. Cancer Biol Ther, 9(12): 986-993. [88] 李凌. 一种新的高转移膀胱癌动物模型的建立. 中华实验外科杂志, 2002, 19(1): 78-79. [89] Li F, Ye Z, Yang W. Evaluation of tumor formation of three bladder cancer cell lines in nude mice. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci, 2011, 31(2): 210-214. [90] Hadaschik BA, Black PC, Sea JC, et al. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging. BJU Int, 2007, 100(6): 1377-1384. [91] Engler H, Machemer T, Philopena J, et al. Acute hepatotoxicity of oncolytic adenoviruses in mouse models is associated with expression of wild-type E1a and induction of TNF-alpha. Virology, 2004, 328(1): 52-61. [92] Shayakhmetov DM, Gaggar A, Ni S, et al. Adenovirus binding to blood factors results in liver cell infection and hepatotoxicity. J Virol, 2005, 79(12): 7478-7491. [93] Cascallo M, Alonso MM, Rojas JJ, et al. Systemic toxicity-efficacy profile of ICOVIR-5, a potent and selective oncolytic adenovirus based on the pRB pathway. Mol Ther, 2007, 15(9): 1607-1615. [94] Tsukuda K, Wiewrodt R, Molnar-Kimber K, et al. An E2F-responsive replication-selective adenovirus targeted to the defective cell cycle in cancer cells: potent antitumoral efficacy but no toxicity to normal cell. Cancer Res, 2002, 62(12): 3438-3447. [95] Lovatt A. Applications of quantitative PCR in the biosafety and genetic stability assessment of biotechnology products. J Biotechnol, 2002, 82(3): 279-300. [96] Carney BJ, Shah K. Migration and fate of therapeutic stem cells in different brain disease models. Neuroscience, 2011, 197(10): 37-47. [97] Dmitriev I, Krasnykh V, Miller CR, et al. An adenovirus vector with genetically 72 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 modified fibers demonstrates expanded tropism via utilization of a coxsackievirus and adenovirus receptor-independent cell entry mechanism. J Virol, 1998, 72(12): 9706-9713. [98] Li Y, Pong RC, Bergelson JM, et al. Loss of adenoviral receptor expression in human bladder cancer cells: a potential impact on the efficacy of gene therapy. Cancer Res, 1999, 59(2): 325-330. [99] Sachs MD, Rauen KA, Ramamurthy M, et al. Integrin alpha(v) and coxsackie adenovirus receptor expression in clinical bladder cancer. Urology, 2002, 60(3): 531-536. [100] Havenga MJ, Lemckert AA, Ophorst OJ, et al. Exploiting the natural diversity in adenovirus tropism for therapy and prevention of disease. J Virol, 2002, 76(9): 4612-4620. [101] Iguchi K, Sakurai F, Tomita K, et al. Efficient antitumor effects of carrier cells loaded with a fiber-substituted conditionally replicating adenovirus on CAR-negative tumor cells. Cancer Gene Ther, 2012, 19(2): 118-125. [102] Wakayama M, Abei M, Kawashima R, et al. E1A, E1B double-restricted adenovirus with RGD-fiber modification exhibits enhanced oncolysis for CAR-deficient biliary cancers. Clin Cancer Res, 2007, 13(10): 3043-3050. [103] Dehari H, Ito Y, Nakamura T, et al. Enhanced antitumor effect of RGD fiber-modified adenovirus for gene therapy of oral cancer. Cancer Gene Ther, 2003, 10(1): 75-85. [104] Suzuki K, Fueyo J, Krasnykh V, et al. A conditionally replicative adenovirus with enhanced infectivity shows improved oncolytic potency. Clin Cancer Res, 2001, 7(1): 120-126. [105] Lavilla-Alonso S, Bauerschmitz G, Abo-Ramadan U, et al. Adenoviruses with an alphavbeta integrin targeting moiety in the fiber shaft or the HI-loop increase tumor specificity without compromising antitumor efficacy in magnetic resonance imaging of colorectal cancer metastases. J Transl Med, 2010, 8(2): 80-87. [106] Ranki T, Kanerva A, Ristimaki A, et al. A heparan sulfate-targeted conditionally replicative adenovirus, Ad5.pk7-Delta24, for the treatment of advanced breast cancer. Gene Ther, 2007, 14(1): 58-67. [107] van der Poel HG, Molenaar B, van Beusechem VW, et al. Epidermal growth factor receptor targeting of replication competent adenovirus enhances cytotoxicity in bladder cancer. J Urol, 2002, 168(1): 266-272. [108] Mizuguchi H, Sasaki T, Kawabata K, et al. Fiber-modified adenovirus vectors mediate efficient gene transfer into undifferentiated and adipogenic-differentiated human mesenchymal stem cells. Biochem Biophys Res Commun, 2005, 332(4): 1101-1106. [109] Hakkarainen T, Sarkioja M, Lehenkari P, et al. Human mesenchymal stem cells lack tumor tropism but enhance the antitumor activity of oncolytic adenoviruses in orthotopic lung and breast tumors. Hum Gene Ther, 2007, 18(7): 627-641. [110] Zhao Y, Li Y, Wang Q, et al. Increased antitumor capability of fiber-modified adenoviral vector armed with TRAIL against bladder cancers. Mol Cell Biochem, 2011, 353(1-2): 93-99. 73 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 [111] Shieh GS, Shiau AL, Yo YT, et al. Low-dose etoposide enhances telomerase-dependent adenovirus-mediated cytosine deaminase gene therapy through augmentation of adenoviral infection and transgene expression in a syngeneic bladder tumor model. Cancer Res, 2006, 66(20): 9957-9966. [112] Okegawa T, Nutahara K, Pong RC, et al. Enhanced transgene expression in urothelial cancer gene therapy with histone deacetylase inhibitor. J Urol, 2005, 174(2): 747-752. [113] Lupold SE, Kudrolli TA, Chowdhury WH, et al. A novel method for generating and screening peptides and libraries displayed on adenovirus fiber. Nucleic Acids Res, 2007, 35(20): e138. [114] Lilly JD, Parsons CL. Bladder surface glycosaminoglycans is a human epithelial permeability barrier. Surg Gynecol Obstet, 1990, 171(6): 493-496. [115] Ratliff TL. Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium. J Urol, 2005, 173(6): 2198-2199. [116] Ranki T, Sarkioja M, Hakkarainen T, et al. Systemic efficacy of oncolytic adenoviruses in imagable orthotopic models of hormone refractory metastatic breast cancer. Int J Cancer, 2007, 121(1): 165-174. [117] Kanerva A, Zinn KR, Chaudhuri TR, et al. Enhanced therapeutic efficacy for ovarian cancer with a serotype 3 receptor-targeted oncolytic adenovirus. Mol Ther, 2003, 8(3): 449-458. 74 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 综 述 溶瘤腺病毒靶向治疗肿瘤干细胞的研究进展 中图分类号:R730.5;R730.2 文献标识码:A 文章编号: 摘要:肿瘤干细胞(或肿瘤起始细胞)由于具有很强的肿瘤起始能力和浸润转 移能力而成为许多肿瘤中难治性的细胞群体。有研究表明肿瘤干细胞对化疗、 放疗抵抗，因此与肿瘤的复发有关。针对肿瘤干细胞治疗策略将会影响肿瘤治 疗的成败。一些临床实验已经证实溶瘤腺病毒可通过与传统治疗方式不同的机 制杀伤肿瘤细胞，且不服从于典型的药物抵抗机制;通过对一些条件复制性溶瘤 腺病毒增加外源性抗肿瘤基因，可促进溶瘤病毒的特异性和抗肿瘤活性。现将 总结溶瘤腺病毒靶向针对肿瘤干细胞的研究进展，为今后的临床治疗和应用提 供理论基础。 关键词:溶瘤腺病毒;肿瘤干细胞;基因治疗 Oncolytic Adenoviruses Targeted to Cancer Stem Cells Abstract: Cancer stem cells (CSCs) or Cancer-initiating Cells (CICs) embody the refractory nature observed among many cancers: very competent initial tumor establishment and extremely aggressive metastatic nature.Recent discoveries indicate that CSCs represent chemo- and radioresistance and are thus thought to be responsible for disease relapse.Hence,the success or failure of treatment approaches may be influenced greatly by the presence and treatment sensitivity of CSCs.Oncolytic viruses are in clinical trials for cancer and kill cells through mechanisms different from conventional therapeutics.And these viruses are not susceptible to the same pathways of drug or radiation resistance; furthermore,advanced generation conditionally replicate adenoviruses (CRAds) can be armed with therapeutic transgenes to generate greater specific and antitumor effects.Here we review the available data regarding the ability of oncolytic adenovirus to target CSCs for destruction. Key words: Oncolytic adenovirus; Cancer stem cell; Gene therapy 对肿瘤复发的研究仍然是目前世界的热点问题。有学者认为，肿瘤的复发 或许与肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)(或肿瘤起始细胞)的存在有关。 研究表明肿瘤干细胞(或肿瘤起始细胞)能够逃脱传统的治疗策略，如化疗、 [1]放疗、激素治疗和单克隆抗体疗法等，因此成为难治性的细胞克隆群体。尽 管目前对肿瘤干细胞的起源、分离、鉴定、生物学特性及作用等尚不清楚，但 探讨针对肿瘤干细胞的靶向治疗或许对降低一些恶性肿瘤的复发率，延长患者 75 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 生存时间是一种很有前景的治疗策略。 自1990年至今，基因治疗和基因治疗药物，及溶瘤病毒的研究成为肿瘤治 [2]疗的热点。溶瘤病毒通过感染的方式进入肿瘤细胞，对肿瘤细胞有细胞毒作用，却不服从于典型的药物抵抗机制，如药物流出泵和凋亡信号通路等。另外，溶瘤病毒还可通过基因工程的方法表达特异性针对肿瘤干细胞控制自我更新和 [3]细胞分裂的基因。也有研究表明溶瘤病毒可以杀伤肿瘤干细胞。因此，这篇综述主要概括总结肿瘤干细胞的假说及溶瘤病毒治疗肿瘤干细胞的最新研究进展，为今后的临床治疗和应用提供理论基础。 1 肿瘤干细胞的假说 “肿瘤干细胞”最初是用来描述肿瘤组织中和正常干细胞具有相似性质的一类细胞，即具有干细胞的自我更新和多分化潜能，但肿瘤干细胞是否来源于 [4]正常干细胞仍然存在争议，他们的来源似乎随不同肿瘤而不同。 肿瘤是由不同分化阶段的非均质细胞组成的混合体。具有干细胞能够自我更新和进一步分化的特征的细胞,通常是构成整个肿瘤组织很小的一部分。1997 [5]+ -年,Bonnet等报道了一小部分的白血病细胞，细胞表面标记为CD和CD，3438 +- 这些细胞具有很强的致瘤性，且由CDCD细胞所产生的肿瘤组织学分型与分3438 离出的特异白血病组织学表现一致，从而证实了白血病干细胞的存在。 [6]肿瘤干细胞在实体瘤中存在的证据来源于AI-Hajj等从乳腺癌患者中分 ,+离得到了CDCD的细胞亚群。这些细胞显示出干细胞一些的特征，例如广4442 泛的增殖潜能和能产生具有有限发育和增殖能力的各种不同细胞。具有干细胞 ,/low+特性的CDCD 细胞大约占到总细胞群体的10%，且在体外培养时形成4442 非黏附性的球形细胞团，与在正常乳腺干细胞或祖细胞培养中观察到的乳腺细 [6-7]胞团十分相似。 [8]后来有研究报道在人类脑肿瘤中也发现了潜在的肿瘤干细胞。脑胶质瘤干细胞表达正常神经干细胞标志物CD和nestin，且在体外培养形成类似正常133 神经干细胞的神经细胞团。随后,在其他一些肿瘤中也发现了克隆形成的，可诱 +++发肿瘤细胞形成的肿瘤干细胞。例如，骨肉瘤中Stro-1/CD/CD的细胞群可10544 [9]high+[11]+[10]++能是肿瘤干细胞;结肠癌中CD或EpCAM/CD/CD/醛脱氢酶1的细13344166 ++胞群具有肿瘤干细胞的特性;在头颈部肿瘤中，CD/BMI-1(B细胞特异单克44 [12]隆鼠白血病毒整合位点基因)的细胞可能是头颈部肿瘤干细胞;肝癌肿瘤干 +[13-14]细胞的表面标记为CD;肺癌肿瘤干细胞的表面标志物为133 +-+[16]-+[15]++Sca-1/CD/PECAM/CD;胰腺癌干细胞的表面标志物有CD/CD/ESA(人45344424 ++上皮特异性抗原);前列腺癌中，具有干细胞特征的细胞标志物为CD/CD/13344 76 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 +[17]+- hi+αβ/Sca-1;在膀胱癌中，CDCK5CK20的基底样细胞具有肿瘤干细胞的2144 [18][19]特性。由此证明在各种肿瘤中都有肿瘤干细胞的存在。但对于肿瘤干细胞的来源、表面分子标记、特性、功能等还有待更多的研究证实。 2 肿瘤干细胞对放疗和化疗的抵抗 肿瘤组织与正常组织的细胞群体一样，由处于不同层次的分化细胞组成， 增殖的短暂复制细胞,分化细胞和终分化细胞。根据肿瘤干细胞即静止干细胞, 的假说,分化细胞和终分化细胞或许与恶性肿瘤的进展和药物的抵抗没有密切 [1,20]关系。研究表明对放疗和化疗有显著抵抗作用的是肿瘤的静止干细胞群。目前研究已经表明肿瘤干细胞对放疗和化疗抵抗的作用机制有以下几个方面:?肿瘤干细胞在放射线照射时可以激活DNA检查点，从而比其他肿瘤细胞更加有 [21]效地修复放射线导致的DNA损伤，使得这些细胞不容易凋亡。?某些已鉴定的肿瘤干细胞高表达对化疗和放疗抵抗的基因，如多药抵抗基因MDR(multidrug resistance)，还有一些干细胞表达高水平的抗凋亡蛋白(如Bcl-2和Bcl-xL，即B细胞淋巴瘤/白血病-2基因和B细胞淋巴瘤/白血病-xL基因)，从而使得这些肿瘤干细胞能够抵抗放疗和化疗诱导的凋亡。?一些干细胞表达高水平的多药转运蛋白，如ABC转运蛋白，尤其是ABCG2家族成员，可有效驱除抗肿瘤药物，将细胞毒性的药物排出细胞外。一些脂溶性的荧光染料标志物如Hoechst33342也可被肿瘤干细胞中的多药转运蛋白清除，因此常利用此特性从细胞群体中鉴定肿瘤干细胞。?研究发现一些肿瘤干细胞高表达一些酶类如醛脱氢酶，可中和毒性药物、药物的代谢产物、副产物如氧化剂或自由基，使得化疗抵抗。?由于放疗引起的氧自由基介导的DNA损伤主要影响复制中的细胞，同样化疗药物的作用机制是整合入复制中的DNA或抑制DNA复制所需的分子，而干细胞的循环非常缓慢，因此对化疗和放疗并不敏感。 然而，目前现有的许多治疗方法都主要针对肿瘤组织中的分化细胞和终分化细胞群，例如很多化疗药物和放疗方法都是针对快速增殖的细胞，激素疗法和小分子抗体常常是一些细胞生长抑制剂，即阻止肿瘤细胞进入细胞循环。这些治疗方法对于潜在的肿瘤干细胞基本无效，虽然能暂时减小肿瘤的体积，仍然导致很高的复发率和致死率。因此为了减少恶性肿瘤的复发率，探讨研究新的针对肿瘤干细胞的靶向治疗策略显得尤为重要。 3 溶瘤病毒与肿瘤干细胞 3.1溶瘤病毒治疗肿瘤的历史与进展 20世纪初人们发现一些癌症患者在合并病毒感染后可以在某种程度上抑制 77 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 [22]肿瘤的生长。于是科学家们用减毒的狂犬病病毒、牛痘病毒和麻疹病毒等进行了一些抗癌实验。虽然当时观察到了一些疗效,但对于病毒的作用以及癌症的本质都知之甚少。自从2000年开始，随着分子生物学和病毒学的进步，人们逐渐发现病毒和致癌物质的作用机制上存在惊人的相似之处。因此，基因治疗和 [2]基因治疗药物，以及溶瘤病毒的研究逐渐成为肿瘤治疗的热点。已有一些溶瘤病毒在临床前研究中证实对多种肿瘤都有一定杀伤作用，并且部分已进入临床实验阶段。溶瘤病毒的另一优势是还可通过基因工程的方法在溶瘤病毒内导入治疗肿瘤的基因，从而增加溶瘤病毒的抗肿瘤作用。例如一些DNA病毒，包括腺病毒,单纯疱疹病毒和牛痘病毒等,这些病毒由于具有较强的溶瘤作用，对其基因组的了解也比较充分，因此成为基因工程中使用很广泛的溶瘤病毒。 3.2 腺病毒载体与溶瘤腺病毒 腺病毒作为载体在基因治疗领域的应用非常广泛。腺病毒载体可感染所有上皮细胞，可插入较大容量的外源基因且能够高水平表达，对处于分裂期的细胞和非分裂期的细胞均可感染。另外，腺病毒载体不会整合入宿主基因组,从而降低了突变的风险。同时腺病毒载体比较稳定且滴度高。此外,腺病毒介导的基 [23]因治疗用于治疗癌症的临床试验也显示较为安全。 在上皮细胞的表面存在一种特异性受体(柯萨奇/腺病毒受体，CAR，coxsackie/adenovirus receptor)，这种受体可与腺病毒的头节(knob)区域结合，从而使腺病毒感染进入细胞。腺病毒的knob与CAR粘附后，其五联体表面由精氨酸、甘氨酸、天门冬氨酸组成的三肽结构(Arg-Gly-Asp,RGD)与细胞表面的整合素αvβ及αvβ相结合，并通过胞吞作用使腺病毒感染入细胞并进入细35 胞的溶酶体中。虽然溶酶体呈酸性，但衣壳构象发生变化的腺病毒不会被消化而是被溶酶体释放出来。接着，腺病毒颗粒转移到细胞核，通过核孔将病毒的DNA释放入细胞核内，并在细胞核内进行复杂且有序的剪切和转录反应，从而使病毒进行复制且最终形成有感染能力的病毒颗粒，并导致宿主细胞裂解和病毒释放，而释放出的病毒又可以继续感染其他宿主细胞，继续发挥细胞杀伤的级联放大作用。 溶瘤腺病毒(Oncolytic adenovirus)是在腺病毒载体的基础上，用基因工程的方法构建的特异性针对肿瘤细胞的腺病毒。溶瘤病毒在肿瘤细胞内复制并最终导致细胞裂解，新复制的病毒颗粒可以在瘤内扩散，也可散布至肿瘤的远处转移部位。溶瘤病毒导致的细胞死亡是一种免疫原性的反应现象，因此可以促进肿瘤细胞的免疫识别。 3.3 溶瘤病毒靶向治疗肿瘤干细胞 78 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 [24-26]近几年的研究表明溶瘤病毒或许可以成为靶向治疗干细胞的理想策略是因为:?溶瘤病毒具有杀伤肿瘤细胞的能力;?溶瘤病毒的杀伤机制是通过病毒复制，导致细胞裂解，因此不受干细胞对化疗药物和放疗抵抗机制的制约，如上调ABC转运蛋白和抑制凋亡信号转导通路;?溶瘤病毒可针对肿瘤干细胞 [27]自我更新和分化所必需的基因，通过基因工程的方法实现靶向治疗。Eriksson[28]等报道了衣壳改造后的溶瘤腺病毒对潜在的乳腺癌干细胞的体内和体外的杀 [7]+-/low伤效应，根据之前的研究，乳腺癌干细胞主要是CD/CD的细胞群，因此4424 [7,28]+-/low当注射CD/CD的细胞到NOD/SCID小鼠的乳房垫可很快形成肿瘤。然而，4424 [28]在注射前给予基因改造后的溶瘤腺病毒Ad5/3-?24,则没有形成肿瘤。另外， +-/low对于已经由CD/CD建立的移植瘤模型，给予一定剂量腺病毒Ad5/3-?244424 [28]和Ad5.pK7-?24后，肿瘤生长停止。Ad5/3-?24和Ad5.pK7-?24都在E1A [29]基因区域有个24-bp的缺失，同时在病毒衣壳的纤毛头节区经过了改造。Ad5/3-?24是利用了腺病毒血清型3的受体，因为这一受体在许多肿瘤细胞表面表达丰富，从而使得病毒易于进入肿瘤细胞，克服了肿瘤细胞CAR表达较低对溶瘤病毒的制约;而Ad5.pK7-?24则利用了硫酸乙酰肝素蛋白聚糖来增加细胞间的黏附力，促进病毒进入肿瘤细胞。这两种溶瘤腺病毒都可有效杀伤乳腺 [30]癌干细胞。同时，两种病毒在肿瘤患者体内的生物分布与Ad5十分相似，提示其比较安全。 迄今为止，尚没有关于特异性肿瘤干细胞相关活化启动子的报道。据推测可以在针对肿瘤干细胞的溶瘤腺病毒中插入的启动子有药物抵抗蛋白基因 [31](mdr),端粒酶基因(telomerase，hTERT),或者环加氧酶2基因 [32-33](cyclo-oxygenase-2，Cox-2)等。同时可将Ad5/3衣壳的改造和这些控制E1A基因表达的启动子结合起来构建针对肿瘤干细胞的溶瘤腺病毒。携带有特异启动子的溶瘤病毒Ad5/3-mdr-?24,Ad5/3-Cox-2L-?24 和 Ad5/3-hTERT- +-/low?gp(?gp指E3A基因的另一处缺失)在体内对CD/CD的乳腺癌干细胞的4424 溶瘤作用与Ad5/3-?24相同，但肿瘤的选择性较好，且在体外也可降低 [32]+-/lowCD/CD乳腺癌干细胞诱导的移植瘤的体积。因此，利用肿瘤干细胞中的4424 活化启动子构建特异性溶瘤腺病毒或许是一种有效清除肿瘤干细胞的策略。同时，可通过清除Rb结合位点或其他的正常组织启动子来消除溶瘤腺病毒对正常干细胞的损伤。 使溶瘤腺病毒靶向针对肿瘤干细胞的另一种可行的办法就是使用某些双特异性的衔接分子，例如单链单克隆抗体，使病毒通过这些抗体黏附到特殊的细 [33]胞表面蛋白。例如，已经有报道构建了能够产生表皮生长因子受体的可与衔接分子结合的溶瘤腺病毒。 79 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 除了感染乳腺癌干细胞，腺病毒载体可以用来感染其他组织来源的肿瘤干细胞。例如，研究报道人类腺病毒血清型16和黑猩猩腺病毒Ad CV23可以有效 [34][35]+-感染低分化脑肿瘤细胞，包括CD和CD细胞群，另外Jiang等也报道了133133 脑肿瘤干细胞对溶瘤病毒Ad5-?24RGD(Ad5-?24-Arg-Gly-Asp)较为敏感。 4 目前尚存在的问题及前景展望 利用腺病毒载体的基因治疗对于一些对现有的治疗模式抵抗的肿瘤是一种很有前景的策略。然而，对于基因治疗仍有一些问题需要解决。最主要的因素 [36]就是腺病毒携带的基因是否有效转导至肿瘤靶组织。已有的临床实验数据已经证实病毒基因对大部分肿瘤细胞的无效或低效转导是限制临床疗效的主要的因素之一。同时，一些物理的屏障，如基底细胞，细胞间基质，坏死组织，缺氧和高气压组织等均可影响病毒在肿瘤细胞间的有效扩散。目前已有一些研究报道了如何提高肿瘤细胞的转导效率:?对于腺病毒可通过改造病毒衣壳而改变病毒对肿瘤细胞的趋向性;?实质性地提高注射病毒后的生物利用度，即病毒在系统循环中能检测到的滴度。与病毒在体外的转导不同，腺病毒载体在血管内的分布受腺病毒受体表达的影响不太大。给小鼠静脉注射腺病毒后发现病 [30]毒主要聚积在肝脏、脾、心、肺和肾脏，最后大部分在肝脏内代谢;?注意一些组织特异性的巨噬细胞对病毒的影响，如肝脏中的库普弗细胞可以清除血液中的腺病毒。另一个限制溶瘤病毒作用的因素就是体内针对病毒蛋白的中和抗体的激活，这些中和抗体可以阻碍腺病毒再次系统注射后的作用。可能的解决方法有:?用另一种血清型的腺病毒进行二次系统注射;?通过腺病毒纤毛头节区的细微改造使其逃脱已经存在的特异性的中和抗体;?采用免疫摄取的方法，用特异性的病毒衣壳蛋白收集柱来清除抗病毒抗体;?加入抗CD的抗20 [23]体或环磷酰胺来阻止病毒诱导生成中和抗体。 由于化疗、放疗或其他一些传统的治疗方法对肿瘤的治疗存在一定局限性，因此探索新的治疗策略，尤其是能够针对肿瘤干细胞而不是分化细胞的治疗方法就显得非常重要。溶瘤腺病毒介导的基因治疗不仅对分化细胞有作用，对肿瘤干细胞也有一定杀伤作用，同时还可提高肿瘤对放疗和化疗的敏感性。因此，溶瘤腺病毒对于目前一些难治的肿瘤具有很大的意义。如能将这些实验室内的研究应用在癌症患者身上，将会给肿瘤的治疗带来深远的影响。 参考文献 [1] Dean M,Fojo T,Bates S.Tumour stem cells and drug resistance[J].Nat Rev Cancer,2005,5(4):275-284. [2] Liu TC,Kirn D.Gene therapy progress and prospects cancer: oncolytic viruses[J].Gene Ther, 2008,15(12):877-884. 80 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 [3] Mahller YY,Williams JP,Baird WH,et al.Neuroblastoma cell lines contain pluripotent tumor initiating cells that are susceptible to a targeted oncolytic virus[J].PLoS One,2009,4(1):e4235. [4] Jordan CT.Cancer stem cells: controversial or just misunderstood?[J].Cell Stem Cell,2009,4(3):203-205. [5] Bonnet D,Dick JE.Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell[J].Nat Med,1997,3(7):730-737. [6] Al-Hajj M,Wicha MS,Benito-Hernandez A,et al.Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2003,100(7):3983-3988. [7] Ponti D,Costa A,Zaffaroni N,et al.Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties[J].Cancer Res,2005,65(13):5506-5511. [8] Singh SK,Hawkins C,Clarke ID,et al.Identification of human brain tumour initiating cells[J].Nature, 2004,432(7015):396-401. [9] Gibbs CP,Kukekov VG,Reith JD,et al.Stem-like cells in bone sarcomas: implications for tumorigenesis[J].Neoplasia, 2005,7(11):967-976. [10] O'Brien CA,Pollett A,Gallinger S,et al.A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice[J].Nature,2007,445(7123):106-110. [11] Dalerba P,Dylla SJ,Park IK,et al.Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2007,104(24):10158-10163. [12] Prince ME,Sivanandan R,Kaczorowski A,et al.Identification of a subpopulation of cells with cancer stem cell properties in head and neck squamous cell carcinoma[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2007,104(3):973-978. [13] Ma S,Chan KW,Hu L,et al.Identification and characterization of tumorigenic liver cancer stem/progenitor cells[J].Gastroenterology,2007,132(7):2542-2556. [14] Ma S,Chan KW,Lee TK,et al.Aldehyde dehydrogenase discriminates the CD133 liver cancer stem cell populations[J].Mol Cancer Res,2008,6(7):1146-1153. [15] Kim CF,Jackson EL,Woolfenden AE,et al.Identification of bronchioalveolar stem cells in normal lung and lung cancer[J].Cell,2005,121(6):823-835. [16] Li C,Lee CJ,Simeone DM.Identification of human pancreatic cancer stem cells[J].Methods Mol Biol,2009,568:161-173. [17] Xin L,Lawson DA,Witte ON.The Sca-1 cell surface marker enriches for a prostate-regenerating cell subpopulation that can initiate prostate tumorigenesis[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2005,102(19):6942-6947. [18] Chan KS,Espinosa I,Chao M,et al.Identification,molecular characterization,clinical prognosis,and therapeutic targeting of human bladder tumor-initiating cells[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2009,106(33):14016-14021. [19] Bisson I,Prowse DM.WNT signaling regulates self-renewal and differentiation of prostate cancer cells with stem cell characteristics[J].Cell Res,2009,19(6):683-697. [20] Rich JN.Cancer stem cells in radiation resistance[J].Cancer Res,2007,67(19):8980-8984. [21] Bao S,Wu Q,McLendon RE,et al.Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response[J].Nature,2006,444(7120):756-760. [22] Kelly E,Russell SJ.History of oncolytic viruses: genesis to genetic engineering[J].Mol Ther, 2007,15(4):651-659. [23] Kanerva A,Raki M,Hemminki A.Gene therapy of gynaecological diseases[J].Expert Opin Biol Ther, 2007,7(9):1347-1361. 81 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 [24] Nakashima H,Kaur B,Chiocca EA.Directing systemic oncolytic viral delivery to tumors via carrier cells[J].Cytokine Growth Factor Rev, 2010,21(2-3):119-126. [25] Fukazawa T,Matsuoka J,Yamatsuji T,et al.Adenovirus-mediated cancer gene therapy and virotherapy (Review)[J].Int J Mol Med, 2010,25(1):3-10. [26] Alonso MM,Jiang H,Gomez-Manzano C,et al.Targeting brain tumor stem cells with oncolytic adenoviruses[J].Methods Mol Biol 2012,797:111-125. [27] Hoti N,Chowdhury WH,Mustafa S,et al.Armoring CRAds with p21/Waf-1 shRNAs: the next generation of oncolytic adenoviruses[J].Cancer Gene Ther, 2010,17(8):585-597. [28] Eriksson M,Guse K,Bauerschmitz G,et al.Oncolytic adenoviruses kill breast cancer initiating ,/low+CDCD cells[J].Mol Ther, 2007,15(12):2088-2093. 4424 [29] Ranki T,Kanerva A,Ristimaki A,et al.A heparan sulfate-targeted conditionally replicative adenovirus,Ad5.pk7-Delta24,for the treatment of advanced breast cancer[J].Gene Ther,2007,14(1):58-67. [30] Ranki T,Sarkioja M,Hakkarainen T,et al.Systemic efficacy of oncolytic adenoviruses in imagable orthotopic models of hormone refractory metastatic breast cancer[J].Int J Cancer,2007,121(1):165-174. [31] Rein DT,Volkmer A,Beyer IM,et al.Treatment of chemotherapy resistant ovarian cancer with a MDR1 targeted oncolytic adenovirus[J].Gynecol Oncol, 2011,123(1):138-146. [32] Pesonen S,Nokisalmi P,Escutenaire S,et al.Prolonged systemic circulation of chimeric oncolytic adenovirus Ad5/3-Cox2L-D24 in patients with metastatic and refractory solid tumors[J].Gene Ther, 2011,17(7):892-904. [33] Doloff JC,Jounaidi Y,Waxman DJ.Dual E1A oncolytic adenovirus: targeting tumor heterogeneity with two independent cancer-specific promoter elements,DF3/MUC1 and hTERT[J].Cancer Gene Ther, 2011,18(3):153-166. [34] Skog J,Edlund K,Bergenheim AT,et al.Adenoviruses 16 and CV23 efficiently transduce human low-passage brain tumor and cancer stem cells[J].Mol Ther 2007,15(12):2140-2145. [35] Jiang H,Gomez-Manzano C,Aoki H,et al.Examination of the therapeutic potential of Delta-24-RGD in brain tumor stem cells: role of autophagic cell death[J].J Natl Cancer Inst 2007,99(8):1410-1414. [36] Carney BJ,Shah K.Migration and fate of therapeutic stem cells in different brain disease models[J].Neuroscience, 2011,197:37-47. 82 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 中英文缩写索引 中文全称 缩写 英文全称 腺病毒 Ad Adenovirus 5型腺病毒 Ad5 Adenovirus serotype 5 丙氨酸转氨酶(谷丙转氨ALT Alanine aminotransferase 酶) AR Androgen Receptor 雄激素受体 天冬氨酸转移酶(谷草转AST Aspartate aminotransferase 氨酶) bp base pair 碱基对 牛血清白蛋白 BSA Bovine Serum Albumin BSP Bone sialo-protein 骨唾液蛋白 Coxsackie and Adenovirus CAR 科萨奇/腺病毒受体 Receptor 互补DNA cDNA Complementary DNA 肿瘤起始细胞 CICs Cancer-initiating Cells Cox-2 环氧化酶2 Cyclooxyge-nase 2 细胞病变效应 CPE Cytopathic Effect Conditionaly Replicate 条件复制性腺病毒 CRADs Adenovirus 氯化铯 CsCl Cesium Chloride 肿瘤干细胞 CSCs Cancer Stem Cells 天 d day 去离子水 ddH2O deionized water 二甲基亚砜 DMSO Dimethyl Sulfoxide 溴化乙锭 EB Ethidium Bromide 胎牛血清 FBS Fetal Bovine Serum Granulocyte-macrophage 粒细胞巨噬细胞集落刺GM-CSF 激因子 colony-stimulating factor Human Embryonic 人胚肾293细胞 HEK293 Kidney293 H&E Hematoxylin and Eosin 苏木精-伊红染色法 83 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 staining 感染单位 IU Infection Unit 萤火虫荧光素酶 LUC Luciferase MDR Multiple Drug Resistance 多重耐药 分钟 min minute MK 肝素结合细胞因子 Midkine 信使RNA mRNA Messenger RNA PolyAcrylamide Gel 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE Electrophoresis 磷酸盐缓冲生理盐水 PBS Phosphate Buffered Saline 噬斑形成单位 PFU Plaque Forming Unit Phenylmethanesulfonyl 苯甲基磺酰氟 PMSF fluoride Prostate Specific Antigen 前列腺特异性抗原增强PSCAE 子 Enhancer quantitative real-time 实时荧光定量PCR qRT-PCR polymerase chain reaction Rb 视网膜母细胞瘤 Retinoblastoma Radio RIPA Immunoprecipitation 蛋白裂解液 Assay 转/分 rpm revolutions per minute 洛斯维公园纪念研究所发明Roswell Park Memorial RPMI 1640 的1640细胞培养基 Institute 1640 秒 s second 十二烷基硫酸钠 SDS Sodium Dodecyl Sulfate 无特定病原体 SPF specific pathogen-free 50% Tissue Culture 50% 组织培养感染病毒TCID 50的剂量 Infective Dose 四甲基乙二胺 TEMED (CH3)2NCH2CH2N(CH3)2 尿路上皮特异性蛋白? UP? Uroplakin? 颗粒滴度 VP vector particles 周 w week 84 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 在学期间的研究成果 一、发表论文 1. Wang F, Wang Z* ,Tian H, Qi M, Zhai Z, Li S, Li R, Zhang H, Wang W, Fu S, Lu J, Rodriguez R,Guo Y, Zhou L. Biodistribution and Safety Assessment of Bladder Cancer Specific Recombinant Oncolytic Adenovirus in Subcutaneous Xenografts Tumor Model in Nude Mice. Curr Gene Ther.2012, 12(2):67-76. 2. Zhai Z, Wang Z*, Fu S, Lu J, Wang F, Li R, Zhang H, Li S, Hou Z, Wang H, Rodriguez R. Antitumor effects of bladder cancer-specific adenovirus carrying E1A-androgen receptor in bladder cancer. Gene Therapy. 2012,19(11):1065-74. 3. 王芳，王志平*。溶瘤腺病毒靶向治疗肿瘤干细胞的研究进展。医学综述，2013，July. 二、参与课题 1. 国家高科技发展计划(863 计划):《膀胱癌特异性溶瘤腺病毒基因靶向治疗开发研究》， 项目编号: 2008AA02Z421。 2. 国家自然科学基金(面上项目):《放射治疗联合溶瘤腺病毒治疗膀胱癌的机理及影响因 素探讨》，项目编号: 81172437。 3. 甘肃省科技重大专项计划:《组织特异性溶瘤腺病毒作为新型基因药物治疗膀胱癌的开 发研究》，项目编号: 1203FKDA032。 85 兰州大学博士研究生学位论文 膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价 致 谢 首先要感谢我的导师王志平教授，该学位论文是在导师的悉心指导下完成的,倾注了导师大量的心血。在攻读学位的这三年中,导师渊博浩瀚的专业知识,高瞻远瞩的科研思维,细致严谨的治学态度,诲人不倦的高尚师德都使我深受感动并受益终身。三年的学习不仅使我熟练掌握了一些基本的实验研究方法,还使我了解了如何从纷繁复杂的现象中发现一个科学中的问题,如何培养一种科研思维以及如何进行合理的科研设计,也就是导师常说的如何从一个“technician”真正成为一个“scientist”。在此,谨向导师表示最诚挚的感谢! 本论文的顺利完成,离不开各位老师、同学和朋友的关心和帮助。在此衷心感谢兰大二院泌尿外科研究所的洪梅老师、付生军老师、卢建中老师、陶燕老师,感谢他们在实验过程中给予的实验指导和无私帮助， 在此还要衷心感谢研究组中卢泽平博士、肖楠博士、翟振兴博士、丁辉博士、王娟霞博士、张耘新博士,感谢张红娟、李仁举、李姝文、祁媚娇、王东敏、王文赟硕士以及其他师兄妹,感谢他们在实验过程中给予的热心帮助及配合,没有他们的协助和支持就没有办法完成我的学位论文,同窗之间的友谊永远长存， 衷心感谢甘肃省中医学院实验动物中心、兰州大学基础医学院实验中心提供的在动物实验及分子生物学实验方面的技术帮助和支持， 衷心感谢本课题的合作单位北京五加和分子医学研究所有限董小岩研究员及其带领的团队在病毒合成方面给予的帮助和支持， 衷心感谢所有在我博士论文完成期间给予我帮助的人们,我们同甘共苦,相濡以沫,感谢你们， 最后,我由衷的感谢我的家人们在三年中给予我的深深理解、坚定支持和无言奉献， 86