番石榴叶颗粒制备工艺、质量控制及指纹图谱的研究（可编辑）

番石榴叶颗粒制备工艺、质量控制及指纹图谱的研究（可编辑） 番石榴叶颗粒制备工艺、质量控制及指纹图谱的研究 , . 、 . :: : . :. ,西华大学学位论文独创性声明 作者郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下进行 研究工作所取得的成果。尽我所知,除文中已经注明引用内容和致谢 的地方外,本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果,也不 包含其他已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志 对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 若有不实之处,本人愿意承担相关法律责任。 “ 学位论文作者签名:昱赫铋 指导教师签名: 毡强。口、玉?,占’ 凝:珈》、豇 西华大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定, 在校攻读学位期间论文工作的知识产权属于西华大学,同意学校保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查 阅和借阅,西华大学可以将本论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复印手段保存和汇编本学位 论文。保密的论文在解密后遵守此规定 指导教师签名: 学位论文作者签名:旦黥赢 日期:幽/ 。“ 日期幽护.一二..、、 ” 产 \ 、西华大学硕士论文 摘 要 目的建立番石榴叶药材中总黄酮、槲皮素含量测定方法,优选番石榴叶颗粒制备 工艺条件,并进行番石榴叶颗粒质量及指纹图谱研究。 方法?番石榴叶药材总黄酮、槲皮素含量测定方法考察:以芦丁对照品为对照, 利用亚硝酸钠.硝酸铝比色法,使用法测定番石榴叶药材中总黄酮含量;以槲皮素 对照品为对照,采用法测定番石榴叶药材中槲皮素含量。?番石榴叶颗粒制备工 艺条件优化:采用正交实验筛选最佳提取工艺;通过比较用浸膏直接制粒和喷雾干燥成 干浸膏粉后制粒两种工艺的优缺点,确定番石榴叶颗粒的成型工艺,并进行半成品质量 控制及小试研究。?番石榴叶颗粒质量控制及指纹图谱研究:分别采用法 和法对番石榴叶颗粒进行定性鉴别、定量测定;同时,参照中药注射剂质量控制 中采用的指纹图谱技术,对批样品进行相似度,建立番石榴叶颗粒指纹 图谱。 结果?芦丁对照品在四./的浓度范围内处检测具有良好的线性 关 系,加样回收率达到.%;槲皮素在.~..与峰面积呈良好的线性关系,加 样回收率达到.%。?番石榴叶颗粒制备工艺为:以倍量%乙醇作为溶剂,提 取次,每次小时;合并药液,浓缩到相对密度为.?的浸膏,加倍量水, 静置小时,滤过,滤液浓缩至相对密度为.?的清膏,在进风温度为?, 进料量为%的条件下喷雾干燥成千浸膏粉;采用干浸膏粉:可溶性淀粉:阿斯巴甜 ::::.,加适量%淀粉浆制粒,所制的的颗粒各项指标符合药典要求。 ?采用法定性鉴《番石榴叶颗粒中的槲皮素,种展开方法均表明,在槲皮素对 照品相应位置,有相同斑点:采用法测定番石榴叶颗粒中的槲皮素含量,方法学 考察表明,该方法准确、可靠,可用做番石榴叶颗粒槲皮素含量的测定方法。采用国家 药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统版’’计算批番石榴叶 颗粒的相似度,结果表明,不同批次的番石榴叶颗粒指纹图谱似 相度达.以上,说明 所建立的指纹图谱方法可行。 结论该制剂制备工艺合理可行,质量标准可控,成品质量基本稳 定。 关键词:番石榴叶颗粒;制备工艺;质量控制;指纹图谱槲皮素.? , , ., . . 五? :?./., .%. , .~..,. %.? ., : 诵%.. .?., .,?, %, ,::::.? , . , : . , , :, 吐, 西华大学硕士论文 目 录 第章绪 论??.一一 研究背景.:. 番石榴叶研究概况??.... .番石榴概况.. .番石榴叶作为降糖药物的研究进展??.. .番石榴叶化学成分研究?.. .番石榴叶的药理作用??.. 黄酮类成分研究概况??一??.. . 黄酮类成分的化学成分研究??一. .黄酮类成分的提取方法研究??一. .黄酮类成分的含量测定方法??.? 指纹图谱研究概况??一. 立意义??:?一.. . 临床需要?.. .市场需要?.. . 药食两用资源开发的需要.. 研究目标及技术路线?一. . 研究目标?.. .技术路线?:.. 创新点??.. 第章番石榴叶中总黄酮、槲皮素含量测定方法的建立??..一? 材料与试剂??.一 . 材料?.. . ? .主要试剂一. . 仪器?.一 . 试验方法.. . . 番石榴叶药材总黄酮含量测定一. .番石榴叶中槲皮素含量的测定一. 实验结果.. . 总黄酮含量测定一. .槲皮素含量的测定??.... 第章番石榴叶颗粒制备工艺研究??..一? 材料和试剂??.. . 材料?... .试剂??一. . 仪器?... 试验方法.. .工艺流程图??.... .提取工艺研究?一. .湿法制粒成型工艺研究一. 结论??...?..? .番石榴叶颗粒制备工艺研究??一一 .番石榴叶颗粒质量标准研究??一 指纹图谱研究??一 一 讨论?.. .提取溶剂的筛选?? .质量控制一 参考文献?一一 全文缩略词?一一 作者在读期间科研成果简介??.一一 致 谢??一一 ?西华大学硕士学位论文 第章 绪 论 研究背景 糖尿病 ,古称消渴病,医史记载已逾两千年【 。是终身 性疾病,易并发微血管肾病、视网膜病变、白内障等、大血管并发症和神经系 统病变【】。随着社会经济的发展、人民生活水平的提高、生活方式的改变,糖尿病患病 率呈迅速上升趋势。年月公布的《中国居民营养与健康状况》调查结果表明, 我国成人糖尿病患病率为.%,大城市岁以上人群糖尿病患病率由.%上升到 .%;估计全国糖尿病现患者人数达多万。我国已成为糖尿病发病的“重灾区”, 是全球糖尿病第二大国。预测年,中国的糖尿病患者将达万【。糖尿 病已经成为仅次于肿瘤和心血管疾病的“第三号杀手”。但糖尿病是由多种遗传和环境因 素相互作用而引起的一组慢性代谢异常综合症,其病因和发病机制非常复杂,至今尚未 完全明了。 糖尿病是由多种病因引起的代谢紊乱,属于一种内分泌失调的疾 病,其特点是慢 性高血糖,伴有胰岛素分泌不足,或对胰岛素产生抗拒,或两种现象同时出现而导致血 糖过高,碳水化合物、脂肪及蛋白质代谢紊乱;部分患者过多的糖,经尿液排出,出现 糖尿现象。年,美国糖尿病协会依据病因和发病机制对糖尿病进行了新 的分类,将其分为类:型糖尿病,其发病机制是自身免疫性细胞被破坏,其 人类白细胞抗原为和或,多为基因遗传; 型糖尿病,其 发病机制是胰岛素抵抗和或分泌不足,与类型无关,也多为基因遗传; 特意型糖尿病,其中青年发病的成年型糖尿病. , 为常染色体显性遗传,矮妖精貌综合症、脂肪萎缩性糖尿病和 .综合症为常染色体隐形遗传,均为单基因遗传,符合孟德尔遗传定 律;妊娠糖尿病,是由于个体在妊娠这个特殊时期的调节不正常引起的【。它的诊 断标准如表.所示。 表.糖尿病的诊断标准 . 任何时候血糖浓度三 ?。//;典型的糖 典型糖尿病症状 尿病症状包括多尿、多饮和无法解释的体重降低。 空腹血糖 ?./ /;空腹是指无热量摄入至少小时, 糖耐量试验 葡萄糖负荷无水葡萄糖后小时血糖? .//番石榴叶研究概况 .番石榴概况 .如图.所示之原名载于《南越笔记》,云.‘‘小 番石榴 花黄白,果如梨大,生青熟黄,连皮食香甜。六月熟。”属于桃金娘 科番石榴属的常绿 灌木或小乔木。’它主要生于荒地或低丘陵上。我国华南各地栽 培,常见有逸为野生者。 鍪 砬蠢麓撼。矗。。 图. 番石榴和番石榴叶.. 番石榴别名芭乐、鸡矢果;番石榴传入我国己有多年的历史,我国 主要引种栽 培的省份有广东、广西、福建、海南、台湾,另外,云南、贵州和 四川的一些地方也有 栽培,番石榴全身是宝,果味独特、鲜美,富含有益于人体的各种营养成份,既可鲜食, 煮熟吃,酿酒,又可加工成果汁、果酱、罐头等系列产品,还具有药用和保健作用。番 ~毫克,约为柑橘的三倍;因此,国外医学家 石榴平均每百克果肉含、维生素 有用番石榴汁作为婴儿饮料,而北极探险队员没人配给英两番石榴粉,就可保障三个 月的维生素的需要量;番石榴性温,味甘、涩、酸,无毒。具有收敛止泻,消炎止血 的功效;其叶、果能治疗急、慢性肠炎,痢疾,小儿消化不良;鲜叶外用治跌打损伤, .’.西华大学硕士学位论文 外伤出血 。至于番石榴的降血糖作用,最早为日本科学家在动物试验中所证实。我国 台湾省采用番石榴汁或酱治疗糖尿病也很普遍【。大陆民间也有这方面的例子,比如轻 度患者,每日三餐后各服~杯番石榴汁,即有疗效。若取番石榴干果克,苦瓜一 个,水煎服,每日~次,对改善糖尿病症状也有较好的效果。在国外, 尤其是印度、 巴西、秘鲁、墨西哥等国也有用番石榴治疗糖尿病的报道。 .番石榴叶作为降糖药物的研究进展 年,广西医学院将番石榴的鲜绿叶洗净晾干,干叶用水煮沸腾提取,滤液浓缩 成膏状:膏状提取物再与干叶打成粗粉混合干燥、打碎、过筛而得细粉,加%淀粉做 黏合剂制成颗粒,干燥后加硝酸镁压片,制得降糖片一号【】;提取番石榴叶的总黄酮制 成胶丸得降糖片二号;将番石榴连果皮带核压碎,制成果汁,与罗汉果煎熬液混合,制 得消渴饮。种制品用于临床试验都获得较好的降血糖疗效。桂永洪等【】以闽南民间中 草药单方番石榴为主药鲜番石榴或番石榴干,配伍玫瑰茄、乌梅丹参等组成的番石 榴煎汤空腹饮服,临床上治疗型糖尿病,取得较满意疗效。朱珠碧贞【】将未成熟番石 榴摘下晒干,放入密封塑料袋中保存,让患者每天取出粒研成粉冲水引用,半年后 血糖和尿糖均维持在较理想的水平且未见任何副作用。 番石榴叶不同的提取物降血糖作用可能不同。通过透析法对番石榴叶水提物进行分 级,研究不同分子量的提取物对链脲菌素诱导的糖尿病大鼠降血糖作用结果显示, 可透析部分分子量小于,不可透析部分是糖蛋白;而分子量在和之 间的叶水提物表现最强的降糖活性【引。水提物和水回流提取物降糖分别为.%与 .%,并且腹腔注射用药的降血糖作用强于口服用药【】。在临床实践和动物试验研究 中,采用番石榴果、果汁或其他草药组成配方治疗糖尿病也取得了明显疗效。 目前研究认为,番石榴降糖有效成分主要是黄酮类化合物,番石榴多糖中的黄酮类 物质可以保护溶酶体膜的稳定性,防止溶酶体破裂造成.乙酰氨基糖苷酶的释放,维 持血糖的稳定,也能刺激糖原合成,降低血糖旧。 .番石榴叶化学成分研究 番石榴叶的开发利用已经有很长的历史,它的主要功效成分为芳香类二级代谢产物 多酚类物质。在它的叶子中已经发现含有槲皮素、篇蓄苷、番 即槲皮素一一?一吡喃阿拉伯糖苷:并含有挥发油,如 石榴苷, 丁香油酚,顺一一己烯一卜醇....等。试验表明正是这些酚类 化合物赋予番石榴叶多种功效【】。 李吉来等用气相色谱一质谱联用技术了番石榴叶挥发油的化学成分,分出个 峰,通过计算机检索与标准图谱对照鉴定了种成分,确定主要为倍半萜类和单萜类 物质。黄建林等【】利用技术和硅烷化反应一起分离、鉴定番石榴叶乙醇提取物的蚕互揎吐题撞益备工艺亟量控型建撞筮图谱硒究 一. 化学成分,将样品质谱图与标准物质的质谱图和保留时间与标准谱图库中的谱图进行对 比鉴定了种成分。归一化定量分析结果显示三萜酸、糖和多酚是番石榴叶乙醇提取 物的主要成分。 .番石榴叶的药理作用 .. 降血糖作用研究 番石榴叶辅助降血糖功效成分之一可能是黄酮类化合物。体外研究表明,番石榴叶 提取物可以促进胰岛素与其受体结合,抑制受体后酪氨酸磷酸酯酶活性,提示番石榴叶辅助降血糖作用与改善胰岛素敏感性有关‘。据报道 .,以链脉霉素 诱发大鼠糖尿病筛选有降血糖活性的传统药物时,实验得出: 番石榴叶水提物的 降血糖效果最好;其降血糖的有效活性成分是分子量在和之间的糖 蛋白: 降糖效果是作用在外周组织而不是胰腺本身。吴建中‘、范照冬【】等的研 究均表明番石榴叶提取物均有较好的降血糖作用。而这种降糖作用主要与黄酮苷提高胰 岛素敏感性及番石榴富含的维生素及微量元素对胰岛细胞保护、胰岛素释放的调节、 糖代谢的调节有关【。 ..解痉止泻作用 肠道感染由于化学性炎症介质分泌增加,乙酰胆碱分泌增多,作用于肠道胆碱能受 体,使肠道蠕动亢进,水、电解质、食物中的营养物质等在肠道停留时间缩短,来不及 完全吸收而被排出体外,引起腹泻。槲皮素能够抑制离体豚鼠回肠乙酰胆碱的释放,拮 抗激动剂乙酰胆碱引起的离体豚鼠回肠的收缩反应,抑制离体豚鼠回肠的自发收缩,抑 制小鼠小肠的推进功能。进一步的研究表明槲皮素能够拮抗钙离 子通道,减少钙离子进 入细胞内,从而使细胞内钙离子浓度降低。基于此,有研究表明槲皮素拮抗乙酰胆碱的 可能机制是其对突触前钙离子通道 调节有关。 ..抗菌作用研究 程天印等【】通过琼脂平板抑茵试验表明:番石榴液提取物对大肠杆菌、沙门氏杆菌、 巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌均有抑制作用。除此之外,研究表明,无论叶的水提、甲醇 提、氯仿提的提取物,均有较好的抑菌效果。 等【证实番石榴叶提取物黄酮类 对肠炎沙门菌和蜡样芽孢杆菌有良好的抑制作用。 黄酮类成分研究概况 . 黄酮类成分的化学成分研究 黄酮类化合物在植物中分布广泛,存在于植物的叶核果实中,大部分西华大学硕士学位论文 与糖结合形成苷类以配基形式存在,少部分以游离形式存在,是一类具有抗氧化、抗肿 瘤、抗过敏、抗炎症等多种生物活性的多酚类化合物引。它主要是指两个苯环通过中央 三碳键相互连接而成的一系列化台物【州如图.所示。目前已经知道并且具有重要 药用价值的主要有黄酮、黄酮醇、双氢黄酮及双 氢黄酮醇、异黄酮和查耳酮;一般来说它们的苷元都属于 色原酮的苯基衍生物。 图. 黄酮类化合物和槲皮素分子结构.. .黄酮类成分的提取方法研究 黄酮类成分的主要提取方法有水提法、有机溶剂提取法、酶解法和超临界提取法等。 不同提取方法对于有效成分的提取程度、剂型的选择都具有重要意义;不同提取方法的 比较如表.所示。 表.黄酮类成分提取方法 ..黄酮类成分的含量测定方法 .. 紫外可见分光光度法 黄酮类化合物多用比色法测定,其基本原理是以芦丁为标准品,络合体系 显色,在最大吸收波长处测定其吸光度,以此来计算含量。但硝酸铝比色法专一性较差, 测定受处理过程颜色变化的影响。 ..纸色谱法 纸色谱用于黄酮类分析选择性和重现性较差,一般作为定性检测。 ..薄层色谱法 薄层色谱法具有设备简单、操作方便、分离速度快等特点,使用检测时固定 相一次性使用,样品无需复杂处理,分离物的性质不受限制,应用广泛。此外,薄层色 谱图像可提供原始彩色图像,不仅便于保存原始图像,而且可以提供较多信息,直观性、 可比性均较好都是此法的独特之处。但其分辨率和重现性等不如高效液相色谱法和气相 色谱法,常被作为定性和半定量的手段。 ..高效液相色谱法 分析黄酮类化合物,正相系统一般采用乙烷或异辛烷等体系为流动相,以极 性较大的乙醇、丙醇、乙睛等有机溶剂调节。反相体系则一般优选甲醇/水及乙腈/水体 系为流动相,还需要加入酸调节值,抑制解离,克服拖尾现象。此法分辨率和重现 性都很高,被广泛使用,常用于定性、定量分析。 指纹图谱研究概况 中药指纹图谱是借用法医学指纹鉴定的概念,采用综合的、可量 化的鉴定手段。借 以鉴别中药的真伪、评价原料药材、半成品和成品质量的均一性和稳定性。其基本属性 是“整体性”和“模糊性”。 随着现代科技的进一步发展,借鉴化学药品的质量控制方法,中药的质量控制有了 质的变化,开始通过中药特别是植物药内在有效成分或指标的定性定量分析来控制 药品的质量,取得瞩目的成就。但由于中药所含成分的多样性,在现阶段,要研究清楚 每味药材,甚至每个中药复方内在物质基础,难度极大。而现代色谱和波谱技术可以将 药材所含的多种成分一一分离并给出多种与质量有关系的数据和信息,构成具有专属性 的物质群的指纹图谱,展现了从整体的角度评价和控制质量的可能性。几个物质群在相 同的仪器、相同的实验条件、相同的操作方法下所得到指纹图谱相同似性,即可反 应这些物质的同属性;所以,指纹图谱技术是当前带动中药工业现代化的关键技术之一。 指纹图谱质控模式较以单一化合物为指标的质控模式有了质的改变,目前常用的色谱光西华大学硕士学位论文 只控制了%以下的成分,而大部分中药或是煎剂,或是经 入人体的部分往往大于%,大部分都在%以上,从这个 意义上说,在目前条件下进行的指纹图谱研究可以说只是“表观质量特征”,它比单一成 分的控制无疑是进了一步,但是,它距离与药效结合进行综合评价还有相当远的路要走。 指纹图谱常用的有色谱法、光谱法、质谱法及各种方法的联用,其中色谱技术使用 最多;尤其是高效液相色谱、薄层色谱和是公认的三种常规指纹图谱分析手段。如 表.所示。 表.中药指纹图谱研究方法 . 方法 特点 高效液相色谱 柱效高、灵敏度高、分离速度快、分析时间少、应用广泛,一般用于定量测 定,是目前最常用的分析方法之一 色 薄层色谱法 快速、经济、可靠、操作简单、适用范围广、重现性好,可以提供彩色图像、 谱 是目前中药鉴别中使用频率最高的一种方法 法 高选择性、高灵敏度、高分辨率;分析时间少、样品用量少;主要用于挥发 气相色谱法 性成分或通过衍生后能气化的成分的定量、定性分析。而.技术的发 , 展,对于富含挥发油类药材的鉴别已成为一种首选方法 红外光谱 对官能团的化学定性鉴别专一性强,对药材可进行“无损伤”检测;得到的红 光 外光谱是药材中各种成分红外光谱的叠加,是药材整体本质的反映 谱 紫外光谱 它是电子光谱,吸收光谱的峰位取决于电子能级差,它反映的是分子的电子 法 结构特征,紫外光谱通常与、等技术联用 灵敏、精确;通常只需要微克级或更少量样品便可分析鉴定,它常与其他检 测方式联用;串联质谱法.用于粉末细粉药材或成药的分析、鉴定 质谱法 等离子体质谱.用于进行道地药材的判别与选择;电喷雾离子化质 谱?用于药材的降解产物、药材代谢产物的分析鉴定 立题意义 . 临床需要 我国是全球糖尿病第二大国,现在市面上治疗糖尿病的药物主要是口服降糖药和胰 岛素治疗,如磺酰脲类,它刺激胰岛素分泌;双胍类,它增强非胰岛素和胰岛素介导的 葡萄糖代谢等等。这类化学降糖药尽管见效快,但对肝、肾等脏器损害较大,长期使用 胰岛素会导致机体胰岛素受体敏感性降低,产生胰岛素抵抗,不能利用胰岛素,最终使 病情加重;且西药价格较贵,患者和家属的经济负担较重;而中药性质温和、毒副作用 小,开发潜力很大。番石榴叶为降血糖的常用中药,在降血糖方面有着独特的疗效。蚕石摆吐脑拉剑备王艺厦量撞剑及指缠图谱硒究 .市场需要 年月公布的《中国居民营养与健康状况》调查结果表明,我国成人糖尿病 患病率为.%,大城市岁以上人群糖尿病率由.%上升到.%,全国糖尿病患者 人数为多万,另有近万人糖耐量受损的糖尿病高危人群。预 测年中国的糖尿病患者将达万。而临床试验表明,番石榴叶提取物具有明显 的降血糖作用。利用番石榴叶治疗糖尿病的独到之处降血糖作用温和持久,毒副作用 小,具有综合治疗作用可有效地延缓糖尿病的发生与发展。 .药食两用资源开发的需要 糖尿病现有的治疗方法主要为饮食疗法和药物治疗。番石榴全身是宝,它既可以作 为药材治疗糖尿病,急、慢性肠炎,痢疾等症,也可作为水果、果汁、罐头食用。在临 床实践和动物试验研究中,采用番石榴果、果汁或其他草药组成配方治疗糖尿病也取得 了明显疗效。因此加强番石榴的开发、研究可为该药材资源的利用提供技术支持。 , 研究目标及技术路线 . 研究目标 考察番石榴叶颗粒制备工艺。 建立较为完善的番石榴叶颗粒质量评价标准。 建立番石榴叶颗粒指纹图谱评价技术。 . 技术路线图.技术路线图 .创新点 本文首次将番石榴叶提取物制成颗粒,改变了传统使用方法,该技术操作简 单、成本低,适用于大生产。 本文首次建立番石榴叶颗粒指纹图谱。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系 统研究版软件,计算结果表明,批次的番石榴叶颗粒指纹图谱相似度达. 以上,所建立的指纹图谱方法可行。番石榴叶总黄酮类物质具有明显的降血糖作用,而总黄酮测定主要采用进行测 定九,番石榴叶中芦丁含量较多且性质稳定,故本实验以芦丁对照品为对照,采用 法测定番石榴叶总黄酮含量;同时以槲皮素对照品为对照,采用法测定槲皮素含 ‘ 量。 材料与试剂 . 材料 番石榴叶药材购于攀枝花地区,用清水洗净,晾干,打碎。 .主要试剂 分析纯 成都科龙试剂厂 乙醇、、 、磷酸 分析纯 成都科龙试剂厂 甲醇 色谱纯 成都科龙试剂厂 芦丁对照品批号. 中国药品生物制品检定所 槲皮素对照品批号. 中国药品生物制品检定所 .仪器 .数显恒温水浴锅 江苏省金坛市医疗仪器厂 旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂 .循环式真空泵 郑州杜甫仪器厂 .电热恒温鼓风干燥箱 上海齐欣仪器有限公司 .型紫外分光光度计 尤尼科仪器有限公司型电子天平 .高效液相色谱仪 日本岛津 超纯水仪 密理博中国有限公司 .柱木. 小型超声波清洗机 东莞市嘉劲机械有限公司 .型溶剂过滤器 天津市津腾实验设备有限公司 水相、有机相. 天津市津腾实验设备有限公司 微孔滤膜 . 微孔滤头 天津市津腾实验设备有限公司 水相、有机相. 天津市津腾实验设备有限公司 微孔滤膜学位论文 品.,置容量瓶中,加甲醇适 刻度,摇匀,即得每中含无水芦丁 将对照品溶液于处进行全波长扫描,确定最佳检测波长。 ..标准曲线的制作 精密吸取芦丁对照品溶液、、、、、于容量瓶中,各加水至, 加入%摇匀放置;加入%摇匀放置;加入 .%,再加水定容至刻度,摇匀,放置后,以相应试剂为空白,照 法药典版附录,在处测定吸光度;以吸光度为纵坐标,浓度为横 坐标,绘制标准曲线。 .. 供试品溶液的制备 称取已粉碎过的番石榴叶细粉.,置于具塞锥形瓶中,精密加入甲 醇,称 定重量,超声处理功率,频率,冷却,再称定重量,用甲醇补足 失重,摇匀,滤过,精密量取续滤液,置于容量瓶中,加水定容,照 上述方 法处理,依法测定吸光度,从标准曲线所得到回归方程中计算出 供试品溶液中总黄酮的 浓度/,计算,即得。 ..番石榴叶药材中总黄酮含量的测定 按供试品溶液制备方法制备供试品溶液,在最大吸收波长下测定 吸光度,根据标准 曲线计算样品中总黄酮含量;计算公式如公式.所示。 .““ 掣 其中,:样品中总黄酮含量/ :表示从标准曲线中所得到回归方程中计算出的总黄酮的浓度/ :药液体积 :浓缩倍数 :番石榴叶的投料量..供试品稳定性试验 将供试品溶液分别在,,,,分钟,于处测定吸光度,并计算其相对 标准偏差。 ..加样回收试验 精密称取己知含量的番石榴叶药材细粉./份,分别加入对照品 溶液/、、、、、,按照供试品溶液制备方法制备 溶液,测定总黄酮含量:按公式.计算加样回收率。 一彳 ‘? 回收率%丁×% 其中,:为供试品所含被测成分量 :为加入对照品量 :为实测值 .番石榴叶中槲皮素含量的测定 .. 色谱条件 色谱柱: 柱.; 流动相:甲醇..%磷酸溶液:; 检测波长:; 流速:./; 柱温:? ..对照品溶液的制备 精密称定在?干燥至恒重的槲皮素对照品适量,置于容量瓶中, 用甲醇西华大学硕士学位论文 溶解并定容,制的槲皮素标准品溶液浓度为. /;过.微孔滤膜,备用。 ..供试品溶液的制备 称取已粉碎过的番石榴叶细粉,置于具塞锥形瓶中,精密加入甲 醇,称定 重量,超声处理功率,频率,冷却,再称定重量,用甲醇补足失 重,摇匀,滤过,吸取一定量样品溶液过.微孔滤膜,备用。 ..线性关系考察 分别吸取、、、、对照品溶液,照上述色谱条件测定峰面积积分值。 以进 样量为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线,并计算回归方程。 ..精密度试验 精密吸取上述槲皮素对照品溶液,重复进样次,于下测定,并计算 相 对标准偏差值。 ..重复性试验 按供试品制备方法,对同一批样品,分别取样平行测定次,于下测 定,并 计算相对标准偏差值。 ..对照品稳定性试验 取槲皮素对照品溶液于、、、、 ,分别进样 ,于下测定,测 得槲皮素峰面积值并计算相对标准偏差值。 ..供试品稳定性试验 取供试品溶液于、、、、 ,分别进样肛,于下测定,测得槲皮 素峰面积值并计算相对标准偏差值。 ..加样回收率试验 精密称取已知槲皮素含量的番石榴叶药材细粉./,共份,分 别加入对照品溶液./、、.、.、、,按上述供试品制 备方法制得供试品溶液,测定槲皮素的含量计算回收率。 实验结果 .总黄酮含量测定 .. 测定波长的确定 将对照品溶液、供试品溶液分别在~处进行紫外扫描,结果见图. 及 图.。图.样品紫外扫描图.. 由图.及图.可以看出,对照品溶液、样品溶液在处均有最大吸收, 在 该波长处波峰平缓,波形较好,含量测定较准确,结合参考资料最 终确定以为测 定波长。 ..标准曲线的绘制 精密吸取芦丁对照品溶液、、、、、于容量瓶中,各加水至, 加入%摇匀放置;加入%摇匀放置;加入 .%,再加水定容至刻度,摇匀,放置后,以相应试剂为空白,照 法药典版附录,在处测定吸光度;以吸光度为纵坐标,浓度为横 坐标,绘制标准曲线。结果见表.及图.。西华大学硕士学位论文 表. 总黄酮标准曲线测定结果 .,体积 吸光度 浓度/. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 《 . 避 采. 留. . . . . . . . . 浓度/ 青 图.总黄酮标准曲线.. 由图.可知,芦丁对照品溶液在./撇度范围内具有良好的线性关 系, 回归方程为:..,.。式中:一浓度,/;卜吸光度 ..精密度试验 对同一对照品溶液连续于波长处测定次,测得吸光度值,计算相 对标准偏 差,结果见表.。 ?准偏差:结果见表.所示。 表.对照品稳定性试验结果 . ..西华大学硕士学位论文 由上表可知, 值为.%%,说明稳定性良好。 ..供试品稳定性试验 将供试品溶液分别在,,,,分钟,于处测定吸光度,并计算其相对 标准偏差,结果见表.所示。 表.供试品稳定性试验结果 . 由上表可知, 值为.%%,说明稳定性良好。 ..加样回收试验 精密称取己知含量的番石榴叶药材细粉./份,分别加入对照品 溶液/、、、、、,按照供试品溶液制备方法制备溶 液,测定总黄酮含量;结果见表.所示。 表.加样回收率试验结果 . 实验结果表明,该方法具有较好的回收率,测定方法可靠。 .槲皮素含量的测定 .. 系统适用性试验 分别吸取色谱甲醇、对照品溶液、供试品溶液各,按以上色谱条 件注入液相色 谱仪测定,记录色谱图,结果见图.、.、.所示。番石榴叶颗粒制 各工艺、质量控制及指纹图谱研究 薹? 幽一 锄. . ? . ? . . . . ? ? 葶 摹’ 时间如 图.甲醇色谱图 .. 至 幽? 删. ? ?? “ ? 譬 曼薹 萎 .』 ? /吾 : 言 图.槲皮素对照品色谱图 .. 图.供试品色谱图 .. ..西华大学硕士学位论文 结果表明,采用本色谱条件,槲皮素的保留时间为分钟,分离度大于.,且在 与槲皮素对照品相同的保留时间内,空白无干扰。 ..线性关系考察 分别吸取、、、、对照品溶液,照上述色谱条件测定峰面积积分值。以进 样量为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线,并计算回归方程;结果见表.及图. 所示。 表.槲皮素线性关系考察结果 .图.槲皮素标准曲线 .. 结果表明:槲皮素对照品进样量在.?.时与峰面积呈良好的线性关系。 ..精密度试验 精密吸取上述槲皮素对照品溶液,重复进样次,于下测定,并计算 相对标准偏差值,结果见表.。 % 峰回积 试验次数 . .. . . 由上表可知,实验表明,槲皮素对照品溶液峰面积值的为.%%,说 明 仪器精密度较好。 ..重复性试验 按供试品制备方法,取同一批供试品份,按上述供试品溶液制备 方法制成供试品 溶液,测得槲皮素峰面积值及值,结果见表.所示。 表.供试品重复性试验结果. % 峰面积 试验次数 . . . . ’. . 实验表明,样品含量的为.%%,说明方法重现性较好。 ..对照品稳定性试验 取槲皮素对照品溶液于,,、,各进样止,于下测定,测得槲皮 素峰面积值并计算值,结果见表.所示。 . .西华大学硕士学位论文 表.对照品稳定性试验结果 .实验表明,样品溶液峰面积值的为.%%,说明在小时内对照品溶 液 的稳定性较好。 ..供试品稳定性试验 取供试品溶液于、、、、 ,分别进样“,于下测定,测得槲皮 , 素峰面积值并计算相对标准偏差值,结果见表.所示。 表. 供试品稳定性试验结果 .实验表明,供试品溶液峰面积值的为.%%,说明在小时内供试品 溶 液的稳定性较好。 ..加样回收试验 称取已知槲皮素含量的番石榴叶药材细粉./,共份,分别加 入对照品溶液./、、.、.、、,按上述供试品制备方 法制得供试品溶液,测定槲皮素的含量,计算回收率结果见表.。 表.加样回收率试验结果 . 平均加样凹 加样回收 供试品所含被 加入对照品量 实测含量 试验 药材加 ‘ 率% 收率% 次数入量测成分量 . . . . . . .。 . . . . . . . ‘ . . . 实验结果表明,该方法具有较好的回收率,测定方法可靠。 . .西华大学硕士学位论文 第章番石榴叶颗粒制备工艺研究 本处方只含有番石榴叶一味药,番石榴叶以汤剂用于临床治疗糖尿病多年,疗效确 切,但汤剂需临床新配,口服剂量大,久置易发霉变质,携带不方便,不适应现代用药 的需要,故考虑改革剂型。考虑到用药对象为糖尿病患者,为便于携带和长期服用,故 首先考虑选择制成固体制剂。在本处方中,药材醇提后干膏收率为.%,日处方量 为,日服干膏为.,若做成片剂或胶囊剂,每片重.,即使不加辅料,日服 片,服药量太大;若做成糖浆剂,稳定性较差,成本较高;若做成颗粒剂,干膏:辅 料约为:,每日约,服药量可以接受,且方便携带,工艺简单,易于大生产。故 选择将其制成颗粒剂。 水和乙醇作为最常使用的提取溶剂,各有优缺点,而研究表明番石榴叶水提物和醇 提物均有辅助降血糖的功效】,本实验通过比较水和乙醇提取效果,以总黄酮含量、 槲皮素含量和干膏收率为考察指标,优选出最佳的提取工艺条件。 在最佳的提取工艺条件下,分别考察用浸膏直接制粒与喷雾干燥成干浸膏粉后制粒 两种工艺的优缺点,筛选最佳的制粒工艺,并进行中间体质量控制及小试研究。 材料和试剂 . 材料 番石榴叶药材购于攀枝花地区,用清水洗净,晾干,打碎。 .试剂 乙醇、、 分析纯 成都科龙试剂厂 、磷酸 分析纯 成都科龙试剂厂 甲醇 色谱纯 成都科龙试剂厂 芦丁对照品批号. 中国药品生物制品检定所 槲皮素对照品批号. 中国药品生物制品检定所 .仪器 ?数显恒温水浴锅 江苏省金坛市医疗仪器厂 旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂 一循环式真空泵 郑州杜甫仪器厂 一电热恒温鼓风干燥箱 上海齐欣仪器有限公司 型紫外分光光度计 尤尼科仪器有限公司 型电子天平 .高效液相色谱仪 日本岛津东莞市嘉劲机械有限公司 小型超声波清洗机 天津市津腾实验设备有限公司 .型溶剂过滤器 天津市津腾实验设备有限公司 水相、有机相. 微孔滤膜 . 天津市津腾实验设备有限公司 .微孔滤头 水相、有机相. 天津市津腾实验设备有限公司 .微孔滤膜 试验方法 .工艺流程图 图.工艺流程图.. .提取工艺研究 ..提取溶剂考察 准确称取番石榴叶药材,按料液比为:的比例,分别用水、%乙醇、% 乙醇、%乙醇提取次,每次小时,测定提取液中总黄酮含量、槲皮 素含量及干膏 收率。 ..正交试验 采用乙醇热回流法提取,选择乙醇浓度、乙醇用量、提取次数和 提取时间四个因素, 每个因素选择三个水平见表.,按正交表安排试验见表.。每次试 验取番石榴叶,共计份,进行乙醇回流试验,以总黄酮含量、槲皮 素含量及干膏 收率为指标,进行综合评分,从中筛选最佳工艺。 西华大学硕士学位论文 总黄酮含量 槲皮素含量 干膏收率 试验号 / / % ,/ /×/× ..提取液醇提水沉工艺考察 分别浓缩药液至相对密度为.。、.、.。,测定总黄 酮含量,再将最佳浓缩程度下的浸膏分别加入倍量、倍量、倍量水,静置小时 后测定药液中总黄酮含量,以确定最佳水沉工艺。 .湿法制粒成型工艺研究 .. 浸膏直接制粒与喷雾干燥成千粉后制粒工艺比较 以制粒工艺辅料用量、颗粒溶化性、总黄酮含量、生产效率、难易程度为考察指标, 对两种制粒工艺进行评价。 ..喷雾干燥影响因素考察 以进风温度、药液相对密度、进料量为考察因素、每个因素选择三个水平见表., 按正交表安排试验,以总黄酮含量为考察指标,筛选出喷雾干燥最佳工艺。表.因素水平表 ....辅料筛选 以制粒难易、口感、为考察指标,筛选辅料比例、矫味剂用量,确定湿法制粒工艺 条件。 .中间体质量控制研究 为保证成品质量的一致性、稳定性,在该制剂制备过程中,须对半 成品进行质量控 制,为此测定了颗粒的休止角、堆密度、粒度、水分、溶化性、吸湿性。 .. 休止角 休止角是微粉或颗粒流动性的表示方法之一。其测定方法一般是使微粉或颗粒经一 漏斗流下并成圆锥体堆。设锥体高为,锥体底部半径为,贝/,【即为休止角。 测定中采用了固定圆锥槽法:由固定大小的圆盒底或盖来接受由漏斗漏下的颗粒,漏斗 中不断注入颗粒,直至得到最高的圆锥体为止,计算出休止角。 ..堆密度 堆密度是指单位容积微粉或颗粒的质量。测定方法:称取一定重量的颗粒,装入 量筒中,以固定高度落下数次每次保证试验条件一致,使松紧适宜,以重量及容积 计算其堆密度。 ..粒度、水分、溶化性 均按版药典一部附录 项下颗粒剂操作。 ..颗粒吸湿性考察 ... 吸湿平衡时间测定 取底部盛有过饱和溶液的玻璃干燥器,干燥器内置一称量瓶,放入恒温干 燥箱内恒温时,此时干燥器内的相对湿度为%。取份样品,每份样品约,置 称量瓶中,精密称定,将称皿盖打开,放入干燥器上部,于恒温干燥箱内保存,每 隔一定时间取出份样品称重一次,计算各时间的吸湿百分率,并绘制本品的吸湿平衡 曲线。 ..西华大学硕士学位论文 ...临界相对湿度 为考察湿度对颗粒的影响,进行平衡吸湿性试验,制出本品吸湿平衡曲线。取六份 颗粒,每份约,置称量皿中,精密称定,打开称量瓶盖,放入相对湿度为%、%、 .%、.%、.%、.%的环境中,于条件下放置时,取出称量皿,加 盖后精密称定,计算吸湿量,以相对湿度为横坐标,吸湿量为纵坐标,绘制吸湿曲线。 .小试 取番石榴叶药材,小试三批样品,验证试验结果。 结果 .剂型选择 通过上述比较可知,确定将番石榴叶提取物制成颗粒剂。 .提取工艺研究 ..提取溶剂考察 以水、%乙醇、%乙醇、%乙醇作为提取溶剂,筛选提取溶剂,结果见图. 所示。 图.提取溶剂的筛选结果.. 结果表明,采用乙醇提取时,药液中总黄酮含量、槲皮素含量均高于水提液,且千 膏收率也都低于水提液,有利于制粒,降低日服剂量;故选用乙醇作为提取溶剂。..正交试验设计 按“因素水平表”进行次试验,提取份供试液,按含量测定方法测定总黄酮、槲 皮素含量,并计算干膏收率,结果见表.及表.。 表.醇提正交试验结果 .、电/ ×//× 表, 乙醇回流提取总黄酮方差分析表 .. 从直观分析结果表明,番石榴叶醇提影响因素主次顺序为:;方差分析 结果表明:因素的影响有显著意义,确定提取最佳工艺为:,即加 入倍量 %乙醇,回流提取次,每次。 ...醇提工艺验证试验 取番石榴叶药材细粉份,加入倍量%醇,提取次,每次,分别 ..西华大学硕士学位论文 测定药液中总黄酮含量、槲皮素含量及干膏收率,结果见下表所示。 表.醇提工艺验证试验 ...提取液醇提水沉工艺考察 分别浓缩药液至相对密度为.、.、.,考察浓缩 程度对水沉工艺的影响,再向最佳浓缩程度下的浸膏分别加入倍量、倍量、倍量 水,静置时后测定药液中总黄酮含量,结果如图.所示。 图.纯化工艺考察 . 如图所示,当药液浓缩至相对密度为.时,药液中总黄酮含量最高,而水 沉工艺中,加入倍量水和倍量水时,总黄酮含量差别不大,为了节约成本,选用加 入倍量水水沉。 ..醇提水沉工艺验证试验 取三批番石榴叶药材各,按上述方法醇提水沉、测定药液中总黄 酮、槲皮素含 量及干膏收率,结果见下表。