重组人类神经元信号蛋白1433zeta的表达纯化，多克隆抗体、单克隆抗体制备及其鉴定

重组人类神经元信号蛋白1433zeta的表达纯化，多克隆抗体、单克隆抗体制备及其鉴定 重组人类神经元信号蛋白1433zeta的表达纯化，多克 隆抗体、单克隆抗体制备及其鉴定 安徽医科大学 硕士学位论文 重组人类神经元信号蛋白14-3-3zeta的表达纯化，多克隆抗体 、单克隆抗体制备及其鉴定 姓名:胡敏 申请学位级别:硕士 专业:病原生物学 指导教师:沈继龙;汪学龙 20030501 英文缩略词表 窒塑墨登查兰塞羔鲎垒婆墨――一 克雅氏痰 Disease d CJDCreuzfl t―Jakob fate sul 十二:浣蓥硫酸 镝 Sodium SDS dodecyt 单克隆抗体 Monoclonal McAb antibody Medium Modified DMEMDulbecco’s 改良Eagles培券液 Ea91es Horseradish 燕攒过氯佬物酶 HRP peroxidase Dulbeceo’s Modified IMDMIscove’s 8一AG 8一氮杂鸟嘌岭 8-hzaguanine n neami 次黄嘌岭氯基蹀岭 thymidine H姆Hypoxanthinopteri 胸稼嘧髓孩瞢 ne HT di 次黄嘌呤胸腺嘧啶 tbymi Hypoxanthine HGPRT 次黄嘌呤鸟噤吟 guaninephosphoribosyl Hypoxanthine transferase 磷酸孩糖转移酶 PEG 聚乙二醇 PolyethyIenegiycol 1 im【【Iunosorbent ELISA inked 酶联免疫吸腿实验 assay Enzyme 免疫球蛋自 Immunoglobu]in 酬SO sulfoxide 二甲基亚砜 Dimethyl OPD 邻苯二胺 O-phenylenediamine 0D densi 光密发 ty Optical PAGE 聚丙浠酸胺凝 胶奄泳 electrophor8sis gel Polyacrylamide saline PBS 磷酸缓冲盐溶 液 Phosphate―buffered 安徽聪科大学硕士学位论文 隆、单巍隆抗体制备及其鉴定 安徽医科赶学病原生物带教研室研究生胡敏指导教师沈继龙教授 稳簧瑟魏鞠蚕撬人类静经露嵇号蛋自j4―3―3zeta翡多态隆挠搭与攀赢隆抗蒋， 为细胞信号传导及神经系统媳行性疾病的诊断提供标志物。方法用纯他的重组人 魅140(3信号蛋巍 rM4(3(3zeta 免疫家惫，甏蚤摭rhl4，3―3zeta多竟隆羲盎 清，以免疫双扩散法测定m清抗体效价，并以盐析法对彩克隆抗血清jj|; 行初步纯 养，间接ELISA淞筛选阳性克隧，挑取分泌抗体的杂交瘤细胞株:用有限稀释法进 水髓，经盐析法视步纯化该单克隆抗体;测定所褥抗体效价及其特异性殷应。结果 4-3―3zeta rhl4-3-3zeta蛋自发生特异馁反应。结论获得了敏感、特异的抗rbl 及蒋缀磊统运费瞧痰瘸魏诊磷提供势子轹避。 [关键词】14―3―3壤墨蛋白多毙隧撬盎清零克隆撬俸 2 壅堂堕型查堂堡:!:兰些丝兰 一一 一 Human ofRecombinant Purification and Expression the and zeta and 14―3-3zeta rhl4―3―3 Protein Preparation Monoclonal its and of Identification Polyclonal To andcharacterizethe and Abstract prepare polyclonal 0bjeetive recombinanthuman signalingprotein antibodies McAbs against was rhl4―3―3zeta IPTGinduction rhl4-3-3zeta (Methods proteinexpressedby were wereimmunizedwiththe to andthe slices gel lyophilized(Rabbits grindedgel from anti―rhl4―3―3zetasara(Titerofsera theimmunizedrabbitwas generatepolyelonal doublediffusion rhl4―3―3zeta detected assay(Purified through byagarose and wasusedtoimmunizeBALB,cmicefor3,4 was dialysis wit lmice B cellwasculturedintheHAT fused spleenlymphocytes(Thehybridoma medium(Theclonewasscreenedindirected selective positive by strainandidentifiedwith and IELISA subcloning，wegatheredsupernatantofhybridoma one cellstrainF7which secreted Western-blot(Finally hybridoma cell rhl4―3-3zetawasobtained(Thestrainwas inoculatedintothe antibodyagainst ofmice(then was wimsalt abdomen andthe hydroperitoneumpurified precipitation titerwasdetecedIELISA(Result rhl4― 3-3zetawereobtained( by Plenty ofpurified Thetiterofimmunoserafromrabbitswerel:8，,1:64(TheMcAb against wasobtainedits was to and subclassidentifiedbe titerof antigen IgGl(The waslxl06(TheMcAbcould and reactto the hydroperitoneum stronglyspecifically rhl4―3―3zeta The anti―rhl4-3―3zetaseraandthe expressed protein(Conclution cell secreted monoclonalantibodies lines，which consistently hybridoma against rhul beenobtainedforthe tothe of detective 4-3―3zeta，have development approach markerinthe ofneural diseasesandforthe of diagnosis degenerative study interactionincell transduction( protein-protein signal word]humanl4-3-3 [Key zeta,polyclonalantibody,monoclonal antibody 3 蜜徽腻料人学倾l学位论文 隆、单克隆抗体制餐及其鉴定 1引言 14-3-3，莛,缀禽度漂守，分京专势广泛 4―3―3信号蚕鑫溪 signalingprotein 性摄自质，并搬据其迁移位鼹命名为14(3。31“。匿前认为14(3(3家族宵7个亚型 参，,，s，#，‘，建，带 ，，“泛分密予真菝生物缀麓交，在晡飘动勃藏缀 含羹鏊黉。 物中有一组多肽与14―3―3相似，该提取物具有调节色氨陵羟化酶 TH 和酪氨酸 自威与近50种多功能信号缳自结合，参与细胞信号传导 cell signaling death 【2'3,。 programmed 浚蛋自通过二聚体形式与多种细胞储号肽结合，假进和介导蛋囱质之间相 互俸鼷，簌嚣奁不霹煮援诲巾浚醺众多生黪攀功爱。它弩raf-I 一静丝,芬羹酸激 酶 的多个位点结合，活化和维持其活性，通过分裂原活化疆白激酶 MAPK 通 蕊0弱箍;写cdc25镑舍，在G叠翅一M麓谎控点发挥佟搿 销。 体，推测与14-3―3tau的高磷酸化有关，而后糟控制AD脑编织双螺旋野维形成【?。 4 安微豚科人学f|J;!I。学位论史 对于揭示AD的痫理机理，临床诊断治疗具有重要意义四。 近年术14，3(3 x、f传染性海绵状脑瘸 在牛为疯牛瘸，在人为党雅氏瘸，即 CJD 、单纯疱疹性脑炎、l奁梗塞等穆经系统邋行性疾病豹诊断 A燕也嗣益受到关 注。IF常情况F 14w3―3在脑脊液 CSF 中含量甚微，而在一些神经系统疾病患 者，l《一3―3出袋经CSF中。攒溅燕凼于大爨季l鍪经元镪飑被破坏，蘩其瓣入CSF质 致。M一3„3浓艘可能与神经元破坏程度成正比。 Zerr等人报道”„:用,种改良的免疫印迹技术检测c』D病例，确渗病例中 的患者脑脊液中，l扣3 3办为阳性，而最终这两例均证实确为CJD。14―3―3蛋白 剐性预测率为9《(7,，掰性预测搴为92(4,。獒他脑脊液份柝趣现静14-3-3阳性多 觅于低氧性滴攒伤，非典型脑炎，代谢性滴瘸，单纯疱疹性脑炎等。Wakabayashi等 人发观14―3―3 痪毒愁藏炎患者豹麓脊滚中““，瑟无癸经系绞瘫获懿艾滋瘸塞者藏喾滚中剜未翡 检 乜。并且艾滋瘸昏迷患者脑脊液中的14―3―3皿型不同于所报道的cJo 以及单纯 跑疹性脑炎患暂腻脊液中的型测，提示弧型茶定可以作为鉴别渗断的一蕈中方法。 测对于各种原因引越的痴呆患者的诊断用价德，包括脑脊液14―3―3蛋白免疫印迹 法测定。结栗发瑷鸯糙秘塘褥滚缮本14―3―3为骧佳，其中饺嚣铡荛骥渗CJD， 其他则见于各利t邋行性痴呆病变，包括阿茨海尔默病 4例 ，额颞性痴聚 2例 ， j:|li 掰 i铡 。另掰镪强牲瘸铡泰麓秘确跫何静痴采往瘸受，提示对手癫呆巷者， S I(举位论文 安徽聪_fI 人学f|!;i 3毒毒肖赢凄魏蒋辩性、敏感往鞫掰性预灏债德。 戆溺14―3 Settoh等人应用免疫印逊及免疫细胞化学法刺神经性病变患糟神经组织、 壤莽耱露蕊脊滚嚣率送行了溺套““1。在掰检溅鳆释经及非搪经组缀i挈均照14―3―3 链灏膜毖烫，多发链褒霭疫，中强挥袭鬟 ，线粒俸瑟瘸及蔑琵瘾，嚣酸激中毒。这 protein 疑致静神经元缀鼹瘸变对，夯霹释敖灭艟脊滚，簌嚣成为实骚室渗繇豁 标志物。 近年来众多的临床研究表明，CSF中细脏信号转母蛋白14,3-3可作为一 穆巍窿蘸感帮将舅黪至臻学标记震予藜经悉统运嚣淫癌变瀚辜纛羹渗舔。’Fakahashi 等 1999 报告了【4―3―3 生物学意又及蕊廉渗断价值，我们实验室穗搬据家兔14-3-3zeta编硒貉因片段， 泼汁引物，从人炎大脑神经原细胞基因组中瓶隆和扩增出人类J4―3―3zeta亚型基 戳，溅序幕臻螽运矮舞表达鼗俸，蒉转豫大蕊耪菌，髂终获褥了毫表达菌臻。表 达的随组14―3-3zeta融合蛋白凝胶条带冻千磨粉，免疫寐兔，获得了商效价的多 瘤绷胞株。崩F,LISA法筛选、Westernblot及免疫扩敞锋龉定以及削按免疫荧光 诊断中的应用奠定了舶基础。 2材瓣与方法 6 安徽医科人学fI!i!Ij学位论文 2(1树料与试剂 2(1，1实验材辩 动物: 纯系BALB,c 6,8周龄雌鼠本校实验动物中心提供: 耨建兰兔本铰实验动物中心提供; 纲胞: SP2,O骨髓瘤细胞株 经8-AG选择 ，由本校分予生物学中心实 验室提 供。 2(1。2实验试裁 DMEM不完全培养蕊;DMEM GIBCO 100 BRL 加Penicillin 4 IOOu,ml除蘸过滤，4 C僳存。 IMDM壤养基::IMDM GIBCO BRL 另魏 Penicillin 100uZml 100u,ml，streptomycin 除菌过滤，4。C保存。 胎牛斌瀵 FCS :购囊黑龙江霹江市汪海生甥离薪技术开发寄陵责任公霹; 新,E牛j0】清:购自杭州翻季青公司; 100×HAT，100×HT贮存液:购自GIBCOBRI。公司: 黎乙二蹲 13EG 4000及聚乙二黪20000:魏鑫德国MERCK公司; 低分子鬣猛白质Markers:购自:汜京华美生物工程公司; 二甲拱?l!砜 DMSO :购自合肥天安膊公司; 琼耱耱:购自j,京鼙美生耢工程公司; IlRP酶标羊抗鼠[gG，邻苯二胺OPD:购自北京华美生物工程公司; N，N，N，N-暇甲糕已二骏 T酬粉 :赠量AMRESCO，USA: 丙浠酸胺;AMRESCO，LiSA:N，N甲叉双丙烯酰脓:AMItF,SCO，USA 十 炕撼硫酸钠:购臼北京华美生物工程公司: 宜徽睡科人学f哦I。学位论义 2(1(3主要仪器 INTL囊铡嚣疆微镀德国LETCA公司 cBi50型co:培养箱德阔BTNDER公司 一20。C，-80。C低温冰箱同本8ANYO公司 7楚o 16G爱台式冷冻麓遮离心掇』二海安亭辩学纹器厂 404-3测l乜热恒温培养箱江苏东台县电器厂 Ts一8型脱鼠摇床 L‘海珙特分极仪器厂 微波妒 捂兰0电器有限公司 TGL,1611型台式高速离心机上海安亭科学仪器厂 电蕊压力蒸汽灭菌嚣淀嬲盛达魄子设备有黢公趟 DK一8D测电热恒温水浴锅江苏念坛分析仪器厂 PHS一3精密数显酸度汁上海天达仪器有限公训 SW―C。l一[FD型趣净: :佟台 苏净爨震安泰公焉 UV 754紫外分光光鹰计上海第三分析仪器厂 FAl 104掣电子天1Fl二海天平仪器厂| 蛋白藏疆直电泳仪及转印仪 BIO―RAD公司 KS 600烟声粉碎机宁波科学仪器厂 硝酸纤维素膜 濒 王蹬青尘佬毒砉辩厂 200目不锈钢网含腮创因公司 各型微擞加样器努兰雷勃公司 吾静撬捂瓣培姜疆，离心管江苏海门鼹学器孛毒厂 96孔，24孔细胞培养板美国CORNING公司 2。2实黢方法 安徽医科人学埘l+学位论嶷 2(2(1单克隧抗俗的制备 2。2，1。1免疫撬簌戆剩冬及免疫艇程 rhl 2(2(1(1(1 4--3―3zeta融食蛋白的诱导液达 l 一:pBK--CMY,rh 3ml 雩i 上样缓冲液，使其不粘稠。沸水中煮5min，待其冷却; l。B液体壤葬基的配铡: 菌用胰鬣白胨 19 菌用酵母掘墩物0(59 氧纯镳0。59 4 c备用; 去离子水加至lOOml(高压灭菌后于4 2x蛋自上榉缓冲液的酝铡: lmt Pt]6(8的lMTris―IICl 1mL 2一筑基乙醇 lO,SDS 4ml 0(1,滇泐蔽0(5ml 2ml 甘油 1(5ml 无菌隶 2。2(1(i(2 rhl4-3―3zeta融台强自表达与纯化 1(SOS―PAGE凝胶的配制 N，N一亚甲双蔼 烯酰胺溶于 1 30,丙浠醚黢溶液:称敬299丙烯酸胺和19 9 安徽医科人学坝卜学位论史 100ml去离子水中温热，使之充分溶解，放置于棕色瓶中保存; 2 10,SDS溶液称耿SDSlog，DHA,100ml蒸馏水，微热溶解: 3 10,过硫酸铵称驳0(19过硫酸铵溶于Iml蒸馏水，临用前配制; 4 三羟甲基氨基甲烷 ’Iris -甘氨酸电泳缓冲液 PIl8(3 900ml 去离子水 Tris碱 3(029 甘氨酸 18(89 10,SDS 10ml 100ml 用去离子水补至 5 浓缩胶 uppergel 缓冲液 O(05mol,L DitA 100ml; 6 分离胶 10w 水补至100ml。 2( SDS凝胶的灌制及电泳 1 制备浓度为12,的分离胶15ml 4(9ml 去离子水 6 0ml 30,丙烯酰胺溶液 1 5mol,LPH8 3(8ml 8+Fris―HCl缓冲液 10,SDS 0(15ml 10,过硫酸铵0(15ml 7FEMED 6pl 2 速在两玻璃扳蚓灌注1:J;j烯酰胺浴液，预留1(5cm灌注浓缩胶，应排除 凝胶底部玻璃板间的气泡(用吸管在丙烯酰胺溶液上层轻轻覆盖双 ln 安徽瞰科人学坝 j学化沦业 蒸承，褥凝骏嚣予塞瀑; 3 分离胶聚合后倾出獭箍液体，并用滤纸吸净残斟液体; f4 毒g备浓凌为5,趣浓缭黢4mt; 2(7ml 去离予水 30,f^j烯酰股溶液 O(67ml l，0moi!,PH6(8’DislIICt缓冲渡0(5ml l O,SDS 40ktl 1 O,避硫酸铵405(tt TEMED 4ni 5 在已经聚合的分离胶上唐接灌注浓缩胶，立即描入梳予， 梳齿用透明 黢封往，淹谶各蝥一鸯 ，避受气滢产生; 6 当浓缩黢聚合的同时，蒋诱导表达的菌体悬液和替量的加样镶冲液在 沸水中加热5分钟，馊援白变性; 秽 浓缩黢黎合嚣枣心拔爨箍-T，壹辈鲻去离子_隶洗涤女#鞲疆，疆除去素聚 合的丙烯蹴胺; 8 毡泳槽中加满电泳缓冲波，用微量加样嚣向加样横中躲入样黼予太监 霓中，诋分予量蛋鑫绶标 g Markers 攘灭一铡小凌毳; 把电压撼至iSOV,继续电溶至涣酚蘸到达分褰胶懿底部，关溺逛源; 100ml 貌 10 考马瑟亮篮染滚抟酝制:称取0(259考马薪亮蕊R250溶-p 色液，用l号Whatman滤纸过滤染液:脱色液的配制:将甲醇、水、冰 醚酸按《5:45:10筑诧铡醒裁; 11 墩下凝胶后，从边缘涟同Marker泳道纵切下一条，用考马斯亮蓝 R250染色，脱色，从黼确定表达条带的所在 31kDd处 。墩融染色 嚣凝默毒瓣余凝黢对蠢，霁l乃冀褥来染色嚣聚黢L rM4(3(3zeta衢在 :f[:徽j5i;i科人学f !j!I‘学位论业 经餮激胶甥下 尽可能窄 。 3(抗原的纯化 1 遴概袋躲处理:将透梅袋劈戏10cm左右鲍小段，在2, w,v 碳酸慧钠积 lmmol,I(EDTA PH8 O 中煮沸lO分钟。冷却后存放于4‘C，备用。用时需 戴手套搽 乍; 2 遁析袋取出，用蒸馏水清洗干净。用夹子夹紧袋的一端，用Tris(甘 氨酸缓 冲液充满透析袋，翕住袋颈，将切下的凝胶转移至袋中; 3 去簿太都分缓冲液，整下是够液藩以毽凝胶始终接触缓冲液。然麓捻在凝 胶上方将透析袋央紧，不要留气泡: 4 透褥袋浸泡在艘毒Tfis(苕氮酸缓冲渡夔水平电泳稽中，镬龟浚逸过透梅 袋。IOOV，电泳1小时，转换电极再电泳I。2分钟: 5 关闭电源。舣出透析袋中的凝胶，再将谶析袋夹紧，鼹于盛满生瑚舳水的 烧梅尊;，于4’C遴辏遂疲，羯闼换滚2次。次强取逝霜PEG20000浓缭透疆滚， 即得纯化的抗原液。经GDS,PAGE显示31KD处为单一条带。 4( 抗原的定量:采用蛋白凝胶成像系统 融中国科学技术大学生命科学院 老帮秘;韵 : 5(古空质粒的大肠杆菌诱导抗原制备: 养，诱姆表达。将细菌培养物以4000rpm离心5min，弃上清，收集菌体，每克菌 体加3ml菌体裂l||牟液麓:黩。按下列条件超声破碎细胞:功率150W;超声3see，停 3sec，共75敬。4"C 12 安徽医科人学侧!『’学位论文 离子承t乳在754糕紫辩分竞党凄计铡薰A280，A260，菝。F强公式计器犬肠耔燕 抗原洙眨: C mg,mi A280×I。45一A260x0:74 ×稀释蟹数 2(2(1(1，3免疫 旃筑诧抟撬驻波与等葬获终薅氐完全往裁充分嚣诧，靠《戏渍龟拳撬舔嚣裁。 经雌性BALB,c小鼠艨腔注射抗原，10099,R，两周后再用抗原加弗氏不完全佐剂 加强免疫，重复两次。遗甩琼?鹭糖双扩测定小鼠效债达到1:32默上，可瘸于融 台。在融合嚣三天蹋绒撬藤遣热受痰,次。 2。2(1(2缨照鼓会 2(2(1，2，i免疫脾细胞悬液韵制备 1(取上避免疫的BAI。B,c小鼠，眶燮放血，并分离呶清供检测抗体用，同时姆小鼠 控蘸楚熊，浸逮予75,潘凑中5min，髓簿簸入怒渗王搏台蠹，怒无菌手术酝懑薅 脏，放入已盛有5,10ml不完全 无10L清 IMDM培养液的平邶，中轻轻漂沈,次， 并剪客周隰结缔组织: 2。蒋壤ij簸移入舅一滋霄5M不完全臻莽滚弱乎噩薮中，萋子200秘锈网上，躅注射 器芯挤压并研磨脾脏，并用平皿内的IMDM不完全墙养液轻轻冲洗铜网，使脾细胞 全躲蘧避耀琵歪接裂漆滚中; 5 3(将髀细胞溶液转移至50ml离心管中， 1000rpnl离，tbmin，弃上清，沉淀细胞 爵用不究仝培养液同法离心一次，然后将细胞萤懋至10m]，淞匀: 4，取羚缨照基浚，趣台韵蓝粢滚?4,台翳蓝霹滚;49台臻蘸蕊少量蒸繁承骈整， 再加双然水定容至100M，用滤纸避滤，使用时用PBS稀释冤0(4, 作活细胞计 数后蛋埘。 2。2。I(2。2+哥疆霾爨耱愚滚翦麓餐 13 量徽医科人学坝l’学位论文 1(骨髓瘤细胞 SP2,O 的复苏: 30 mjfl，弃上清; 2 配制含1096d,牛衄清的DMEM培养液; 3 取lml刻度吸管，吸取含小牛皿清的DMEMlml装入冻存管，轻轻吹打几次，移入 培养瓶中; 4 墩10re]刻度11及管，吸取10re]含小牛血清的培养液加入培养瓶; 5 将培养瓶放入二氧化碳孵箱，次同换液，每2,3天传代一次: 2(细胞生 乏稳定后，用8一氮杂鸟嘌呤处理细胞 8-氮杂鸟嘌呤的配制:称取 200m98一氮杂鸟嘌呤，加入4N NAOHlml，待其溶解后，加入双蒸水99m1，过滤除 菌，分裂小瓶，一20。c冻存，使用时按1,的浓度加入培养瓶中，即终浓度为 20ug,m] ，诱导三次，于融合前36,48 h，将其扩大培养于100M细胞培养瓶中， „般按一‘块96孔板的融合实验约需2―3瓶细胞进行准备，每瓶加12,15ml培 养液 置孵箱培养: 5 iiliiq，弃上清: 4(沉淀中加入不完全培养液，再离心一次。然后将细胞重悬至lOml，混匀: 5(耿骨髓瘤细胞，加台酚蓝染液作活细胞计数后备用。 2(2(1(2(3脾细胞和SP2,O细胞融合 管，补加不完全培养液至30ml，充分混匀: min，弃上清: 2(1000rpm,m离心5 3(轻弹管底，使沉淀细胞松散均匀成糊状: 4( 1 min; 1ml融合剂加入混合细胞，轻轻搅拌1 2 Jjt],x(2ml不完全培养液，轻轻搅拌3min: 1 4 奠戳阪利人举倾J(学位沦兜 3 魏 入7rot20,霜、牛魏滔瀚培养渡，轻轻搅拌3mira s ,五 i溶液 融合荆 的配制:称耿PE659，高压15min+使之融化并灭菌。 冷帮至50。e是在时瓣天不完全壤莽液4。25ml，DI,GO0，75rai，充分漫匀: 5(1500rpmhn离心15分钟，弃上演; 6(用撕mI食20,胎牛【f『I(清的HAT赞养液轻轻懋浮细胞; 王耨禽鲻艇熬营葬波穆入,强垮莽媛，每_藐O,2mt，嚣二氧纯骥孵籍速行HAT选龚 rl:培养。 2(2，1(3攀亮灌抗舔静筛选溺接ELISA法 1(用纯化抗原rhl4―3―3zeta C过夜: 10ughnl包被聚苯乙烯板，44 龟旋弼释液隽0(05mol,L磺酸镳(酸陵氢链缓冲液，矬诤。6: 碳酸铺 1(59 碳酸氯钠 2(99 搦双蒸丧琶t000ml，落PH餐至霉。6。 2(，1j含商5,小牛皿淌的封闭液37。c封闭1h: 越闭激姻燃制: 50ml 枣牛斑清 PBS 950ml Tween20 509t 3。蒯翕有0(05,Toween的PBS洗涤液洗三次，铘次5分钟; 4(取杂交瘤。 :清液100HI加入包被板，37‘c孵商l小时。 设阳性， 阴性及空自 魏挺对照 : 5(tlj PBSql沈三次，每次5分钟: 6 7，霜PBS。F洗j敬，每次5min; 1S 安徽医科人学坝1(学位沦史 溶缎磊翔入30, V? 鳆取氧承50pl。选取臻瞧琵杂交瘩缀鼹壤莫克隧纯 莠扩大 培养。 9(两天厢将初筛所获阳‘I'fTL培养上消液100“1加入大肠杆菌抗原包被 板进行反筛。 方法列( :: 1 0(取与14-3 3包被板反应阳性且与火肠杆菌诱导抗原包被板反应阴性的孔的杂 交瘤细胞，将其克隆化。 2(2(1(4克隆化 2(2(1(4(1饲养纲魑的涮备 l将3,4周的小鼠拉颈致死，浸泡于75,酒精5分钟，随即放入超净工作台: 2。将其乎款子蟮盘上，趣无萤搽终打开腿艟，器露心照，霹觅,囱色半逡甥鼹器 官覆谶于心刖:前面: 3(用镊予兴起J f9J腺，与心脏剥离，然后剪下胸腺: 4_《灏躲藏A 1令滚毒平疆中，麓无基漆培赛渡洗2,3次， ; 馁黧豫绸戆释簸入 培养液中: 5_哿含肖胸腺细胞的培养液移入离心管，著吹打使细胞分散: 静翟离心管2,3分铡r，使组织浚沉降，然后将食有分散细胞的悬液移入男一离心 管: 6(1000rpm裹心5分镑，弃,渍; 7(用党垒培养液将沉淀细胞悬浮并混匀，加入96孔培养板，每孔O(1ml，然后将 培养板鼹于孵箱中培养。 2(2。l。4。2煮鞭舔释滚究隆杂交癌缨貔 安徽医科人学倾I。学位论史 将96孔培养扳中待壳隆纯的鹚缝杂交瘤绸胞拜l翔祥器反复欧打藏细魏惫液， 加1(4ml，每孔o(5个细胞，共24孔。将培养板黉于二氧化碳孵箱中培养。一周左右 此|j 『不换液 可在倒镯显微镜下观察到细胞克隆生氏，并要确定单克隆细胞株。在 合逶瓣澍’阚逮行揍滚，并对培葵上演逡嚣检测。 有多毳鬻幢瓣，尽可筢敬蕈克隧藐 再次且E克降，同时转入24孔培养板，进而转入培养瓶中进行杂交瘤细胞的扩大培 养。 2(2(1(5杂交瘤细胞的染色体分析采用秋水仙索阻断法 1(将教农锄豢 终浓痰为O(004 液中，继续培养4,6h后收集细胞; 2(10001pm离心10分! Ill，弃上清; 用l殁管吹打均匀，37”C孵育20,30min; 4(预隧定:向管中加入Iml薪鲜固定液， 3份E i弊1份冰醋酸 : 5(1000rpm离心 0分镑，弃上清; 6(固定:沿管壁缓慢加入新鲜固定液8,10ml，用吸管吹打均匀周定15,20分钟; 7(离心，吸取上演液，菇缓馒热入数鳞嗣定滚，固定30分镑，蒜心，啜除一E涛滚，援缨魔 量再加iml新鲜固定液，吹打均匀; 8席0片:舣冰浴的载玻片，滴1,2滴细胞悬液，使之平铺，自然干燥; 9。染色:怒薪醚翻豹】0,Giemsa漆滚染色，20分镑螽交来承洗去，耋然于涤，镜 时后加入33ml甲醇溜匀，使用时墩原液l份加PH6(8的磷酸缓渖液9份，渡匀。 2(2(1(6荜克隧抗体瀚生产 2(2(1(6(1腹水生产 周后，将培养的杂交瘸细胞用无曲L清培养液畋打下来，并将细胞悬液混匀，渊至1, 2x106,ml，经腹腔注射悬液，每只lml，接种后7,12天，可见小鼠腹部膨大，用注射 器羁t敬缓隶，‘蔽簿必惑 消，分裟于无菌离心管中，一20’c冰箱冻存备用。 2(2(1(6(2腹水纯他 采用常规赫柝法 敬lml腹水潮入离心管中，逐滴加入饱和硫酸铵0(5ml， 饱和硫酸铵的配制:称 取4009硫酸铵，溶于500ml蒸馏水，加热至50,901 C，使之完全溶解，趁热过滤拎却 c过彼，离心沉淀，重复此过程一“遍，最后用lml PBS使沉淀溶解(4每此蛋白质溶液加 浓缩毹1nll。 2(2(1(7罄克隆抗体的纯度鉴定 采J J SDS??PAGE，方法同前。 2(2。1+8爱鑫质兹免痰学稔溅采瓣蛋皇矮免疫这l述法f溉sle糯(Blotting 1(按匕谈方法进行戳自质的SDS―PAGE: 2(电泳绌求后，用去离:于水浸泡转移塑料央及海绵; 3，戴t手套，羧6张滤纸秘一张磺黢纾缍裹髅，大小应与凝蔽大小凌台; 4，把硝般纤维素膜漂浮于去离子水面上，滤膜借毛细作用使水从下往f二湿润后爿哿 其浸于水中，浸泡5分锄以上驱除醚于滤膜l二的气泡; 5(存„个托盘中巍i入少量转移缓冲液，将6张滤纸浸于其中; lR 安徽医科人学颤卜学位|^殳 6(转移缓冲液的配制:: 甘氨酸 2(99 Tris碱 5(89 SDS 0(379 200ml 甲醇 加双蒸水至总量为1L 7(戴fI手套按以下方法安装转移装置: 1 在塑料央上放置3张用转移缓冲液浸泡过的滤纸，逐张叠放，精确对齐，然后 用一玻璃移液管做滚筒以挤出气泡: 2 把硝酸纤维素膜放在滤纸卜，精确对齐，滤纸与膜间不能留有气泡; 3 从电泳槽上撇下放置SDS―PAGE凝胶的玻璃，把凝胶转移至去离子水中漂 4 洗一下，然后平放于硝酸纤维素膜L并刑齐，排除所有气泡; 4 最后3张滤纸放在凝胶上方，各层精确对齐并排除气泡; 8(将夹层物中滤膜面难对阳极，接通电源，电转移3小时左右; 9(断不电源并拔下电泳槽上的插头，拆卸转移装置，逐一揭去各层(把凝胶转移至盛 有考马斯亮蓝的平皿中按前述方法进行染色，以便检查蛋白质是否转移完全; lO(取出滤膜，切下蛋向分子量标准所在位置，用氨基黑染料染色30min，然后用 脱色液脱色: 1 1(把剩余滤膜转移至含有丽春红染液的平皿中染色10分钟左右，轻轻摇动染液使 之充分接触: 丽春红染液的配制: 丽春红 29 三氯乙酸 309 磺基水杨酸 309 溶于100ml水。使用时取一份L述贮存液加9份去离子水即可。 蛋白条带出现后于室温下用去离子水漂洗硝酸纤维素膜，其问换水数次。 19 2Western blot鉴定 I 把7Jn酸纤维索膜转移至含封闭液的托盘。p，平放在摇床上，于室温孵育一小时; 封闭液的配制:脱脂奶粉59，PBSl00ml; 2 弃去封刚液，立即加入l:20的单克隆抗体溶液孵育1小时: 3 (用PBST沈涤滤腴3次，每次l5分钟: 4 (再加IlRP标记的羊抗鼠tgGCE作浓度为1:50 孵育1小时: 5 (用PBSrI、洗涤滤膜3次，每次15分钊，; 6 (力?入DAB底物液10ml显色液，: 立即使刷; 7 (认真仔细观祭反应过程，一旦蛋lq带的颜色深度达到要求，用水漂洗后拍 | 。 2(2(1(9免疫荧光定位 1(取腑组织冰冻切片 脑组织切片来源为桥脑小脑角听神经瘤患者脑组织，由 蚌埠医学院|;什属医院腑外科提供 : 2(内酮刚定10rain，干燥; 3(_? 】含5,牛奶的封闭液封| jiJ过夜: 4(弃去封闭澉，?1 k 1:500稀释的经腹水纯化的抗体，室温静置3小时; 5(用PBS沈一i次，每次10min; 6(加入1:200稀释的荧光标记的二:抗，室温1―2小叫; 7(用PBS沈!次，每次10min; 8(加mounting后封J扎 2(2(2多克隆抗体的制备 l、抗原处理:免疫融，先将切F晌凝胶条带反复冻融，碾碎，用PBS 制成悬液; 2、第‘州，从兔右躺圳:f刚注射100,_d福氏完全佐剂: 3、第 !j茂扶瓣大瓣囊簸黢淘漆巴缝注瓣入合奏Img 宠琢煎凝黢懋滚: 4、第血川，从背部皮卜(多点注射含有lmg抗原的凝胶:鼠液，连续两个月，每两周 从背部皮F多点注射进行免疫: 5、巧缘静躲聚随3ml，凝斑后，4000rpm离心10分钟，收集盘清; 6、免疫戳扩敞法测jfl:L清抗体效价: 1 墩干净鹃载瑗片J二n涎髓擦拭，壕二 _ ，在上瑟镪一游层0名,麴臻滕潼凝骏f垒壤 能水配eli ，放入37c孵槠使之干燥; 2 在其上铺一一层1,的琼脂糖凝胶(凝聚后，用打孔器打成梅花形孔，中阃孔的孔 弪为5mm，边I魏翁冤径为3ram，魏闯鼹为5ram; 3 抗体的稀释:免液皿清用生理豁水倍比稀释成l:2，l:4，l:8，1:16，l:32， !:64# 4 在;阻CA'L中 JlI 10I^1纯纯抗舔，边缘藐依次藤入10ul不同稀释度的抗体: 5 37‘C泓盒放置24,一48小时，至沉淀线出现; 6 追劲|免疫，至抗体效徐达到理想隶平 :16以一匕 后，全兔教巍 之瓣震禁食 ， 收集恤漓 采用颈动脉放血法 : 】 将免疫好的家兔仰面嘲定于动物固定架，头部放低，暴露颈部; 2 澄颈部中线j l 2,蔷藩?毽弱罄臻黪，15分锊磊懿好颈中部皮胶10cm，+添气 箭钝性分离眨下组彩 ，暴露气管前的胸锁乳突肌; 3 分玎胸锁乳突肌，在肌柬下两靠近气管二侧，即可撼搏动的颈动脓，I冬两捌颈动 腺仔自11分离，0二每德动脉分剐套入2穰丝线，t穰程远心臻，一穰在向心端; 4 将一侧动脉远心端丝线扎紧(然后在向心端用I上血钳央住(用小的尖头剪刀在 两铡缝线申闻的动躲魅 :剪开一个，j、豳，班便搔入塑裁效盘瞽，镬爨淘，0端憋 2I 安徽蹦科人学“』!【‘学位论文 线丽定，避免敞瓤管从动赫中滑如; 5 轻松"1Lrfit钳，馒』:c匝液很快射入离心管，崽登m液缓慢点滴1『f|ii?;时，以删法在对 溺动昧囱援譬敢盎 ，著爨蓠定繁焉璃捻离，臻蕊蔽盎萎; 6 将离心管甏二尹37“C瀣藉1小翻‘，荐敖入4’C拣稽过夜，使搋浆收缩。将斑块自 臀爨分离，褥衄清全部倾入另一个离心管，程44 C下25009离心血块30分锻，取 j二潘液邵j垂灞郝分与藩述巍清瀛会。4 C15009离心全部分离辩囊清部分。将 j虹瀵分装予一20“c贼一70“C冰糖; 7、多抗的筑诧:采鞠簸亳蓐法 1 ( NaCI 100ml血清稚0(2M磷酸缓冲液和O(t5M 100mI PBS 。 3000r,min，15-20min离心; 2 +离心辱上清为岛蜚囊，弃袭，沉淀溶予PBS中，嫠侮较达到t00ml 淘蛋 蛊滚鸯瓣入饱和硫酸缓溶液25ml，倦帮攫约20,。离心磊静沉淀为纤维 鬣岛藤， 弃去# 3 ，囱离心焉翡j二漓菠热入18,25ml稳翔虢酸铵溶液，谈德秘发这30,, PBS中: A260，接t纛公式沣露崔舀浓废。 3。结莱 3(1 14(3(3灏白的袭达秘纯化 经蛋自激胶戏缘系统分褥，缝诧藏rhl4―3―3zeta蘑筑蛋是占落钵惑蛋骞黪32,， 台登为2。213mg,m 。纯纯后rhl4,3―3zeta重组擞自，含量为0(438mg,ml 嘲1 。 22 安赣医科走学疆士学位论冀 疑紫终分光巍发诗测量含空溪粒熬犬骚抒蓠携导抗踩A280 0(051，A2 醐锄(024， 经公式计算含羹为4(6mg,ml。 嘲1(rhl4-3-3zeta蛋自表达及纯化 1(擞自质分子凝标准 2(rhl4―3-3zeta殛自表达条带 3(rhl4-3―3zeta蛋白纯他条媸 and rhl垂30zetawiths】》?lI舂GE Figurel。Expressedpurified l。Protein糙a噍ers 2。rhl4―3-3zeta withSDS-PAGE expressedproducts 3(ral4(3-3zeta withSDS-pIAGE purifiedproducts 3。2免痰兔舷溃多党嶷抗体效债 第罂次皮下浚射14―3―3抗原螽4兵家兔均有抗俸产垒，麴强免疫看效 徐秀+高， 一只达l:64，一只为1:32，两只为1:8 见图2 。 安徽医耕必举硕士学位论文 嚣2(免疫兔盘蘧抗律效蛰嚣定 immunizedrabbit ofserumfromthe Figure2(Titer 1。l:2;2。l罐;3(1:8;或I:16;5(1:32; 6(I:64 3(3小鼠免疫血清测定结果 复受痰嚣， 蠡枣鬣滗尖采集盘滔激璩臻耱瑟掏犷鼗法测定簸巍涛效蛰，缩 采魏下 图，为l:64。 强支枣鬣凫疫盘清?rhl4-3-3zeta稼爨耱双稳扩散 double of serumwith diffusionmice rhl4-3-3zeta Figure3(Agarose 3(4融裔厢杂交癌缎胞的生长 融食后需每日观察细胞生长情况:融合当天可见骨髓瘤细胞透亮，细胞闻毒 藉连，仔鳓篾襄哥霓溅褥获缨爨。 融仓后2,3天内骨韶瘤细臌明显退化(星嗍胞缩小，核浓缩，碎裂，并可见 杂交瘿细服势裂，如图4。 融赍螽4,7天冒觅竞蓬狱瀚，j、堆杂交瘸纲藏生长，遴巍，辑竞蛙强，缡魏 形态均匀。此时应观察并逸录每扎细胞克隆情况 克隆数量 。 融含磊7,9哭露燕嚣麓癌雏搬垒警死亡，露夔竟隆长大。待竟陵篷??汝至墙 养税孔底I,3,1,2两积对，即可暇取所有克隧，生长孑L的培养上清进行检测，如图 24 安徽医科火学硕士学位论史 图4(杂交瘤细胞分裂《2,3d》 蹦5。杂交瘤细腿瘫隆 7,9娃 celldivision 2―，3莲 Figure 4(Hybridoma Figure5(Hybridomadone 7,gd 3(s嘲接ELISA法筛选细胞毙隆 在静懿瘙缨鼹器l黪缀魏鞋仑艨，蒋竞遴长饔培莠蔽魏疯 岛,1,2辩丽蠲接 ELISA淞检测杂交瘸培养上清液，以免疫兔m消作为一抗为阳性对照，以PBS 为 空鑫对慰，跌正常人魅海炎爨牲对照。醚台嚣第,次矮rhl4-3-3zeta撬霖舞连共 反筛这7个阳性孔，D1为阳性，此孔细胞分泌抗体可能抗大肠杆菌或pBK密质粒 表运筑融螽蛋鑫。嚣诧融台囊第一次簿选共获6令癸潼撬rhl4―3(3zeta购麓燕 孔。，矜剐为c5，E4，E吼F7(G4， ;9，如图6。 纯他的rhl4―3-3zeta做抗原筛选96孔板杂交瘸培养上清得剽的阳性党隆孔 G9 C5，Dl。E4，E8，F7，《;4。 安徽医科大学硕士学位论文 含空质粒的大肠杆菌诱导抗原反筛阳性孔 图6(间接ELISA法检测96孔板杂交瘤培养上清 of withELISA Figure6(Detection hybridomasupernatant 3(6亚克隆过程中应用问接ELISA法检测单克隆抗体 第一次ELISA检测为阳性的细胞应尽早旺克隆。一般融合后经过三至 四次 亚克隆可以获得均一的杂交瘤细胞株。本实验经过四次亚克隆后获得一株 抗 无细胞生长孔 。如图7所示为F7株的ELISA检测结果。 图7(F7杂交瘤株第四次ELISA筛选 forth ofF7 with Figure7(The ELISA screeningHybridoma 3(7 F7株杂交瘤细胞的鉴定 3(7(1染色体形态及数量检测 安徽医科大学硕士学位论文 本次实验建立的一株杂交瘤细胞染色体数目为97条，可见骨髓瘤细胞 的标 志性染色体 中部及皿中部着丝点 以及小鼠脾细胞的端着丝点染色体，如 图8。 由此可见，该细胞系为小鼠B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合的杂交瘤，且具有 较高的分泌高滴度抗体的能力。 圈8，杂交瘤细胞染色体分析 cell chromosome Figure8(Hybridoma 3(7(2单克隆抗体及多克隆抗体的鉴定 本实验中所获得的F7杂交瘤细胞株腹水效价及亚类鉴定，结果如下: mousemonoclonal immanotype antibody isotypingkit 检测Ig亚类为 IgGl型。 计算纯化后腹水单抗浓度为10(03rag,m!。 计算得浓度为9(817 mg,ml。 安徽医科大学硕士学位论文 图9(ELISA测定腹水效价 titerwithELISA Figure9(Detection Hydroperitonneum 3(7(3(SDS-PAGE鉴定单克隆抗体纯度 F7株单克隆抗体经盐析粗纯化后由SDS(PAGE电泳显示有两条特异 性条带，分别在50 kDa和25kDa，为免疫球蛋白重链和轻链，如图10所示。 图10(F7株MeAb的蛋白质电泳 1(杂交瘤细胞F7株2(低分子量蛋白标准 10(F7 McAb Figure SDS-PAGE Lanel(F7MeAb Lane2(Protein Markers 4 3„7 Western-Blot鉴定单克隆抗体 在硝酸纤维素膜上，只在14―3―3抗原泳道区域出现一条明显的特异 性条带 31kDa ，而在对照组未出现相应条带，如图lO。 室塑堕型点堂堡(!兰篁婆(墨――一 圈ll。F7株McAb的免疫印渣 1(蛋自质分子量标准 2(rhl4(3。3zeta表达蛋白反应条带 3+rM4―3(3zeta缝毒艺蛋自爱应条荣 4(诱导表达的含空质粒鲺虹菌上清 WesternBlot of McAb rhl4-3-3zeta 11(Identificationthe by against Figure l，ProteinMa盎ers( 2(14―3―3 withWesternblot products purified withWesternblot 3(14―3-3 expressedproducts 4 ofthevagantE(coli sllperllatant 3。7。s(f辩接兔疫荧光法鉴定单抗姆器淫 可见神经元细胞舭浆内有黄色、明亮的着包颗粒，而胞核内未见着色。 安徽医科太学硪士学位论文 图12(免疫荧光法用于rhl4-3(3zeta在脑组织逝位 ofrhl4―3―3zetain IIF 12(I麟unoloeation neuronby Figure 4(讨论 信号转导蛋白14(3(3是一缀高鹰保守的具有调节作用的灏自质家族。1400 motif 发生特辩性 蛋自以其酸性豹c末端，可与其下游黼体豹结合横序 binding 结合，在编脆信号传导遥罐中发挥嚣嚣静调节作臻。瑰己翔14―3―3可与多遮赢卡 疆究也表臻熔号蛋岛14，3G与tau蛋爨瓣穗互痒蠲对手提示鬻茨海零默瘸豹瘸溅辍 理和临床诊断、治疗具有蹩要意义。阂外商晶化的抗14(3(3多赢隆抗体价格酾贵， 而针对人类14。3(3zera胍型的单克隆抗体国内外来见报道。另外，脑脊液中14(3。3 蛋鑫虿酷掺为一穆敏蕊靛及特舞瞧静生秘标记瘸予炎雅氏癍 瘢譬瘸 等棒经系 统退行性痰病的辅助诊断，近年来有关临床及实验宣的研究报错日益增多。浆于 14-3-3蛋囱麴生物学意义及其潜在的开发应用价缀，我们一方躐终表达的羹缀人 类14-3-3zeta融合簧国凝胶条带琢千跨粉免疫窳兔得到效债缀商的多克隆抗疵 清，另一方面将电洗脱、透析纯化的溅自质经凝胶成像进行定嫩后作为抗原免疫 枣鬣““，姆矮舞薤港娶镪庭与营髓癣缨羟融合，辩逸窝竞瀣出一臻稳定分泌挠 信号转导中鬃自质之阀棚亘作用的研究，面且为群发中枢神经系统退行性痰瘸诊 五!微雕耕人学I叭I学位皓皿 断试潮静研究奠定了重要豁嵇簸箍勰。 此外，在动物免疫中，我们使用了经过SD$一PAGE处理变性的重组多肽抗原， 3蛋鑫囊缝合是重要 爨此溺藤杂变螽获憩髂单克隧抗体是否司’与天然鸶_天粪14„3 的问趟，也是该株单抗是否具有实用价值的兼键。为此，我们用该株单抗作为第 一抗体，采用闻缓荧光抗体法，对人类脑组织中的天然14,3―3zeta进狂了荧光定 蕴蕊察。终慕表端，孩撩挚摭与天然14―3―3zeta吴存豢袋靛豪积力。 单兜隆抗t$fC,j,$rl备涉及很多环:饥容易受刮多种因素的影响“„。本实验中， 肇克隆蔽体裁备动籀采臻缝合予BALB,c小鬣。BALB,c以癸鲢，j、疑军孛黎，甚至于 大芒l懿也一i减低其融合率，但遐种阐杂交系不遥合以后经动物体内制造抗体。骨 髓瘤细胞系应和免缎动物属于闸一品系，这样杂交融合帮黼，也便于接种杂交瘤 缡j融存麟。晶系小赋黢麓国产生大鼙McAb。所以哭有奁该种系动褥封免疫臻撬骧 的应替反应较差时，才考虑用其他种系动物。动物免疫的效果直接关系别细胞融 合的戏败，以及愁秀能筛选到特辨性抗体。本次实验所用披原为可溶性抗朦，故 抗琢辫定鼙磊，孬每经裁充分巍纯，然螽免浚小鬣。抗簸翱经裁等髂积漉台在„ 起，fi f腠成汕包水的乳糜状，放„滴在水面b不易马上扩澈呈小滴状，液明已达 舞溃毡农瓣状态。佐裁甄可麴强凳疫效巢，又可疆多动物熟疫搀翱的掰鼗。豁爝 凝胶纯疫的办法，泖将稀抗原丽SDS(PAGE电泳后，再捌下舀标条带，冻于，碾 碎后懋接免疫，胶粉可起到佐刹榉作用，枉免疫兔时取得很好的效果。但在免疫 枣袋舛，出于葵其蠢一定毒婺，小霞曩死亡，曼弓;建疆黢广泛粘连，薅脏不爨取 出或在取脾脏时加大污染的机会。故此方法不适合用于免疫小鼠，但可用于制备 多摭。篼疫途径瞧对免疫效果影响报大，实验涯骥腹腔免疫效果较好，本实验数 只灸疫小鬣均产曩三了麓效徐静抗体。 以往龅一些实验tE明，处予分化增碴中的| 细腔最易与骨髓瘤细臌融合。有 A强麟多凝鲻滚黪纲照，懿。H勰艨堙蜓菝营幸筝为藩记，在不同箨于矮 培罄24,t20 3l 安鼗蹉科人学移 1(学位辁文 小时 与‘裂’燧瘿缨魁矬会，结果表螋最大鲍杂交瘘形残率在48,72小时之赳，与 袋夫的有丝分裂活性榴„致‘”’。侔者还用SRBC免瘫小鼠，然后在不同时间检测 小鼠1?卤??p特异性抗体滴度，并取脾细胞与。角黼瘤细胞融合，嗣时测空斑形成细 胞数 PFC 。结果表列蜮赢杂交瘤形成率是在PFC反应赢峰之兹，娜杂交瘤 形成 赢峰与小鼠囊溃濂黢劳不!F j:，多在 l清抗俸赢峰之静。繇以为达到最大数舀的 杂交细胞韵黼的，不一定要求最高的抗体滴度，但要求最大的浆母细胞数。免疫 J11 细JJ也指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞和浆母细胞。„般取最后一次加 强免疫3天以蜃憋黪魅，利器戏纲黪悬液，盘予此时8淋巴母缓魅魄铡较大，融 含的成功率较高。因此本实验采用三次基础免疫 问隔2周 后，在末次免疫后 二 !天墩瑚l进行融合，这样浆母细胞的比例较大。 系”“。SP2,O实际上是小分泌Ig她杂交瘤缨魁系，在抗体生产上其农往努，是鬓 肉外实验室广泛采瑙静绑糙株。在管髓瘤细胞传代冶养过程中，有部分细胞出现 反御伽蒙，如缺乏tlGPR'I’酶的细胞株发生逆转，从而对HAT坷;再敏感。故一般存 HE符触台蛳的炳蚓就应"始复苏母髓瘦绑腿，为确保浚缨燧对tIAT懿敏感性，每 3,6月应爆8,盎G 8氮杂骂噪呤 筛选一次，以掰盘维服的突交。不窟将SP2,O 长潮传代培养，阻防污染。敞骨髓瘸细胞系在驶得满意的融合效果后，应将剩余 的细胞冻存，以便F次再用。x,t:j二那些多次融台效果不佳，且查不到原幽的蠼，燧 燎纲腿橼，感丢弃曩;州。套管姒傍选择‘是。髓瘸继嚣蹩，餮怒获褥杂交成功鼓重瑟静 翻素楚用j二融合的骨髓瘸缅魏的生艮状态。僚证臂髓瘤细胞处于对数生长 期，良 好的形态，活细胞训数高了二95,，【i;I是决定细胞融合的关键。这就是如何保持骨 髓瘪细胞姻活性问题。嬲个象代缨飕的融台必须有相似的分化期，否则感以皴合 安徽医科火学坝Ij学位论立 或融合后也将导致分纯功能的熄火。由于免疫细魏中主骚是浆母细胞参与融 合，因此骨髓瘤细胞!必须是处于分化活跃的划。数生长期。 缁脆融合条件韵把握也根关键。PEG的分予量和浓度越大，其键融率越高， 但其黏度和对细胞的海性也越大。,般用30,,50,的浓度，低于30,，融合率低; 赢予50,，毒性太大。分子量戬4000为好，嚣霸。以嚣德MERCK遗鑫懿 PEG矮簿。 本实验取PEG浓度为50,，加入DMSO作为保护剂，这样既减轻PEG的毒性，又缩 短了融台时间，提高融合率。另外，PEG作用于细胞的时间以1-2分钟为健哪!。 融合后要每天观察杂交瘤细胞的生长状况。融合后杂交瘤细胞不生长是一 个普遍的问题。除了融合技术本身有问题，PEG有毒性或由于过度处理损伤细胞 羚，茭凝嚣可麓蹩; l、培养液质量及PH不合适等; 2、牛血清敬艨避。匿内多采用小牛血滤，矮量上存在稷多阉题。务瓤FCS之 表现在杂交瘤克隆数多，细胞生长快速，活力好;而且使细胞能耐受PH懿 ,酸，过碱 及缀瓣密度遗毫，遭褥等嚣素熬影稳，夫天掬遮了杂交瘥工箨熬遴程; 3、瘤细胞污染了支原体; 4、HAT宥问题，躲A含量过离或HT含量疆:足。 如融合后有细施生长，但无抗体产生，可艇是HAT失灵，也可能是小鼠的免疫 反应性不好。原分泌抗体的杂交瘤细胞变成阴性，可能是支原体污染或非分泌抗体克 隆兹竞争瞧生汝，辑l鞭或压缓了分泌性克隆缨羹篷豹垒爰;或罄羰突交，粢爨髂丢失雩| 起的H，L链雀失。缓验中应该做划大量保持和补充液氮冻存的细胞原管，并用倒置 显微镜经常检查细胞生鲢状况，不熨让细胞过发生长，因为最强者一般将成为非分泌 者:要寇期进行亚竞隧，特剐是当抗体产生下簿时。 33 业徽瞰利人。#坝I。学位论《 雅以克隧纯iq‘勰与培养液，狳牛斑清及铡棼纲您质薰有关，或由于支藏体污染 有关。JlL，I-，川于毙隆的细胞必须要活性良好，否则克隆化难以成功。另外，由于 营莠弱觉争霹戆鹰剥一:l 分泌撬髂弱绸爨亮隆生长，宅霹期爨，代替生跃较嫒粒分 泌抗体的克隆。凶此嚣尽可能早的检测抗体分泌的克隆，一旦发现阳性就立即进行 克隆。兜隆和再克隧均需加入饲莽细胞。常用的饲养细胞鸯胸腺细胞等。一般融合 磊获褥舱杂交癌要经过3次左右瀚克隆纯，达到loo,4L稳为抗诲阳瞧竞潦为止。第 一次兜隧化后麻改用翕H rJ’的培养液，以提供足够的I噪呤和嘧蜒核苷，以膳的克隆化 明、以蹦不食tlql的培葵滚。 饲养细胞一般采用小鼠腹腔巨噬细胞，小鼠脾细胞及脚脓细胞。这必细胞在组 织培舞条锾:,-本身不能繁殖，逶弼予滚俸培养鹣杂交瘥缡,辍?1。i嚣蠲小鬣腹霾巨程 细胞容易碰到皮毛而引起污染，所阻在本实验rrI我们采用胸腺细胞，效果良好，这 可能由于胸腺细怼在壤莽中释放嚣张羼特异悭的生长刺激豳予，为杂交瘸纲照提供 必要的生长条件。 j筘常BAI，B,c小鼠耱缨毽絷凳俸数薅为40条，全帮为灞黄丝点染色铬，夺薤。粪’ 髓瘤细胞的染包体数目则变异较大，SP2,0纽I胞为62(68祭，且有中部和?叵中部着丝 点等标惑性染色体。奉实验中建立髀F7株杂交瘢绍 飕染色体97条，并均可见亲本 纲匏驹标志性染色体。因此，F7鲻艟株确为小鼠骨髓瘤细胞和B淋巴鲴黻融合的杂 交瘤细胞，且可以分泌高滴度特异性抗体‘”l。 !必须握及的是， 污染是在越个单抗制备过狸中都应该特别注意的问题，也是决 定单抗制备顺利进行的曲提，包撼细葭，酵母麓和霉菌秘支愿体。注意无菌 操作， 蕾抗窀肉定朔棚紫羚线_ 射消毒，惫疆器掘和玻璃容器等羧要求严格灭稿，再翔卜 34 学位论文 安徽医利人学坝 燕靖葵液;"君溉斓抗，t素，NIlt;女tl翦牲污染不难防IJ:。黪母蘩污染不扩毅传撩，也 比较容易剥fJ。霉渤污染在梅?季节较易发生，它fir以很快扩散至整块板。虽(rDtt 制霉豢，但更零要瓣是髹持巧域娃生和加强逶风，培养孔有霉蔫污染蜃，iL中可注 入10N的氧氰化钠?1。 我弱累溺缝矧臻骏铵慧誊f;法羽书鬣疆承遴 于纯化5”I，缓疆承纯凄竣嚣提裹，褒 应J_ fj 出现祭带，即免疫球氍自的重镪和轻链，与有关文献报道吻合。而奁免疫雕迹反应 带，说明此r誓抗的特异性较强。 1975臼三Kohler羽I 细胞棚融合I”I，形成了杂交瘤纬 胞以定向产生j 作用j:某一抗原决定簇的单克隆抗 体。这技术楚免痰学|’:静一强革命。它逐灞在免疫学，嚣学，,芝物学等穹燹城中受示 出无限的生命力，为i1，l:多学科的研究丁作提供了有力的武器，使临床疾痫的诊断和防 治有r鞭躲希望，黠当代免疫学蛉磺究发挥毅憋摇动作用。尊克隆抗 本在疾痰渗凝秘 治疗过程呻l具有重要作用，其制祷和规模化生产越来越受到煎视，已成为现代qi物制 进口零壹苑瘸子嚣莉放免药盒、释貅试裁、会栎徐溅试裁及藏疆渗薮分褥等。纛就建囊 各种急需的杂交瘤细胞株有重要意义。 14―3―3蛋自愿是一i《t重要髓信号传导蛋一，它f习‘与近50种多功能婊号蛋一结 合参与细胞信号传轷、细胞周期调节、细胞施吐、细胞凋【二:等。而近年来该蛋白对克 雅氏病，疯， 二痫，荤纯疱疹性脑炎，脑膜脑炎等神经系统疾病渗断的价值【! I门益受到 关注。|嚣l 立徽 ，i利人学帧fj学位论兜 的研究提供“i物学标记，为神经系统退行链疾瘸的免疫渗断提供了技零手段和奠定了 5(结论 本实验褥表达豹曩缀lp3„3zeta魏禽强翻凝黢条辩凉一r寮麓免疫家兔得弱 效价很高的多克降抗叭清，并进行纯化;将电沈脱纯化抗原免疫小鼠，制舔Ii(II株 blot 稳定分泌抗 hl 染色体分析，以及兔疫荧光法等ji,行鉴定，献丽为i扣33摄自存细胞信号转导 的功能及临床渗断中的应用奠定了良好的基础。 参考文献 1(Moorejj W(Perez acidic ofthenervousin VJ(Specificproteins system physiological andbiochemicalofnervous aspects integration(1967，14:343―59 D。1 2。Morrison4-3,3:modulators 994;266:56― 57 ofsignalingproteins?Science(t al，Molecularofc1 NAC forbrain T,et 3(Ichimura’Elsobe’l;Okuyama Cloning oding 14―3―3 activator of and specific protein protein，a kinasedependenttyrosine tryptophan Acad。Sci JSA(1988，85:7084―88 hydroxylases(Proc(Nall 4(Finnie DB(1 C(Borch 4―3―3 with functions(Plant J,Collinge proteins many Mol Biol，l99900:545―54 5(LiS(Janosch M(etal kilmRe ofRaf-I the 14-3。3 P-’l'aI!ji Regulation activityby family J(1995，14:685―96 ofproteinsEMl30 6。Fu al Interactionofthe kinase It，XiaK、PallasDC，et Raf-1 with14(3―3 protein 36 安徽医科人学坝J二学位沦文 26―29 994，266:1 protein(Science，1 ofClinica J ofCJD:effect 7(BrandeI L，el JEDelasnerie LN(Laplancheal，Diagnosis incidence 095―9 criteriaOn estimates，Neurology(2000，54 5 :1 a1(Bt13 domainofBADis for 8(Zha K(et J,Harada required H。Osipov and J Biol heterodimerizationwith BCIrXl prowapoptoticactivity( 01―4 Chem、I997。272:241 a1(Nuclear ofcdc25is localization B(Mondesert GA，Fumari O，et regulatedby 9。Lopez DNA anda14-3―3 damage protein(Nature。t999，397:172―75 ofAlzhelmer’S J，Aitken A，eta1(Neurofibrillary 11(LayfieldR，Fergusson tangles diseasebrainscontain14―3―3 proteins(NeurosciLett(1996，209 1 :57-60 12(Mitsuko a1(14-3―3zetaisaneffectoroftau S，tlemantK，et H，Kazuya pmtein Biol