犬冠状病毒分子生物学研究

犬冠状病毒分子生物学研究 一 《中国养犬杂志~1996年(7卷)g4期 犬冠状病毒分子生物学研 犬冠状病毒纤突蛋白基因的初步研究 / 解放军农牧大学军事兽医研究所犬病研究中心I监皇生殷震 摘要拳研究根据Wesseling发表的犬 状病毒(CCV)K378抹纤突蛋白(s)基因 列,设计合成14条寡聚核苷酸引物P1 (18bp,1520—1537bp)P2(19bp,2O72— 2090bp)和P3(20bp,2621--2640bp)P4 (20bp,2944~2963bp).以P1,P2和P3P4 为引物,以姜ccVNL一18抹反转录产物 为模板,建立了ccVRT—PcR方法,并将 其中纯化的P3和P4PCR产物标记a一”P 同位素,制备1CCV特异核酸探针.以正常 CRFK细胞和CCVNL一18株反转录产物 为阴,阳对照,通过对犬瘟热,狂犬病,犬副流 感,犬传染性肝炎和犬细小病毒j种对照病 毒细胞培养物检测发现.分别以P1,P2和 P3P4为引物.只有CCVNL,一18株RT— PCR产物在电泳凝胶上可见到太小为57bp 和343bp的核酸片断,与设计大小相同,正 常如胞和对照病毒RT--PCR产物无核酸带 出现;核酸探针检测结果,只有CCVNL18 棘呈阳性,正常细胞和对照病毒均为阴性. RT—PCR和核酸探针对CCVNI18株反 转录产物的检出敏感度分别为10和】0/ u1.以P1,P2为引物对本室最近分离到的 CCVCS1,CCVHH1,CCV…一Cl1和 CCVYII四抹病毒的第7代cRFK细胞 培养物进行R’i’PCR扩增,2琼脂糖电 泳,均获得57lbp的核酸片段.继而经PVU lI酶切试验,CCVNL18株和CCVCS1 等口株病毒的RT--PCR产物均可切成418 和153bp两条核酸片段,与具有PVUII酶 切位点的CCV强毒K378抹相同,而不同于 无此酶切位点的CCV弱毒Insavc--1抹.用 CCV--CS1等四株病毒反转录产枷与核酸撂 针杂交,结果均为阳性.上述结果证明,这四 抹病毒均为CCV,而且在易变的s基因的 152o--2o9obp之间无基因缺失和插入现象. 通过本研究,不仅为CCV感染建立1敏感, 特异的诊断方法}而且通过对国内首次分离 获得的CCV--CS1等口抹CCV进行1初步 研究,同时也为正在进行的CCVS基因的克 隆,洲序和表达研究奠定1基础. 关键词犬1冠状病毒RT--PCR核 病毒与和蘸关,———磊_状病毒与和动勒晶莰箝看关, 除可引起人呼吸道感染和胃畅炎外..,还可 引起动物的胃肠炎呼吸道感染肝炎/脑炎 传染性腹膜炎和肾炎等疾病0.病毒结构与 基因直接关系到该病毒病的诊断与防治.所 以该疾病的研究,特别是冠状病毒分子生物 学研究日益受到医学,兽医学和分子生物学 界的广泛重视 犬冠状病毒(CCV)是引起犬,jI匠和貉急 性胃畅炎的主要病原之一,给养犬业和毛皮 动物饲养造成很大危害】.该病呈世界分 布l,我国亦有军警犬和民用犬发生该病的 报导j1,且有流行趋势. CCV为单链正fI殳RNA病毒,除多聚酶 区外,基因组长9.6kb.由】0个开放性阅读 框架(ORF)构成,共编码纤突蛋白(S),小膜 蛋白(SM),膜蛋白(M)和核蛋白(N)四种结 构蛋血清学和基因序列分析证明,cCV 与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV),猪呼吸道 冠状病毒(PRCV),猫肠炎冠状病毒(FEcV) 和描传染性腹膜炎病毒(FIPV)为同一抗原 ? 7? 究 . 《中国养犬杂志11996年(7卷)第4期 群. 冠状病毒s蛋白的功能是与细胞受体相 作用,引起细胞融合,刺激机体产生中和抗体 和细胞介导的细胞毒成份….通过McAb和 基因序列分析证明,FIPV起致病(A1,A2) 和诱生中和抗体作用的位点(A2),都在s蛋 白上(10);TGEV起以上作用的位点(A,B, c和D)也位于s蛋白上,且有一个位点(A) 与FIPV的A2位点重合(11).以上两种病 毒起致病和诱生中和抗体作用位点都在s基 因的近5端(134—1773bp).CCVS基因与 FIPV,TGEVS基因同源性很高0),且在 FIvP和TGEV起致病和诱生中和抗体作用 的相应片段也较保守.故开展CCV分子生 物学研究,应首选s基因.为此本试验以 CCVNL一18株为模板.在建立CCVRT— PCR和核酸探针诊断方法的基础上,对本室 最近分离到的四株CCV部分s基因进行了 初步研究,现将结果报告如下: 一 ,材料方法 l_病毒及来源 (1)CCV试验株为本室最近分离到的 四株CCV.CCV--CSI:分离于长春某犬场 犬脾脏;CCV—cI】:分离于长春某犬场犬肠 道}CCV--HH3:分离于黑龙江省某警犬基 地犬心脏;ccv—YI1:分离于延吉某犬场犬 肠道. (2)CCV参考株为从美国引进的CCV NL18株. (3)对照病毒犬细小病毒(C1V),犬瘟 热病毒(CDV),犬副流感病毒(CPIV),犬传 染性肝炎病毒(cAV)和狂犬病病毒(RV)均 为本塞保存. 2.细胞及来源CRFK,DK和Vero细 胞均啮自中国兽药监察所.分别用于培养 CCV,CPV,CDV,CIlV,CAV和RV. 3.l物的设计与合成根据文献(12) 所发表的CCVS基因序列,如附图设计并用 DNA合成仪(ABI公司381A型DNA台成 仪,美国)合成了如下2对引物: ? 8? P151520ACACATCGTA— CACTGACG15373 P252072CCAAT- GAGCAGGTTGTTAG20903 P352621TTAGCACCGG— TAATGTCACG26403 P452944GGTTCTTGGC TAGGAGGTTT29633 附图l引物设计及酶切位点图.每个长 方框代表1个ORF, P1-?P4为引物,数字为核苷酸位置,竖 箭头表示酶切位点. 4.RT—PcR方法的建立 (1)RNA的提取取以上各病毒接种的 48—72小时细胞培养物单层,弃去培养液. 用无菌PBS冲洗三次.按Chomczynski”所 述方法提取细胞总RNA. (2)反转录反应按文献…所述方法,采 用20ul反应体系.反转录试剂盒为Promega 公司产品.用于RT-PCR的模板,P4为 引物;用于棱酸杂交的模板,以01igo(dT)为 引物. (3)PCR系统组成和反应按文献”“昕 述方法.略加修改.采用50u1反应体系.PCR 试剂购于Promega公司除Taq酶外.各成 份混台后,】?C水措1O分钟.冰浴510分 钟,此时加入Taq酶1单位.置于PCR仪上 (PCT一100型,M.J.Research,inc.USA), 按96C变性50秒,54C退火1分钟.73c延 伸4O秒,35个循环进行扩增.然后以2琼 脂糖电泳鉴定,以PBR322DNA/BstNI(北 《中国养犬杂志M996年(7卷)第4期 京北方同正生物技术发展公司产品)为分子 量参照. (4)敏感性试验取10,100,1000和 10000倍稀释的CCVNL一18株反转录产物 各lul,分别进行PCR扩增比较 (5)特异性试验取ccVNL一18株, CDV,CAV,CPV,CIPV,RV和正常细胞反 转录产物各1U1分别进行PCR扩增分析. 5.核醢探针制备和杂交方法的建立 (1)PCR产物的纯化及酶切鉴定取 CCVNL一18株P3和P4PCR产物500u1 采用,,字形槽电泳法纯化(14).取纯化或不 纯化的PCR产物8ul,分别加入B缓冲液和 Hinfl酶(10u/u1Promega公司产品)各1U 1,37c感作1小时,2琼脂糖电泳鉴定. (2)核酸探针的标记及杂交方法取上 述纯化PCR产物按Promega公司核酸探 针标记DNA试剂盒说明书.制备a--32P同 位索(北京亚辉生物医学工程公司产品)标记 的CCV核酸探针.取待检材料Oligo(dT)反 转录产物1u1,点于NC膜(Promega公司产 品)上,按文献(】6)所述方法进行核酸杂交, 放射自显影. (3)敏感性试验取1O,1.O,1000和 10000倍稀释的CCVNL,18株反转录产物 各1U1,与核酸探针杂交试验 (4)特异性试验取CCVNL一18株和 正常细胞,以及对照病毒反转录产物各1 u1,与核酸探针杂交分析. 6.分离病毒S基因的初步研究 (1)核酸探针鉴定取CCVCS1等四 株病毒的反转录产物各1u1,与核酸探针杂 交 (2)RTPCR扩增及其产物鉴定取 CCV—CS]等四株病毒反转录产物各1U1 分别以P1和P2为引物,进行PCR扩增.取 上述各PCR产物和CCVNL一18株的I1, P2PCR产物各8U1,分别加入M缓冲液和 PVUI1酶(20u/u1北京北方同正物技术发 展公司产品)各1Ui混匀离心后,37c感作 1小时,继后以2琼脂糖电泳鉴定. 一 ,结果 1RT—PCR方法的建立结果 (1)PCR结果以CCVNL—l8株反转 录产物为模板.以P1,P2为引物,2琼脂糖 电泳,可见一条大小约571bp核酸带;以P3, P4为引物,可见一条大小约343bp核酸带. (2)敏感性试验结果以P1,P2为引物 1U1做10,100和1000倍稀释的CCvNL一 18株模板,均能扩增了出大小约571bp的核 酸片从而;以P3和P4为引物,1U1做10, 100,1000和1000倍稀释CCVNL一18株模 板,均能扩出大小约为343bp的核酸片段. (3)特异性试验结果以CCVNL一18 株为模板,以P1和P2为引物.可获得约 571bp的核酸片段;以P3和P4为引物.可获 得343bp的核酸片段.而以CDV,CAV, CPV,CPIV,Rv和正常细胞培养物为模板 均无核酸带出现 2械醢撂针杂交方法的建立结果 (1)PCR产物纯::和酶切鉴定结果2 琼脂糖凝胶上可见纯后化的PCR产物,只 有一条核酸带.而未纯化者除有一条带与纯 化的核酸带位置相同外(大约343bp).在其 前方还有呈拖尾状的核酸带.酶切产物在 2琼脂糖上可见2条带.大小约215和 12p,与文献报导相符(12) (2)敏感性试验结果当将CCVNL 18株反转录产物稀释10,1OO和1000倍各 取1U1均能见到杂交阳性斑点. (3)特异性试验结果只有CCVNl_-. 18株反转录产物为阳性,对照病毒和正常细 胞培养物反转录产物均为阴性. 3分离病毒s基田初步研究结果 (1)核酸探针鉴定结果CCV,CS1, CCVYll呈强阳性,CCV—HH1和 CCV-一CI1呈弱阳性. (2)RT,PCR扩增及其产物鉴定结果 CCV—CS1,CCV,CI1,CCV—YI1和 CCV--HH1四铢病毒PCR产物于2%琼脂 糖上均出现一条核酸带.大小约571bp.CCV NL一18株和以上各PCR产物经PVUH酶 .9. 《中国养犬杂志~1996年(7卷)第4期 切后.电泳凝腔中可见两条带.大小约为418 和153bp,与文献相符(12). 三,讨论 本研究根据CCVS基因序列设计合成 了4条寡聚核苷酸引物,以CCVNL一18株 反转录产物为模板,于国内首次建立了CCV RT—PCR诊断方法,并以此PCR产物制备 了核酸探针,建立了CCV核酸探针诊断方 法.并采用该两种方法对国内新近分离到的 CCV--CSI等四株病毒S基因进行了初步 研究. 试验结果表明本研究所建立的CCV RT—PCR技术检渊CCV敏感性高:50ul体 积1u11000至10000倍稀释的ccVNL一 18株模板,仍可获得阳性结果{特异性强:以 CCVNL一18株和CCV—CS1等四株病毒 为模板,均能扩增出大小和酶位点与预期结 果一致的核昔酸片断,而以CPV等对照病毒 和正常细胞为模板,在同一反应条件下均朱 扩增出特异性带}重复性好;以上各试验重复 三次以上,结果均相同.. 通过对CCVNL一18株,对照病毒和正 常细胞杂交试验症明,本研究所制备的核酸 探针检测CCV敏感性也较高:该探针与1u 11000倍稀释的CCVNL—l8株反应转录 产物杂交呈阳性;特异性强:只与CCVNL一 18株杂交呈阳性,而与对照病毒和正常细胞 杂交呈阴性该方法虽没有RT--PCR方法 敏感,但可同时检测多个样品.与RT--PCR 具有互补作用. 通过RT--PCR和核酸杂交试验,证明 本室所分离到的四株病毒均为CCV.同时扩 增出了相当于FIPV和TGEV起致病和诱 生中和性抗体作用的部分CCVS基因片段, 其大小与CCVK378和NL一18株相同,均 为571bp,且在S基因的1520--2090bp之间 无基因缺失和插入,四株所分离病毒的PVU H酶切试验结果与CCVNL--18株相同,也 切成418和153bp的两个片段,说明它们具 有相同的酶切位点,进一步证明为CCV.至 ?10? 于这四株分离病毒之间及与CCV参考株之 间是否存在差别,有待于进一步进行序列测 定和比较研究. (试验中得到本研究所李盒中,李红卫, 毛春生,刘维全博士和郭志儡,范志娶硕士的 协助,谨表谢意) 参考文献 1.侯云德分子病毒学学苑出版季L 394 (1990)381— 2.SusanRLab.Anim.Sci.(1993)43: 15—25 3.夏成柱养犬大全吉林人民出版社 (1993)561—564 4.TennantBJeta1.Vet.Rec.(1993) 132:7—11 5.周向阳黑龙江畜牧兽医(1996)6: 31—36 6.叶俊华中国兽医科技(1992)22(6): 15—16 7.张宏民中国畜禽传染病(1993)12: 36—37 8.Horsburgheta1.J,Gen.Viro1. (1992)75:2849--2862 9.Sanchezeta1.Virology(1990)174: 410—417 1..WayneYeta1.J.Viro1.(1995)69: 2858—2862 11.LuisEeta1.Vet.Micro.(1992)33: 249—262 12.WesselingGeta1.J.Gen.Viro1. (1994)75:1789—1794 13.Chomczynskieta1.Aha1.Biochem. (1989)l62:156一一159 14.卢圣栋现代分子生物学实验技术 高等教育出版社(1993)417 15.朱平PCR基因扩增实验操作手册 中国科技术出版社(1992)7—8 l6.J.萨姆布鲁克.E.F等全柬雁等译 分子克隆实验指南第二版科学出版社 (1995)569—570