茶多酚联合易瑞沙抗移植性人肺腺癌效应研究

茶多酚联合易瑞沙抗移植性人肺腺癌效应研究 茶多酚联合易瑞沙抗移植性人肺腺癌效应 研究 北京中医2007年1O月第26卷第1O期BeiiinzJournalofTCMOctober.2007.Vo1.26,No.10 茶多酚联合易瑞沙抗移植性人肺腺癌效应研究木 马成杰李元青刘朝阳孙颖立陈信义 【摘要】目的观察茶多酚联合表皮生长因子受体酪胺酸激酶抑制剂(易瑞沙)对人肺腺癌生长抑制作用,为进一步深入研 究茶多酚抗肿瘤血管生成机制提供依据.方法人源可移植性肺腺癌(A)细胞系经传代培养后,以BALB/c—nu裸鼠进行肿瘤移 植,并以茶多酚,表皮生长因子受体酪胺酸激酶抑制剂及其联合用药进行干预性治疗,通过观察抑瘤率评价单用及联合用药对 A移植瘤生长抑制作用.结果茶多酚,表皮生长因子受体酪胺酸激酶抑制剂及联合用药的抑瘤率分别为33%,34.1%和 57.1%.与模型组相比,有统计学意义(P<0.01);联合用药与单用药比较,具有统计学意义(P<0.05).结论茶多酚,表皮生长因 子受体酪胺酸激酶抑制剂对A生长有明显抑制作用,两者联合使用抑瘤效果更好. 【关键词】茶多酚;表皮生长因子受体酪胺酸激酶抑制剂(易瑞沙);人肺腺癌(A) 非小细胞肺癌(Non—SmallCellLungCancer, NSCLC)是临床最常见的恶性肿瘤,大多数患者在临 床诊断时已属于晚期.失去手术治疗机会l1I.而含铂 类药物联合化疗失败后则缺乏有效的治疗方 法.因此,寻找有效的治疗方法已成为NSCLC研究 的热点.易瑞沙为表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑 制剂,用于NSCLC治疗,疗效确切[21.茶多酚是研究 较为深入的天然药物.新近研究表明[3-5].茶多酚对 NSCLC生长也具有良好的抑制作用.我们推测.两 药联合使用可能会提高NSCLC临床疗效.为此.我 们进行了本次研究. 1材料 1.1动物与细胞系 BALB/C—nu裸鼠32只,6,8周龄,SPF级.雌 雄各半,由中国医学科学院肿瘤研究所肿瘤医院实 验动物室繁育并提供.动物生产合格证号:京动许 字(1999)第015号;动物合格证号:SCXK京2004— 0006.在动物实验中心屏蔽系统辅以洁净层流柜环 境中饲养.人肺腺癌(A)细胞系,由中国医学科学 院肿瘤研究所检测中心常规保存并提供. 1.2药物 茶多酚系江西绿康天然产物有限责任公司惠 赠,纯度98%;易瑞沙为AstraZeneca公司生产,进 口药品注册证号:H20040767,产品批号:228185. 1.3仪器 超净工作台系苏州宏瑞净化科技有限公司生产 (型号SCW—CJ);实验用离心机系江苏恒瑞制药机 械有限公司生产(型号LS150);倒置显微镜系日本 国家自然科学基金课资助.编号:30472280 作者单位:1.100700.北京中医药大学东直门医院肿瘤血液科 2.100021.中国医学科学院肿瘤研究所 NIKON株式会社生产(型号TS100);游标卡尺系中 国杭州工具量具有限公司生产(型号HGL一18—1); 奥豪斯电子精密天平系美国OHAUS公司产品(型 号ARA520);Forma恒温培养箱为美国Forma公司 产品(型号3l11). 2方法 2.1细胞培养与接种 A细胞系用含10%小牛血清的DMEM培养 液培养,细胞长满单层后用0.25%胰蛋白酶消化,培 养液吹打,离心,收集细胞用PSB稀释,浓度调至1× 10m1个细胞/.每只小鼠以0.2ml接种于右腋皮 下,待肿瘤长至体积约为1000mm时移植. 2.2造模及分组 选择生长良好,瘤结无破溃的荷瘤裸鼠,拉断颈 椎处死,在净化工作台内,无菌条件下完整剥离瘤 结,用生理盐水洗去血渍,剪开瘤结,清除中心坏死 组织,充分匀浆制备瘤细胞悬液,加生理盐水稀释细 胞数至1x107/ml.每只取0.2ml,接种于裸鼠右腋窝 皮下,接种在30min内完成.10天后肿瘤体积约在 100,300mm之间(32只裸鼠造模全部成功)时.根 据性别分层,按肿瘤体积大小随机分为模型对照组, 茶多酚组,易瑞沙组,茶多酚加易瑞沙组4组.每组 8只.称体重标号. 2.3给药剂量与方法 给药剂量均采用人与动物剂量换算法确定.?模 型对照组:生理盐水每天0.2ml/10g灌胃.?茶多 酚干预组:茶多酚按每天l12.5mg/kg(成人治疗量 每天900mg/70kg换算)给药.生理盐水配制浓度为 5.625mg/ml,每天0.2ml/10g灌胃.?易瑞沙干预 组:易瑞沙按64mg/kg/d(成人治疗量500mg/70 E京中医2Oo7年1O月第26卷第1O期 Beiiin~JournalofTCM,October.2O07.V01.26,No.10 kg?d换算)给药.生理盐水配制成浓度为3.2mg/ ml,每天灌胃0.2ml/10g.?茶多酚加易瑞沙组:两 药的给药剂量与单用药组相同.为保证灌胃体积的 一 致性.茶多酚配制浓度为11.25mg/ml,易瑞沙配 制浓度为6.4mg/ml,每天各0.1ml/10g灌胃.分组 当天开始给药,每天1次.连续14天. 2.4计算方法 药物处理前,后每4天用毫米游标卡尺测量肿 瘤长,宽最大垂直直径.按如下公式计算肿瘤体积: 肿瘤体积(mm)=肿瘤长径×肿瘤短径2/2.用药结束 后两天处死裸鼠.取出肿瘤.称重.按如下公式计算 肿瘤抑制率:抑瘤率(%)=(对照组平均瘤重一治疗组 平均瘤重)/对照组平均瘤重~100%. 2.5统计方法 采用SPSS13.0统计软件进行数据处理.干预 治疗前后小鼠体重以及肿瘤积以x+s表示,并采用t 检验,组间比较采用F检验,当P<0.05时被认为有 统计学意义;肿瘤抑制率以百分率表示. 3结果 3.1一般性观察 实验前各组裸鼠一般状况良好.实验结束时 32只裸鼠全部存活.动态观察发现,模型对照组裸 鼠觅食,饮水正常,但活动减少,反应较迟钝;3个 治疗组裸鼠觅食,饮水,活动等状况良好;易瑞沙组 与联合用药组裸鼠有轻度腹泻,未见消瘦,瘀血等 异常现象. 3.2肿瘤体积变化 从分组用药开始到实验结束,移植瘤体积变化 见表1. 从表1中可见.从第4天开始,3个治疗组肿瘤 体积与模型组相比,有统计学意义(P<0.01);联合用 药组肿瘤体积增长较慢;实验结束时,联合用药组瘤 体偏小,与单独用药组相比,有统计学意义(P<0.05). 3.3肿瘤抑制率 茶多酚与易瑞沙单独使用时抑瘤率分别为33.0% 和34.2%,与模型组相比,有统计学意义(P<0.01);茶 多酚与易瑞沙联合使用时抑瘤率达57.1%,与单独用 药相比,有统计学意义(P<0.05),见表2. 表2实验各组肿瘤重量及抑瘤率(?s) 与模型组比P<O.O1;?与联合用药组比P<O.O5 4讨论 t~/J,细胞肺癌属常见高发恶性肿瘤,对放,化疗 敏感性较差,但其瘤体血管丰富,抑制其血管生成疗 效显着.是目前研究的重点.我们的前期研究表明, 茶多酚对移植性S踟及乳腺癌EMT6小鼠肿瘤均有 明显抑制作用;检测肿瘤组织MVD,TIMP一2, VEGF发现.茶多酚可以通过下调VEGF,上调 TIMP一2的表达.抑制肿瘤微血管的生成,降低肿瘤 微血管密度[81.有研究表明,易瑞沙的抗肿瘤效应是 通过下调肿瘤细胞对VEGF及bFGF的表达,影响 内皮细胞的增殖,减少肿瘤细胞的血供来实现的[91. 我们推测.茶多酚与易瑞沙可能在抑制肿瘤血管生 成方面有协同作用. 本实验结果表明,单独使用茶多酚,易瑞沙对人 肺腺癌A移植瘤抑制作用明显,两者的抑瘤效果 相近,两者联合使用时抑瘤效果明显增强.除了易瑞 沙干预组与联合用药组裸鼠进食量偏少,有轻度腹 泻外.3个治疗组未见其他不良反应,说明茶多酚, 易瑞沙及两者联合治疗NSCLC不良反应较轻,抑瘤 效果较好.特别是联合用药的抑瘤效果与单独用药 相比增效明显.为未来临床两药的联合使用,增强疗 效奠定了一定的基础. 在下一步的研究工作中,我们将从抗血管生成 的角度来探讨茶多酚,易瑞沙及两者联合用药对非 表1实验各组肿瘤体积的动态变化(?s) }与模型组比P<O.01:?与联合用药组比P<O.O5 北京中医2o07年l0月第26卷第l0期Beiiin~J0UlTlalofTcM,October,2007.!.2. 小细胞肺癌的抑制作用.并以易瑞沙抗血管生成密 切相关的信号传导通路作为研究重点,进一步阐明 茶多酚抗肿瘤血管生成的分子机制,为茶多酚用于 肿瘤临床提供理论依据. 参考文献 1KosmidisP.ChemotherapyinNSCLC:histrocialreview,LungCan— cel",2002,38(13):19—22. 2RansonM.ZD1893:Formorethanjustnon-smallcelllungcancer. TheOncologist,2002,7(14):16—24. 3FujimotoN,SueokaN,SueokaE,eta1.Lungcancerprevention withepigallocatechingallateusingmonitoringbyheterogeneous nuclearrib0nucle0pr0teinB1.IntJOncol,2002,20(6):1233— 1239. 4朱晔涵,徐春明,胡华成,等.表没食子儿茶索没食子酸酯对人肺 腺癌移植瘤模型作用的实验研究.苏州大学(医学版 2005,25(6). 5谢冰芬.刘宗潮,郝东磊,等.茶多酚细胞毒作用和抗瘤作用的研 究.癌症,1998,17(6):418—420,427. 6徐力,侯丽,刘杰,等.茶多酚对移植性S小鼠肿瘤模型抑瘤率 的影响.中华中医药杂志.2005,20(12):718—720. 7张燕明.徐力,陈信义.茶多酚抗移植性乳腺癌作用的研究.国 际中医中药杂志,2006,28(11):354—356. 8徐力,李冬云,侯丽,等.茶多酚干预移植性S小鼠肿瘤血管相 关因子表达.中国肿瘤,2006,15(6):363—365. 9CiardielloF,CaputoR,BiancoR,eta1.Inhibitionofgrowthfactor productionandangiogenesisinhumancancercellsbyZD1839 (Iressa),aselectiveepidermalgrowthfactorreceptortyrosineki— naseinhibitor.ClinCancerRes,2001.7f51:1459. (收稿日期:2007—08—02) (上接第674页) 织胺作用.能改善血管壁通透性,降低局部组织的炎 症反应.动物试验结果也证实,本方能增加胸腺重 量,增强腹腔巨噬细胞吞噬功能.促进淋巴细胞转 化.具有提高机体免疫功能的作用. 由此可见.龙胆泻肝汤f丸)所以能广泛运用于临 床,与该方能增加机体抗组织胺能力及提高机体免 疫能力密切相关.由于这种机理,可以解释该方能够 很好地治疗许多过敏性,病毒性皮肤病. 近年来,由于药物的不规范应用,使"龙胆泻肝 丸"的肾毒性在社会上引起强烈反响,使国内学者纷 纷建议停止此类药物的使用.笔者认为,此乃因噎废 食,断送了龙胆泻肝汤的命运实为可惜.龙胆泻肝汤 (丸)的毒性主要是由于现代所用的关木通所致,因 关木通含有马兜铃酸,故过量或滥用可致肾损害. 有报道称,人单次服用关木通0.5g/kg即可出 现明显的肾功能不全等副作用,甚至引起死亡?.因 此我们考虑应用功效相当的替代品代替关木通,以 起到减毒不减效或减毒增效的作用.或者证实关木 通在本处方中具有其他药物不可代替的作用.我们 挑选了药效近似的通草和淡竹叶作为替代品.初步 实验.龙胆泻肝汤原方去木通组在抑制DNFB 诱发的皮炎方面作用明显优于对照组.而原方组未 见明显差异.说明木通在本方中至少没有起很重要 的作用.况且方中佐药共有6味.是否木通的作用可 忽略,值得探讨. 实验还证明.在降低血管通透性方面.D组即龙 胆泻肝汤原方去木通加通草和淡竹叶组明显优于对 照组.说明用通草和淡竹叶代替木通不仅可以起到 木通所起的作用.而且可以超过它.至于各组问均未 见用药前后的血常规和肝肾功能的影响,可能与用 药剂量规范和时问短有关.本实验提示,木通作为佐 药在整个方剂中未起主导作用.通草,淡竹叶可以代 替木通,更理想的方剂有待深入实验.龙胆泻肝汤的 肾毒性和服药时间及剂量之间的相关性也有待进一 步实验探索. 关于其毒性问题,近来学者报道,龙胆泻肝汤对 大鼠肾功能有一定损伤,但不及发生在人类那样严 重.这可能与种属差异有关.这可能与该实验比我们 喂养的时间长,有一定关系.此外,还有人通过实验 提出,该方出现肾毒不一定仅因关木通所致,是否除 关木通以外的其他成分也起了作用『3],这些对我们进 一 步认识该方有很好的提示.因本实验是初步研究. 且采用短期,规范剂量应用,今后还有待于在提高生 药浓度,延长用药时间等方面进一步研究. 参考文献 1刘金渊.大量服用关木通致急性肾功能衰竭死亡1例.中国中 药杂志,1994,19(11):692. 2方青,詹小萍,莫剑翎.龙胆泻肝汤对大鼠肾毒性的实验研究. 中国中药杂志,2004,29(8):785—788. 3范述刚,阮时实,吴符火.新,旧龙胆泻肝汤的毒理学实验比较研 究.光明中医,2005,20(6):42—44 (收稿日期:2007—06—10)