胸椎黄韧带骨化中相关生长因子

胸椎黄韧带骨化中相关生长因子 表达的实验研究 一、项目摘要 胸椎黄韧带骨化(OTLF) 导致的椎管狭窄常引起脊髓压迫受损，其发病的严重程度和发展速度均较其他类型的椎管狭窄严重，表现出一系列的神经功能障碍。该项目用组织化学方法，对OTLF组患者与正常人的胸椎黄韧带中弹力纤维、胶原纤维形态变化进行对比观察;用免疫组织化学方法对OTLF组患者与正常人胸椎黄韧带中转化生长因子β(TGFβ1)抗体和?型胶原蛋白(Collagen Type?)抗体的表达进1 行初步研究;用逆转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)方法检测骨形态发生蛋白(BMP)-2 mRNA抗体在OTLF组患者与正常人胸椎黄韧带中的表达，研究OTLF的病因，为OTLF的及时诊断、治疗与预防提供科学依据。 二、项目提出的目的、意义 OTLF是一种特殊类型的异位骨化形式，多发生于下胸椎和胸腰段脊柱，由此导致的椎管狭窄常引起脊髓压迫受损，表现出一系列的神经功能障碍，其发病的严重程度和发展速度均较其他类型的椎管狭窄严重，骨化韧带的切除减压效果不十分理想，至今尚无有效的药物阻止其骨化的进展。黄韧带骨化(OLF)所造成的椎管狭窄是近年来研究较多的椎管内韧带病变。目前普遍认为腰椎管狭窄症中黄韧带增生、肥 1 厚是一种退行性变。相对于腰椎和颈椎来讲，胸椎管狭窄的发生率比较低，国内自八十年代开始渐有报道，英文文献仅有一些个案报道和小样本报道。在引起胸椎管狭窄的各种原因中，OLF是比较常见的。而OTLF的病因目前尚不清楚。OLF是由Le Doubl于1912年首先发现并描述的， OTLF是Polgar于1920年在侧位片上首先发现的。以后Schmorl 、Shore 、Oppenheimer 、山口、小泉等陆续有，自70年代后期，日本学者对此进行了大量而深入的研究，认为此病多发生在东方人种，其发生率在日本报道最高达到34%。且被认为是一种独立疾病。而胥少汀则将此症称为胸椎管狭窄症。OLF发病机制的研究尽管国内、外文献报道较多，但目前仍不清楚，因而尚无预防可言。研究表明，诊断延误与术式选择不当及手术操作不是造成患者术后功能恢复差的重要原因。因此，如何通过其病因学研究，及早发现OTLF的高危人群，及时诊断、治疗与预防，是目前对OTLF研究的关键。但目前我国仍没有对该类疾病的诊断与治疗的系统介绍。基于此，本课题想在基础研究上为OTLF的高危人群提供早期诊断和预防的理论依据。 三、国内外发展概况 在异位骨化中，能够引起细胞增殖、分化与基质合成的生长因子起重要作用。转化生长因子β(TGFβs)是生长因子(GF)家族中的一个重要成员，是一族有多种功能的蛋白多 2 肽，广泛存在于动物正常组织细胞以及转化细胞中，具有促进细胞增殖、调节细胞分化、促进细胞外基质合成以及免疫调节作用。目前已鉴定出5种异构体，即TGFβ，其中TGF1-~5β存在于人体内，而TGFβ在体细胞中所占比例最高1-~31 (>90%)，活性最强，成为研究热点。TGFβ既能刺激细胞外1 基质的合成，又能抑制细胞外基质的降解，还能增加血管的生成。骨形态发生蛋白(BMP)是一类巯水性酸性蛋白，目前已鉴定出16种(BMP)，除BMP-1外按其氨基酸序列的1-16 相似又归属于TGFβs超家族。BMP的主要生物学作用是诱导未分化的间充质细胞分化形成软骨和骨组织，是唯一能够诱导异位成骨的生长因子。内源性的BMP主要来源于间充质细胞分泌，同时，其靶细胞也有合成和分泌BMP的能力。已知TGF-β在OLF的发病机制中起关键作用，黄韧带在骨化过程1 )的大量增多。但中出现了?型胶原蛋白(Collagen Type? TGF-β和BMP在OTLF黄韧带中的表达和作用还不清楚。大1 量生长因子决定着软骨和骨组织的发生、发展和维持，其中BMP和TGFβ在黄韧带骨化的发病机制中起关键作用。在黄1 韧带骨化的形成过程中，BMP能启动软骨和骨的分化及诱导体内形成新的软骨及骨组织;TGFβ则通过刺激体内软骨祖1 细胞和骨祖细胞的增殖分化来加速软骨和骨的形成。然而，目前尚未见有在分子水平关于GF与OTLF关系的报道。 目前用于检测OLF的手段主要是X线片、CT、MRI相结 3 合，费用昂贵，对人体有放射线损伤，如果通过血液检查相应抗体指标，就能明确诊断OTLF或为OTLF的高危人群，那么此项成果如果应用于临床将为OTLF的诊断及预防提供极大的方便。 1(OTLF临床表现特点 由于OLF对脊髓的压迫是一相当缓慢的过程,加之受压部位、压迫程度以及脊髓圆锥的高低等因素的影响,故对每一位患者来讲,临床表现并不完全一致,有时单靠临床表现定位亦十分困难，发病部位主要在下胸椎与胸腰段,其临床特点是:(1)症状表现多样化。除有些患者有腰背痛病史外,最主要的是多样化的下肢表现,为上行性发展的麻木、无力,步态不稳、烧灼痛、放射痛、间歇性跛行以及大、小便功能障碍等。(2)典型的上位运动神经元损伤表现。肌张力增高,腱反射亢进,出现下肢病理反射阴性,大、小便功能障碍,感觉平面一般定位明确,这类患者定位诊断比较容易。(3)脊髓圆锥部位的损伤表现。由于发病部位在胸腰段,所以很容易压迫脊髓圆锥以及腰膨大,同时亦使位于此平面的马尾神经受压,出现脊髓圆锥与马尾神经的共同损伤的表现。(4)上、下位运动神经同时受损的不典型表现。表现为肌张力、肌力、腱反射其中一项或两项异常。(5)突发截瘫并非少见。这种突发截瘫往往因某种因素所诱发,诱因主要是扭伤、劳累与受凉、脊髓造影等。(6)起病隐匿,进展缓慢。病程越短,瘫 4 痪程度越轻,反之则加重。 2. 影像学检查 影像学检查对于确定OTLF的范围和程度非常重要，是指导手术治疗的重要临床指标。 X线平片是OTLF的基本诊断方法，以侧位片最容易发现OTLF，主要位于椎间孔的后缘，由于肩部的遮挡及普通X片的局限性，上胸椎的OTLF 及较轻的OTLF则不能通过侧位片来观察，明确诊断仍需行CT或/和MRI检查。 CT扫描可清楚显示OTLF的形态、程度及脊髓和神经根受压情况,并可进行椎管矢状径,横径和横截面积狭窄率的测量。对手术每一节段减压范围和判断操作难点有指导意义。CT不能作矢状面扫描是其不足之处, 已对脊髓形成压迫,但骨化程度轻微或尚未骨化者显示不满意,需行MRI检查。 在MRI的矢状面图像上增生肥厚OTLF呈中等强度与松质骨相近信号突向椎管对脊髓形成压迹。骨化从椎管后壁向前突入容易确认,能准确确定脊髓在矢状面上的受压节段和范围。但对OTLF表层坚质骨部分显示不满意(低信号),对外侧型的确认也较困难,在横断面图像上MRI显示OTLF不及CT清晰,但可排除其它原因引起的脊髓压迫症,如后纵韧带骨化、椎间盘突出、肿瘤等。MRI能够完整的显示OTLF范围,对鉴别诊断,手术设计都有重要价值。 5 OTLF在我国是发病较高的疾病,应予高度重视。诊断该病时,应把临床检查和影像学检查结合进行。影像学检查中X线平片是很好的初始诊断方法。为了准确详尽确定黄韧带骨化的形态、程度、类型和范围,可以选行MRI检查，确定部位后再行CT检查。 四、主要攻关内容及技术路线(技术可行性分析) 该项目用组织化学方法，对OTLF组患者与正常人的胸椎黄韧带中弹力纤维、胶原纤维形态变化进行对比观察;用免疫组织化学方法对OTLF组患者与正常人胸椎黄韧带中TGFβ和1Collagen Type?的表达进行初步研究;用逆转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)方法检测BMP-2 mRNA在OTLF组患者与正常人胸椎黄韧带中的表达。目前国内外尚未有过类似从普通HE染色切片、特殊染色切片、免疫组化方法及分子水平来探讨、研究OTLF的病因的报道。 1.标本来源与病例选择 所有黄韧带组织均取自胸椎或胸腰段行后路全椎板切除减压手术患者，全部黄韧带标本均取自中央部分(椎板间部)全层，不包括骨附着部。OTLF组(病变黄韧带组织取自OTLF患者):30例，年龄42-65岁，平均53岁;其中男22例，女8例。均经临床、X线、CT、MRI等资料确诊为OTLF，以下胸椎为多。术中取材见黄韧带肥厚、骨化呈大理石样改变。对照组(正常黄韧带组织取自外伤致胸段或胸腰段椎体骨折 6 患者):25例，年龄18-35岁，平均28岁;其中男19例，女6例。术前常规行 X线、CT、MRI等检查，未见黄韧带肥厚或骨化。 2.主要仪器及试剂 2.1病理组织学 (1) Leica2235石蜡组织切片机; (2) IMN-6801漂烘处理仪; (3) Olympus光学显微镜; (4) TGF-β1抗体(兔抗，购自美国Zymed公司); (5) Masson三色改良法染色试剂(购自天津市久圣医疗电子仪器有限公司); (6) 弹力纤维改良法染色试剂(购自天津市久圣医疗电子仪器有限公司); (7) Collagen type ?抗体(兔抗，购自美国Zymed公司); (8) PV9000免疫组化试剂盒(购自美国Zymed公司); (9) DAB显色试剂盒(购自北京中杉生物技术公司)。 2.2分子生物学 (1) 总RNA提取试剂Trizol(购自 Invitrogen USA); (2) Oligod(T) 、dNTP(购自上海生工生物有限公司); 18 (3) MMLV逆转录酶(购自Promega公司); (4) TaqDNA聚合酶(购自北京鼎国生物公司); (5) 低温高速离心机(Beckman GS-15R型离心机); 7 (6) PCR仪为英国Techgene公司产品; (7) 日本岛津UV-240型分光光度计。 3.方法 3.1取材、固定及切片 将切取下的黄韧带组织分成二部分，修成5×5mm大小。一部分黄韧带组织立刻放入10,福尔马林溶液中固定，进行梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋，石蜡切片机连续切片，厚度5μm，所有玻片均为防脱片处理的氨基玻片。切片置60?烤箱内4小时，另一部分黄韧带组织立刻放入液氮盒中，送中心实验室超低温冰箱保存(待标本组织例数达标后，集中应用RT-PCR方法检测BMP-2mRNA的表达)。 3.2苏木素-伊红(HE)常规染色，Masson和弹力纤维特殊染色 3.2.1 HE染色 (1) 将石蜡切片入二甲苯?中15分钟; (2) 二甲苯?15分钟; (3) 无水酒精?10分钟; (4) 无水酒精?10分钟; (5) 95,酒精10分钟; (6) 80,酒精10分钟; (7) 流动的自来水冲洗5分钟; (8) 过蒸馏水; 8 (9) 苏木素染液5分钟; (10) 流动的自来水5分钟; (11) 0.5,盐酸酒精溶液分化数秒钟; (12) 流动的自来水2分钟; (13) 0.5,淡氨水30秒; (14) 流动的自来水5分钟; (15) 镜检细胞核着色满意后入蒸馏水数秒钟; (16) 0.5,伊红水溶液1分钟; (17) 将切片过蒸馏水; (18) 80,酒精30秒钟; (19) 95,酒精30秒钟; (20) 无水酒精?5分钟; (21) 无水酒精?5分钟; (22) 二甲苯?10分钟; (23) 二甲苯?10分钟; (24) 中性树胶封片。 3.2.2Masson三色改良法染色 (1) 切片脱蜡至蒸馏水; (2) 苏木素10分钟; (3) 自来水洗; (4) 1,盐酸酒精分化; (5) 自来水洗至切片变蓝; 9 (6) 丽春红酸性品红液染5分钟; (7) 0.2%冰醋酸速洗; (8) 1,磷钼酸水溶液作用5分钟; (9) 倾去磷钼酸，用2,亮绿液染3-5分钟; (10) 0.2,冰醋酸冲洗，亮绿液全部洗掉为止; (11) 95,酒精5分钟; (12) 无水酒精5分钟; (13) 二甲苯?5分钟; (14) 二甲苯?5分钟; (15) 中性树胶封片。 3.2.3弹力纤维改良间苯二酚-碱性品红染色法 (1) 切片脱蜡至蒸馏水; (2) 0.25,高锰酸钾氧化10分钟; (3) 0.5,草酸漂白为止; (4) 蒸馏水洗后95,酒精洗片刻; (5) 室温下染Weigert液14小时; (6) 1,盐酸酒精分化镜检; (7) 充分水洗，蒸馏水洗; (8) 对比染色，选用中性红染色5分钟; (9) 脱水、透明、封片。 3.3免疫组化染色检测TGF-β1及 Collagen type ? 将烘烤后的两组石蜡切片分别行以下步骤: 10 (1) 二甲苯?20分; (2) 二甲苯?20分; (3) 无水酒精?10分; (4) 无水酒精?10分; (5) 甲醇过氧化氢酶30分; (6) 95,酒精10分; (7) 80,酒精10分; (8) 流水冲洗10分; (9) 蒸馏水速洗; (10) 微波修复抗原(Ph6.0枸橼酸盐缓冲液)91,96? 20分，恢复室温后将切片过蒸馏水; (11) Tris缓冲液洗涤5分×2次，10,羊血清封闭30 分; (12) Tris缓冲液洗涤5分×2次。甩去羊血清后各滴加 collagen Type?抗体和TGF-β1抗体，4?冰箱过夜; (13) 次日恢复室温30分; (14) Tris缓冲液洗涤5分×2次; (15) 滴加Polymer helper(既用型)试剂孵育30分; (16) Tris缓冲液5分×2次; (17) 滴加Polyperoxidase-anti-mouse/rabbit IgG(既 用型)试剂孵育30分; (18) Tris缓冲液5分×2次; 11 (19) DAB显色10分，镜下观察控制显色; (20) 蒸馏水速洗; (21) 苏木素4分; (22) 流水冲洗5分; (23) 盐酸酒精分色5秒; (24) 流水冲洗1分; (25) 淡氨水还原5秒; (26) 流水冲洗1分; (27) 80,酒精10分; (28) 95,酒精10分; (29) 无水酒精?10分; (30) 无水酒精?10分; (31) 二甲苯?10分; (32) 二甲苯?10分; (33) 中性树胶封片。 3.4 PCR半定量检测BMP-2mRNA的表达 3.4.1 RNA提取 3.4.1.1 RNA提取准备 所有用于提取RNA的塑料离心管和吸头、镊子等用1‰ DEPC处理后高压，玻璃器皿180:C干烤6h以去除RNA酶。 所有RNA提取和电泳溶液配制使用1‰DEPC水。 3.4.1.2Trizol法提取RNA步骤: 12 (1) 200毫克韧带组织中加1毫升Trizol。 (2) 冰浴中匀浆1分钟。 (3) 加200μl 氯仿，vortex (剧烈震动混匀)，室温3分 钟。 (4) 12000×g，4?，20分钟。 (5) 上清转至新管中，记体积。 (6) 加入等量的异丙醇(异丙醇-20?保存)。 (7) -20?沉淀2小时。 (8) 12000×g，4?，20分钟。 (9) 弃上清。 (10) -20?保存的70%酒精洗一次沉淀。 (11) 12000×g，4?，10分钟。 (12) 弃上清，室温让酒精挥发。 (13) 加适量DEPC水溶RNA。 (14) 取4 μl 在260 nm，280nm下测吸光度，估计RNA 的浓度和纯度。 3.4.1.3RNA电泳(甲醛变性电泳) (1)4.5μlRNA+10μl甲酰胺 (变性) +3.5μl甲醛(维 持变性)+2.0μl 5，mops buffer。 (2)65:C水浴变性15分钟。 (3)取出样本迅速加入冰浴中(防止变性)，样本中加入1 μlEB，2μl loading buffer(溴酚兰，甘油)，短暂离心混 13 匀。加样至1%变性琼脂糖凝胶，75v电压下电泳0.5小时， 紫外灯下观察结果。 3.4.2逆转录(RT)-PCR半定量检测BMP-2 mRNA的表达 3.4.2.1扩增人GAPDH和BMP-2引物序列 (1)GAPDH : 扩增片段长度600bp 上游: 5,-CCA CCC ATG GCA AAT TCC ATG GCA-3,(24b) 下游:5,-TCT AGA CGG CGA GTC AGG TCC ACG-3,(24b) (2)BMP-2 扩增片段长度456bp 上游:5’-CCA ACC ATG GAT TCG TGG TG-3’ 下游:5’-GGT ACA GCA TCG AGA TAG CA-3’ 3.4.2.2. 逆转录 RT体系: 总RNA 2.0μg Oligo d(T)(0.5μg/μl) 0.5μl 18 70? 5min 0? dNTP (10mm) 2.0μl 5，RT buffer 4.0μl RNasin 0.5μl M-MLV RT(200u/μl Promega) 1.0μl DEPC HO 10.0μl 2 共 20.0μl 14 42? 60min。 cDNA保存于-20?。 3.4.2.3 RT-PCR RT-PCR体系如下: 10，PCR buffer 2.5μl 上游primer (12.5μm) 2.0μl(终浓度 1μm) 上游primer (12.5μm) 2.0μl(终浓度1μm) dNTP (2.5mm) 2.0μl (0.2mM) Taq酶 (2u/μl) 0.5μl(1u) cDNA 2.0μl ddHO 14.0μl 2 共25.0μl PCR循环参数: 94:C 5min 94:C 30s 72:C 7min 共30个循环 60:C 1 min 72:C 1min 3.4.2.4 PCR产物5μl在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，紫 外灯下观察并拍照。用Quantity One软件扫描条带的灰度 相对表达量。 值，计算BMP-2 mRNA的 3.5显微镜观察、分析 15 用Olympus光学显微镜两人盲法观察二组常规HE染色切片、胶原纤维及弹力纤维特殊染色切片、TGF-β及 Collagen 1 type ?免疫组化染色切片，将各组切片置于相同强度光线下用低倍镜(×100)和高倍镜(×400)观察。胶原纤维及弹力纤维特殊染色切片、Collagen type ?免疫组化染色切片在高倍(×400)显微镜下随机选取视野(每张切片选取6个视野)，通过摄像机(JVC TK-C1381)摄取图像，保存。利用图像分析系统，设定测量参数后，测定各种染色切片阳性细胞所占面积百分比，对图像进行“全屏分割”并进行“自动测量”、记录。TGF-β1免疫组化染色切片在高倍(×400)显微镜下随机选取视野(每张切片选取6个视野)，以细胞浆和细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性表达的判定标准，计算各个标本每个视野中阳性细胞个数。 3.6统计方法 计算胶原纤维、弹力纤维、Collagen type ?每张染色切片(六个视野)阳性细胞表达所占面积百分比的均数为每 ,例标本阳性细胞表达所占面积百分比，数据用s (%)表示;, TGF-β1每张染色切片(6个视野)阳性细胞表达的个数的均 ,数为每例标本阳性细胞表达的个数，数据用s (个)表示。, 应用SPSS11.0版统计软件进行统计分析，检查方差齐性与否，行两样本均数t 或t’检验。BMP-2mRNA用Quantity One 软件扫描所得各OTLF组条带的灰度与各对照组灰度的比值， 16 表示骨化组织中BMP-2mRNA的表达强度，数据用s (比),,表示，各组内取均值代表该组表达程度。应用SPSS11.0版统计软件进行统计分析，检查方差齐性与否，行两样本均数t或t’ 检验。 3(7 预期结果 各项生长因子在实验数据中表达阳性，有统计学意义。表明这些生长因子异常是OTLF的病因，如通过血液学检查这些相关生长因子并能明确到具体数值，则能作到对OTLF的早期筛查，从而起到预防作用。 五、申请人基础条件(包括主要研究成果) 课题负责人毕业于天津医科大学临床硕士班，在学期间对本课题的普通HE染色、特殊染色、免疫组化等已完成前期基础工作，并撰写毕业论文获得通过，在此基础上从分子生物学角度探讨OTLF病因为本课题的升华。所需组织标本在天津医院中心实验室低温冰箱保存，并能协助完成RT-PCR实验，中心实验室有RT-PCR实验经验和技术的指导教师，并拥有先进的仪器，包括BeckmanGS-15R型离心机、TechgenePCR仪、UV-240 型分光光度计。实验结果及知识产权归课题负责单位。 葫芦岛市中心医院基础设施雄厚，技术力量与实验设备齐全。 六、进度安排和实施方案(包括运行机制) 17 2004.1,2005.3 完成标本收集及预实验(已完成)。 2005.3,2005.6 完成普通HE染色、特殊染色、免疫组化实验并对结果进行分析，统计学处理，得出结论(已完成)。 2005.10,2006.7查阅有关资料及文献，掌握近年来国内外有关方面的信息，进一步完善实验方法。完成论文综述的撰写。 2006.10 进行预实验。 2006.11,2007.5实验实施阶段，总结实验数据，对结果进行分析，统计学处理，撰写及相关论文。 七、经济及社会效益分析 该课题从普通HE染色切片、特殊染色切片、免疫组化方法、分子生物学角度探讨、研究胸椎黄韧带骨化的病因，设计新颖、前沿，对胸椎黄韧带的预防有现实意义，对临床实践有指导意义。如果这些实验结果应用于临床，就能及早发现OTLF的高危人群，及时诊断、治疗与预防。 八、 经费概算及来源 总投入:15万元，申请科三费8万元，自筹7万元。 申请科三费资金使用明细 1.文献检索、复印费:5000 元 2.试剂费用: 40000元 3.租用试验仪器费用:20000元 18 4.差旅费: 5000元 5.科研成果鉴定费:10000元 共计:80000元 19